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方法論記事

分子および計算研究のためのツールとしてのマウス乳腺腫瘍からの癌関連線維芽細胞

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DOI:

10.3791/68364

⸱

2025年7月3日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biotechnology and Health Science, University of Torino, 2Human Technopole, 3Department of Science and Technological Innovation, University of Piemonte Orientale

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルでは、 in vitro/in vivo 機能アッセイ、トランスクリプトミクス、計算解析など、マウスCAFの培養、操作、分析の方法を概説しています。さらに、ヒト乳がん腫瘍のコレクションからレーザーキャプチャーマイクロ解剖された間質および上皮成分の公開トランスクリプトームを分析するために開発されたWebベースのプラットフォームについて説明しています。

要約

説得力のある一連の研究により、乳がん(BC)の成長と侵攻性における腫瘍微小環境(TME)の重要な役割が確認されています。TMEの主要な細胞成分であるがん関連線維芽細胞(CAF)は、腫瘍由来の活性化シグナルに応答して、がん細胞や他の間質細胞との複雑なクロストークを通じて、その挙動に大きな影響を与えます。マウスモデルは、内因性TMEの評価や、同系異種移植片研究を用いた免疫系の関与の評価を可能にするため、BC進行におけるCAFの役割の根底にあるメカニズムを調査するために広く使用されています。ここでは、BC由来CAFの培養、遺伝子発現の操作、および in vitro および in vivo アプローチの両方を使用して腫瘍形成促進機能を評価するための一連の方法を紹介します。また、CAF遺伝子発現プロファイリングとトランスクリプトーム解析のプロトコル、および公開されているバルクRNA-seqデータを使用して原発腫瘍の転写シグネチャを推測するための計算手順についても説明します。さらに、レーザーキャプチャーで微小解剖されたBC腫瘍からの間質成分と上皮成分のトランスクリプトームを分析するためのユーザーフレンドリーなWebベースのツールを紹介します。最終的に、これらの方法は、CAFと腫瘍の相互作用を促進する分子メカニズムに関する貴重な洞察を提供し、新しい治療標的を特定する可能性を秘めています。

概要

乳がん(BC)は、女性に罹患する最も一般的な悪性腫瘍であり、診断、治療決定、および予後を導く明確な分子プロファイルを持つ、有意な分子不均一性を特徴としています。腫瘍微小環境(TME)も非常に不均一であり、腫瘍の進行、免疫、および治療結果に重要な役割を果たします。

がん関連線維芽細胞(CAF)は、TMEで最も多く存在する細胞タイプであり、腫瘍発生の主要な調節因子です。それらは、細胞外マトリックスの沈着とリモデリング、血管新生、免疫回避、および薬剤耐性1,2,3,4,5,6に寄与します。CAFは、細胞間直接の細胞間接触、細胞外小胞の放出7、および腫瘍の成長、浸潤、および治療抵抗性8,9,10を促進するためのさまざまな可溶性因子の分泌を通じて腫瘍細胞に影響を与える。実際、間質関連遺伝子シグネチャーは、BCの進行および治療反応について予測値を有し、化学療法に対する耐性と関連している11,12,13,14。しかし、CAFが魅力的な治療標的であることを示唆する実質的な証拠があるにもかかわらず、これらの細胞を標的とした臨床試験は大部分が失敗に終わっています15。大きな課題の1つは、CAFが腫瘍の挙動を調節する分子メカニズムの理解が限られていることです。シングルセルおよび空間的トランスクリプトーム解析における最近の進歩は、BCにおけるCAFの複雑さについてより深い洞察を提供し、特定の機能プログラム16,22を持つ異なるCAFサブタイプの同定を可能にし、さらにその複雑さと可塑性23を強調している。

遺伝子改変マウスモデル(GEMM)は、がん遺伝子または腫瘍抑制遺伝子が過剰発現または不活性化されるモデルであり、ヒトのがんを研究するための確立されたモデルである24,25,26,27。野生型マウス23,28の腫瘍細胞の移植を含む同系モデルと比較して、GEMMはBCの多段階進行およびがん細胞とTMEとの間の相互作用をより正確に模倣する。しかし、GEMMにおけるCAFの活性を操作することは、その不均一性のために困難であり、他の間質または上皮成分に対するオフターゲット効果なしにすべてのCAFサブタイプを標的とすることは困難である5。GEMMをin vitro CAFマニピュレーションなどの補完的なアプローチと組み合わせることで、in vitroおよびin vivo環境の両方で機能喪失実験のための細胞モデルを生成することができます。しかし、老化が急速に始まるため、特定の遺伝子の機能的役割を探求するための安定した細胞モデルの開発は依然として困難です。

ここでは、CAFにおける安定した機能喪失実験のための堅牢なプラットフォームについて説明し、その後、改変された細胞の機能 的in vitro および in vivo 分析と転写プロファイリングを行います。このアプローチは、乳がんにおけるCAF発現遺伝子の機能的関連性を解剖するための包括的な戦略を提供し、既存の方法よりも特異性、再現性、適応性に利点があります。このアプローチは、ヒト乳房腫瘍からのレーザー捕捉マイクロディスセッション間質および上皮コンパートメントのトランスクリプトームを探索するための新しいウェブベースのツールによっても補完され、種間比較を可能にし、ヒトデータからの仮説生成を容易にします。

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プロトコル

この研究は、マウスの取り扱いと組織サンプリングに関するすべての機関ガイドラインに準拠しています。すべての手続きは、国内および国際的な法律および方針に従って行われました。マウスを、湿度50%、22°C、12時間の明暗サイクルで特異的な病原体を含まないトランスジェニックユニットに収容し、餌 と水を自由に提供しました。外科的処置は、処置中および術後の両方で適切な麻酔と鎮痛を確保するために、施設の獣医の指示に従う必要があります。 材料表 には、このプロトコールで使用される材料、試薬、および機器の詳細が記載されています。

1. 細胞培養

  1. DMEM(HEK293T、CAF、および不死化CAF(iCAFs))またはRPMI培地(4T1)で、相対湿度95%の5%CO2 雰囲気で37°Cで細胞を培養し、100 U/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシン(1% Pen/Strepto)を添加します。
    注:完全なメディア(cDMEM、cRPMI)組成:10%熱不活性化FBS、飢餓メディア(sDMEM、sRPMI)組成:FBSなし。細胞の平均倍加時間:HEK293TおよびiCAFは24時間です。4T1細胞は12時間です。
  2. 80%のコンフルエントに達したとき、1:5以下の比率で、以下に説明するように、表現型のドリフトを避けるために解凍後10回を超えない細胞を継代する。
    1. 培地を吸引し、100mmの皿の側面に7mLのPBSを静かに加えます。PBSを吸引し、トリプシン-EDTA1mLを追加します。37°Cで2〜3分間インキュベートします。
      注意:EDTAは、眼刺激性のカテゴリー2の危険化合物としてリストされています。適切なPPEを着用して、生物学的/ヒュームフードで取り扱ってください。
    2. 5 mLのcDMEMでトリプシン-EDTAを不活性化し、ピペッティングで上下させて細胞を分離し、円錐形の15 mLチューブに収集します。290 x g で5分間遠心分離します。
    3. 上清を慎重に取り除き、細胞ペレットを5 mLのcDMEMに再懸濁します。1:5分割するには、9 mLのcDMEMを含む100 mmのディッシュに1 mLの再懸濁細胞を播種します。
  3. 細胞計数:ステップ1.2.3の細胞懸濁液10μLをノイバウアー計数チャンバーの側面にロードし、大きな正方形の細胞をカウントし、得られた数に1 x 104 を掛けて、1 mLの細胞懸濁液に含まれる細胞の数を計算します。
  4. 凍結保存:100 mmディッシュ(約3 x 106 細胞)の50%を、以下に説明するように、0.5 mLの氷冷凍結培地(熱不活化FBS中の10% DMSO)で凍結します。
    1. 100 mmの皿から、ステップ1.2.1および1.2.2で説明したように細胞をトリプシンしますが、細胞を1 mLの氷冷凍結培地に再懸濁します。
    2. 各クライオバイアルに0.5 mLを分注し、約1 °C/分の冷却速度を確保するための容器に-80°Cで入れます。各アリコートは100mmの皿で解凍できます。
  5. マイコプラズマ汚染試験:少なくとも3日間培養したコンフルエント細胞の増殖培地1mLを回収します。95°Cで20分間煮沸します。16200 x g で室温(RT)で5分間遠心します。45 μLのPCR反応ミックス(0.15 mM dNTPs、1.5 mM MgCl2、1x Reaction Buffer、1 U Taq polymerase、0.5 μM Primers AおよびB、 表1参照)に5 μLの上清を添加します。ポジティブコントロールとネガティブコントロールを含むPCRを行い、1%アガロースゲル上でPCR産物をDNAラダーと共に分離します。マイコプラズマで汚染されたサンプルは、600 bpのバンドを示します。

2. CAFの乳腺腫瘍からの分離

注:このステップは、直径5〜10 mmの進行期の腫瘍に最適化されています(参考文献29 を参照)。

  1. 頸部脱臼によってマウスを犠牲にします。少なくとも125 mm3の乳腺腫瘍を分離します。腫瘍を慎重に切除し、周囲の皮膚、乳腺組織、および目に見える壊死領域を取り除きます。ピンセットを使用して、氷の上に置いた1.5mLのマイクロチューブに収集します。
  2. 精密な天秤で腫瘍を秤量し、メスで0.1〜0.3gの立方体を切除し、氷冷PBSで満たされた新しい1.5mLマイクロチューブに移し、氷上に保ちます。脱水症状を避けるために、組織が沈んでいることを確認してください。
  3. 氷の上で直径60mmの皿に移します。メスで1mLのPBSを細かく刻み、約1〜2mmの小片が得られるまで煮ます。
  4. cDMEMの腫瘍0.1 gあたり5 mLと10 μg/mLコラゲナーゼを含む15 mLコニカルチューブに移します。細胞の損傷を避けるために、先端がカットされたP1000ピペットを使用して、同じ培地1mLで皿をすすぎます。漏れを防ぐために、キャップをシーリングフィルムで固定します。
  5. オービタルシェーカーで37°Cで1時間水平にインキュベートします。50 mLのコニカルチューブの上に70 μmのセルストレーナーを置き、10 mLの血清ピペットでホモジネートを移します。5 mLシリンジプランジャーの背面を使用して、サンプルを粉砕し、フィルターに押し込みます。
  6. cDMEM(最終容量が30 mLを超えない)を使用して、ストレーナからすべてを回収します。細胞を129 x g 、4°Cで10分間スピンし、上清を捨てます。
  7. 3 mLのアンモニウム-塩化-カリウム(ACK)溶解バッファーを加えて、赤血球(RBC)を除去します。チューブをしっかりと閉じ、反転させて混合します。軌道シェーカー上でRTで5分間インキュベートします。
  8. RBC溶解を停止し、PBSを最終容量30 mLに添加します。細胞を129 x g 、4°Cで10分間スピンし、上清を捨てます。
  9. 細胞ペレットを1 mLのcDMEMに再懸濁し、ステップ1.3のように10 μLのメチレンブルーを使用して生細胞をカウントします。生細胞は色素を無色生成物に還元して染色しなくなりますが、死んだ細胞は青色に染色されます。
  10. 5 × 105 細胞/60 mmディッシュを5 mLのcDMEMに播種し、5% CO2 雰囲気で37°Cで20分間インキュベートし、非接着性細胞を回収し、一晩再播種します。
  11. 48時間または72時間後、示差トリプシン化を行います。線維芽細胞は上皮細胞および筋上皮細胞30よりも速く剥離するので、ステップ1.2で説明したように進行する。しかし、顕微鏡下で細胞の剥離を綿密に監視します。線維芽細胞の形をした細胞は丸くなって剥離しますが、上皮細胞は付着したままです。
  12. cDMEMを添加してトリプシンを不活性化し、分離したCAFを回収し、5mLのcDMEMで新しい60mmディッシュに移します。3つのパッセージの一次CAF1:3(ステップ1.2を参照)を通過させ、ステップ1.4で説明したように早期のパッセージ凍結アリコートを準備します。

3. ウイルス形質導入による不死化

注:以下の手順の一部は、レトロウイルスベクターの取り扱いに適した環境(BSL2+など)で実行する必要があります。あなたの機関のルールを確認してください。

  1. 組換えウイルスの調製
    1. 細胞HEK293Tを培養し、マイコプラズマ汚染がないか確認します(ステップ1を参照)。
    2. 直径100 mmのディッシュに、0.1 mg/mLのポリ-L-リジン溶液(ddH2O)を6 mLを室温で5分間ピペッティングしてコーティングし、吸引し、ボンネットの下で乾燥させます(約10分)。
    3. ステップ3.1.2のポリ-L-リジンコーティングディッシュ中の10mLのcDMEMに3 x 106 HEK293T細胞 (低継代、マイコプラズマ陰性)を播種します(ステップ1.3を参照)。
    4. 翌日、0.75 mLの抗生物質フリートランスフェクション最適化培地を含む2本のチューブを調製します。そのうちの1つに、30μLのカチオン脂質媒介トランスフェクション試薬(T1)を加えます。2 番目の 1 つに、2 μg の pCL-Ampho (レトロウイルスパッケージングベクター) と 2 μg のレトロウイルス pBABE-neo largeT cDNA ベクター (T2) を追加します。T2をT1に加え、穏やかに混合し、10分間インキュベートします。
    5. 培地を抗生物質を含まないトランスフェクション最適化培地 + 10% 熱不活化 FBS に置き換えた後、培地を細胞全体に均一に分配します。プレートをバイオセーフティーレベル2+(BSL-2+)の組織培養施設に移します。6〜12時間後に培地をcDMEMに交換し、細胞を24〜48時間インキュベートします。
    6. 偽ウイルス粒子を含む培地を0.45 μmシリンジフィルターでろ過し、4°Cで数日間、または-80°Cで長期保存します。
  2. CAFのウイルス形質導入
    1. 2つの60 mmディッシュのそれぞれに7.5 x 105 CAFを4 mLのcDMEMに播種し(ステップ1.3を参照)、ステップ1.1と同様に培養します。
    2. 翌日、1つのディッシュの培地をステップ3.1.6の偽ウイルス含有培地2 mL(形質導入CAF)と交換し、2 mLのcDMEMを加えて24時間インキュベートします。もう一方の皿はそのままにしておきます(形質転換されていないCAF)。
    3. 翌日、形質導入したCAFでステップ3.2.2を繰り返します。24時間後、両方の皿の培地を4 mLのcDMEMと交換します。.
    4. さらに24時間後、両方の皿の培地を400μg/mL G418を補充したcDMEMに交換して選択を開始します。G418含有培地を2〜3日ごとに交換し、未導入のCAFのコントロールディッシュに生細胞が残らなくなるまで。
      注:形質導入されていない細胞はG418に感受性であり、7〜10日以内に死滅するため、形質導入されたCAFの状態で生き残ったのはG418耐性の形質導入細胞のみであることを示しています。最適な抗生物質濃度は、細胞タイプごとに決定する必要があり、死滅曲線(50〜1000μg/mLのG418濃度の範囲を7〜10日間試験し、10日以内にすべての細胞を死滅させる用量を選択します)。
    5. 選択した形質導入細胞を1:3の比率で2倍(ステップ1.2を参照)通過させてから、BSL施設を出ます。ステップ1.4のように、初期のパッセージの凍結保存されたアリコートを調製します。
    6. 細胞が数回の継代で老化表現型を示さずに増殖し続けることを確認し、表現型および機能的特性評価に進みます(ステップ4および6-9を参照)。

4. 表現型の特徴付け

注: アルファ平滑筋アクチン (α-SMA)、カベオリン、線維芽細胞活性化タンパク質 (FAP)、N-カドヘリン、血小板由来成長因子ベータ (PDGFR-β)、S100A4、ビメンチン29 などの CAF マーカーは、RT-qPCR およびウェスタン ブロットで評価できます。

  1. RT-qPCR:参考文献15に記載されているフェノールとグアニジンイソチオシアネートの単相溶液で全RNAを抽出します。20 μLの容量で2 μgの全RNAを、反応条件に関する製造元の指示に従って逆転写します。cDNAを1:20に希釈し、3 μLを使用して、製造元の指示に従ってRT-qPCR反応を行います(プライマーについては表1を参照)。
    注:RNAは12ウェル皿から調製することをお勧めします。
  2. ウェスタンブロット
    1. ステップ1.2.1で説明したようにPBSで2回洗浄し、氷冷溶解バッファー0.2 mLを加え、スクレーパーで細胞を剥離し、29で説明したように1.5 mLのマイクロチューブに回収します。氷の上で20分間放置します。
    2. サンプルを16,000 x g で4°Cで10分間遠心し、上清を回収します。メーカーの指示に従って比色アッセイによりタンパク質を定量します。ウェスタンブロットには、少なくとも20 μgのタンパク質を使用してください(抗体については 表2 を参照)。
      注:皿の中の6つ以上のウェルからタンパク質を調製することをお勧めします。
  3. 分泌タンパク質の解析
    1. 直径100 mmのディッシュに2 x 10 6 iCAF(ステップ1.3を参照)を10 mLのcDMEMで播種し、ステップ1.1の説明に従って培養します。
    2. 24時間後、培地を取り出し、10 mLのPBSで2回洗浄し、10 mLのsDMEMで48時間インキュベート(ステップ1.1を参照)して、コンディショニング培地(CM)を生成します。
    3. さらに48時間後、0.2 μmシリンジフィルターでCMをろ過し、15 mLのコニカルチューブに入れます。シリンジとチューブの両方をしっかりと保持し、ある程度の抵抗に備えてください。CMは-80°Cで最大6ヶ月間保存できます。
    4. 製造元の指示に従ってタンパク質濃縮器を使用してCMを約10倍濃縮し、濃縮CM(conCM)を生成します。conCMを定量し、沸騰させ、ウェスタンブロットを行います(抗体については 表2 を参照)。

5. 遺伝子ノックダウン解析

注:遺伝子発現を安定的に妨害するために、特別に設計されたshRNAを発現するレンチウイルス粒子でiCAFを形質導入します。これらは、https://www.addgene.org/protocols/plko/#C で利用可能なプロトコルに従って、pLKO.1-Puroなどの適切なレンチウイルスベクターでターゲティング配列をクローニングすることによって取得できます。特定の標的配列は、一般に公開されているshRNA設計ツール(すなわち、Broad Institute、https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/ によるGPP-Genetic Perturbation Portal)を使用して選択できます。あるいは、あらかじめ調製されたターゲティングベクターのセットが市販されています(https://en.vectorbuilder.com/products-services/service/shrna-knockdown-solutions.html、https://www.sigmaaldrich.com/IT/it/technical-documents/technical-article/genomics/gene-expression-and-silencing/mission-shrna-getting-started、https://www.origene.com/products/rnai/shrna-lentiviral-particles)。各遺伝子に対して4〜5種類のshRNAを設計し、実験に最適な2つを選択することをお勧めします。また、非ターゲティングベクトルをネガティブコントロールとして生成します。以下の手順の一部は、HIV誘導体ウイルス(BSL2+など)の取り扱いに適した環境で実行する必要があります。あなたの機関のルールを確認してください。

  1. レンチウイルス粒子の生成
    1. 3 x 106 HEK293T セルをステップ 3.1.1-3.1.3 のようにシードします。翌日、ステップ 3.1.4 と同様に、パッケージングベクター pCMV-R8.74 および pCMV-VSVG をそれぞれ 9 μg および 3 μg ずつ、shRNA 含有 pLKO.1 コンストラクト 7 μg を 0.75 mL の抗生物質フリートランスフェクション最適化培地に使用して、カチオン脂質媒介トランスフェクション試薬-DNA 複合体を調製し、ステップ 3.1.5 および 3.1.6 の説明に従って進めます。
  2. CAF形質導入
    1. ステップ3.2.1、3.2.2、および3.2.4で説明されているように細胞を感染させます。24時間後、感染培地を取り出し、cDMEM中の2μg/mLピューロマイシンで選択を開始します。最適な濃度を決定するためのステップ3.2.5の注を参照してください。
    2. 48時間後にピューロマイシン/cDMEMを交換してください。選考は通常3日で完了します。ステップ3.2.6のようにセルを展開して凍結します。ステップ4.1で説明したように、RT-PCRとウェスタンブロットの両方によってノックダウン効率を評価します。および 4.2.

6. 腫瘍細胞からのCMによるiCAFの超活性化

注:次の手順は、iCAFの腫瘍促進活性の in vitro 特性評価の方法を示しています。CAFの腫瘍誘発性活性は、以下に説明するように、マウスBC腫瘍細胞由来のCMとCAFをインキュベート(スーパー活性化、s.a.)することにより増強することができる。

  1. ステップ1.3で説明したように4T1マウスBC細胞をカウントし、直径100 mmのディッシュに2 x 106 細胞を10 mLのcRPMIで播種します(ステップ1.1を参照)。
  2. 24時間後、培地を取り出し、10 mLのPBSで2回洗浄し、10 mLのsRPMIで48時間インキュベート(ステップ1.1を参照)してCMを生成します。
  3. 翌日、直径100 mmの皿に2 x 106 iCAFを10 mLのcDMEM(ステップ1.3を参照)に播種し、ステップ1.1で説明したように培養します。ステップ4.3.3のように、0.2 μmシリンジフィルターを介してCMを15 mLのコニカルチューブにろ過します。
  4. スーパーアクティベーション(s.a.):iCAF皿から培地を取り出し、10 mLのPBSで2回洗浄し、ろ過した4T1 CM(8-10 mL)を加えます。48時間インキュベートして、s.a. iCAFを取得します。

7. 腫瘍細胞の増殖

  1. ステップ4.3.1、4.3.2、4.3.3のように調製したiCAFs CMで48時間4T1細胞を前処理します。
  2. トリプシン処理してカウントし、ステップ1.3で説明したように、96ウェルプレートの4 x 103 細胞/ウェルを100 μLのcRPMIに播種し、ステップ1.1で培地を培養します。プレートテクニカルトリプリケート。
    1. 96ウェルプレートはタイムコースの1日につき1枚ご用意ください。ここで提案されている細胞の数は、4日間のプロトコルに最適化されています。より長い時間のためにスケールダウンします。
  3. 4時間後、または細胞が付着したらすぐに培地を取り出し、100μLを穏やかに添加してPBSで洗浄し、先端をウェルの端に当てて細胞が剥がれないように注意し、マルチチャンネルピペットで滅菌リザーバーを使用します。PBSを除去し、同様に100μLのsDMEM(コントロール)またはiCAF CMを加え、どちらも2%の熱不活化FBSを添加します(ステップ4.3.1、4.3.2、4.3.3を参照)。
  4. 4時間後、ポイント7.5から説明したように、0日目のプレートを停止します。その他の時点については、実験が終了するまで1日おきに培地を交換してください。
  5. 細胞密度を評価するには、インキュベーターから96ウェルプレートを取り出し、ステップ7.3で説明したように、ウェルを100 μLのPBSで2回洗浄します。
  6. ドラフトの下に、各ウェルに100 μLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)を加え、細胞を室温で10分間固定します。
    注意: PFAは、深刻な眼の損傷や皮膚の炎症を引き起こす可能性があります。飲み込んで吸い込むと有害であり、遺伝的欠陥や癌を引き起こす疑いがあります。適切な個人用保護具(PPE)を着用してドラフトで取り扱ってください。
  7. ステップ7.3と同様に、100μLのPBSで3回洗浄し、ドラフトの下で乾燥させます(約10分)。
  8. 50 μL の 0.1% クリスタルバイオレットと 20% メタノール溶液で RT で 10 分間インキュベートします。
    注意:クリスタルバイオレットは深刻な眼の損傷を引き起こす可能性があり、経口急性毒性のカテゴリー4の危険性および発がん性物質のカテゴリー2の危険性として報告されています。.適切なPPEを着用してヒュームフードで取り扱ってください。
  9. 100 μL の ddH2O で 3 回洗浄し、ウェルを空にし、プレートを吸収パッドまたはペーパータオルで軽くたたいて液体を完全に取り除きます。
  10. 10% 酢酸 100 μL に RT で 15 分間 Crystal violet を溶解し、100 μL の 10% 酢酸をブランクとして使用して、マイクロプレートリーダーで 600 nm 波長の光学濃度 (O.D.) を測定します。その日のO.D.を条件ごとに0に正規化します。

8. 移住と侵略

  1. 1%熱不活化FBS、1%ペン/ストレプトを添加した700μLのDMEMを24ウェルプレートのウェルにピペットで入れます。生物学的に活性なマトリックスでコーティングされた(浸潤)またはコーティングされていない(移動)8μmの細孔トランズウェルインサートを各ウェルに配置します。プレートをインキュベーターに放置し、ステップ1.3と同様に4T1細胞を採取してカウントしながら、37°Cで平衡化します。
  2. ステップ 4.3.1、4.3.2、および 4.3.3 のように、直径 100 mm のディッシュから iCAFs CM で 48 時間前処理した 4T1 細胞を、トリプシン EDTA の代わりに 1 mL の 5 mM EDTA を使用して分離します。
  3. 5 mLのcDMEMを添加し、15 mLのコニカルチューブで細胞を回収し、ステップ1.2のように遠心分離してペレット化します。細胞をsDMEMに再懸濁し、ステップ1.3と同様にカウントし、1 x 105 細胞/100 μLに希釈します。
  4. 細胞懸濁液100 μLをトランズウェルの上部チャンバーに加えます。プレーティングコントロールとして、24ウェルプレートに100 μLの細胞を500 μLのcDMEMで播種します。16時間(移動)または24時間(浸潤)インキュベートし、後述の方法で実験を停止します。
    注:異なる細胞を使用する場合、インキュベーション時間は経験的に決定する必要があります。
  5. インサートの上面に細いマーカーでラベルを付け、ピンセットを使用して洗浄するためにPBSを充填した50mLの円錐形チューブに浸します。トランズウェルの内部を綿棒で丁寧に清掃します。
  6. ドラフトの下で、サンプルを4% PFAの700 μLで室温で10分間インキュベートします(ステップ7.6を参照)。
  7. 700μLのPBSで3回洗浄し、ボンネットの下で乾かします(約10分)。インサートを0.1%クリスタルバイオレット700 μLの20%メタノール溶液で室温で10分間インキュベートします(ステップ6.10を参照)。
  8. インサートを3回洗浄し、ピンセットを使用してddH2Oを充填した50 mLのコニカルチューブにインサートを浸します。トランズウェルの内部を綿棒で丁寧に清掃します。RTでサンプルを保管し、最大3日後に写真を撮ります。
  9. 位相差顕微鏡を使用して、ウェル表面の大部分を10倍対物レンズで撮影し、次に20倍対物レンズで5つの独立した領域から画像を取得します。
  10. 次のように、クリスタルバイオレットを10%酢酸に溶解します:ウェルの場合は、100μLの酢酸を加え、オービタルシェーカーでRTで10分間混合します。トランズウェルの場合は、下面を上にしてベンチに置き、表面に50μLの酢酸を堆積させ、Crystal Violetが完全に溶解するまでピペッティングで混合します。
  11. 上記のステップで溶解した材料50μLを使用して、96ウェルプレートで600nmの吸光度を読み取ります。ブランクとして10%酢酸を使用してください。
  12. ステップ8.5からめっき制御の光学濃度(O.D.)を正規化し、制御条件に対する移動または侵入を表します。

9. 原発腫瘍の増殖と肺転移の形成

注:次のステップは、CAFの腫瘍誘発性活性の in vivo 特性評価の方法を示しています。このステップは、同系マウスモデルでの同時注入により、CAFの in vivo 腫瘍形成促進性の特徴を評価するために最適化されています。CAF細胞と4T1細胞はどちらもBALB/cマウスのバックグラウンドに由来するため、BALB/cマウスを使用します。

  1. 注射の2日前に、金属製のIDイヤータグを装着した6週齢の雌BALB/cマウスを剃り、シェーバーで第4乳腺領域を剃ります。
  2. ステップ6で説明したように調製した4T1細胞とs.a. iCAFを採取し、カウントします。15 mLのコニカルチューブに、1 x 105 4T1細胞と3 x 105 s.a. iCAFs/マウスを少なくとも20%過剰に混合します。4T1 はコントロールとしてのみ使用してください。
  3. 290 x g で5分間遠心分離し、計算したPBSの容量に再懸濁して、上記の細胞数/マウスを50 μLで得た後、1.5 mLのマイクロチューブに移し、氷上に保持します。
    注:例えば、10匹のマウスを注入するには、1.2 x 106 4T1細胞を3.6 x 106 s.a. iCAFs、ペレット細胞と混合し、600 μLのPBSに再懸濁します。マウスあたり50μLの細胞懸濁液を注入します。
  4. 層流フードの表面を清掃および消毒して、作業エリアを準備します。フォーム手術用ボードをベンチプロテクターシートで覆います。
  5. 施設の手順に従って、マウスを一度に 1 匹ずつ麻酔します (チレタミン ベース/ゾラゼパム ベース + キシラジン 70 mg/kg + 5 mg/kg の腹腔内注射を使用します)。乾燥を防ぐために目に獣医軟膏を塗ります。綿の先端を使用して、ポビドンヨード溶液で皮膚を消毒します。
  6. つま先のピンチテストを使用して、マウスが適切な麻酔下にあることを確認します。皮下注射針を使用して、50μLの細胞懸濁液を4番目の 乳房脂肪パッドに注入します。乳首を基準にして、同側の脚に向かって約3mm注入します。
  7. 注射後数時間と翌日にマウスを検査します。腫瘍は4日後に触知可能になります。
  8. キャリパーで48時間ごとに腫瘍サイズを測定し、最大直径と最小直径を決定します。(長さx幅2)/ 2の式を使用して腫瘍体積を計算します。
  9. 注射の10日後、以下に説明するように原発腫瘍を外科的に切除します。
    1. ステップ9.5のように手術領域を準備します。オートクレーブ滅菌により器具を滅菌し、作業中に滅菌面に置きます。ホットビーズ滅菌器を使用して動物間のツールを滅菌します。
    2. ステップ9.6および9.7のようにマウスに麻酔をかけます。メスの刃を使用して、腫瘍の近くに5〜8 mmの切開を行い、皮膚をそっと引き離して、腫瘍にアクセスするための小さなポケットを作成します。解剖時の出血を避けるために、低温焼灼ペンで目に見える血管を焼灼します。
    3. メスを使って腫瘍を取り除き、皮膚を取り除かないようにします。皮膚フラップを元の位置に戻し、5-0外科用糸と17mm1/2c針で縫合し、外科用接着剤を追加して傷を完全に密閉します。
    4. マウスが胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、マウスを放置しないでください。手術を受けた動物は、完全に回復するまで他の動物の会社に戻されません。
  10. 手術後および手術後の数日間は、施設のプロトコルに従って、必要に応じて鎮痛治療を施すことで、動物を注意深く観察してください。カルプロフェン(3-5mg/kg)の皮下注射を使用します。
  11. ステップ2.2のように精密天びんを使用して腫瘍を計量します。メスを使用して腫瘍を半分に切片にします。1.5 mLのマイクロチューブに半分を入れ、液体窒素で急速冷凍し、分子分析のために-80°Cで保存します。残りの半分を円錐形の15 mLチューブ内の4% PFAの5 mLに5 mLで固定し、組織学的分析のために4°Cで24時間。
  12. 注射後21日目に、CO2 曝露によってマウスを犠牲にし、以下に説明するように4%PFAの気管内注入時に肺を採取します。.ヒュームフードの下で作業します。
    1. 手術用ハサミを使用して胸腔を開きます。顎下領域と唾液腺から皮膚を取り除き、気管をはっきりと露出させます。
    2. 4% PFA 溶液を含む 22G ニードルシリンジを準備します。針をマウスの気管に挿入し、気管を頭に向けて固定しながら、針を肺に向けます。肺が腫れるまで溶液を注入します(約2mL)。
    3. 肺を解剖し、4% PFA溶液を含む15 mLチューブに入れます。チューブを数回静かに反転させ、4°Cで24時間固定します。
  13. 参考文献31に記載されているように、肺のセミシリアル切片を作成し、ヘマトキシリンとエオシン(H&E)で50/100μmごとに1スライスずつ染色します(参考文献31を参照)。
  14. H&E染色切片の顕微鏡写真のソフトウェアガイド付き分析で転移をスコアリングします。

10. 遺伝子発現シグネチャー

  1. 以下で説明するように、遺伝子シグネチャを定義します。
    1. 実験環境や調査する特定の生物学的問題に応じて、いくつかの方法で遺伝子シグネチャーを取得します。最も一般的には、2つの疾患(CAFと正常な対応物、またはいくつかの方法(例えば、超活性化またはサイレンシング)で治療された状態と未治療の状態)との間の差次的発現を評価することです。
    2. あるいは、分析したサンプル全体で最も発現が変動する遺伝子または情報量の多い遺伝子を特定します(たとえば、主成分分析の最初の成分に高い分散を持つ遺伝子や負荷の高い遺伝子)。ここでは、例としてSTAT3で規制された署名を使用します。このシグネチャーは、以下に説明するように、BCCAFs 29のSTAT3サイレンシングによりダウンレギュレーションされる遺伝子として定義されました。RNAシーケンシングの詳細な説明については、参考文献32,33を参照してください。
  2. ステップ 4.1.1 のように、各サンプルからトータル RNA をテクニカルトリプリケートで抽出し、RNA の品質を評価して RNA の完全性を確認します (RIN ≥ 9)。
  3. 2 μgのポリ(A)選択RNAからライブラリを調製し、シーケンシングします。NextSeq 500プラットフォームを使用しました。
  4. TopHat v2.0 を使用して Mus musculus mm9 参照アセンブリに読み取りをマップします。1034。
  5. HTSeq パッケージ (http://www.huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html) の htseq-count ツールを使用して遺伝子数を計算します。
  6. R と DESeq2 パッケージ (http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/DESeq2.html) を使用して差次的発現解析を実行します。FDR < 0.05でダウンレギュレーションされた遺伝子をフィルタリングし、STAT3シグネチャーを定義します。

11. 原発腫瘍におけるシグネチャーの発現の推定

注:次の手順では、BC原発腫瘍の公開されているトランスクリプトームデータ全体でSTAT3制御シグネチャ29 の発現を計算的に推定する手順を説明し、同じサンプルセットの推定間質比率との関係をテストします。

  1. R (https://cran.r-project.org/) と RStudio (https://posit.co/products/open-source/rstudio/) をインストールします。それを起動し、必要なライブラリをインストールします:GSVA35、TCGAbiolinks36。
  2. https://portal.gdc.cancer.gov/ のTCGAデータ、http://synapse.org/ のMETABRICデータ(syn1757063)、Gene Expression Omnibus(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)のその他のトランスクリプトームデータなどの原発腫瘍遺伝子発現データを、事前に正規化した発現マトリックスとしてダウンロードします。データは、行を遺伝子、列をサンプルとする数値行列として書式設定し、プラットフォームに応じて正規化し、オフセット 1 を使用して対数スケーリングする必要があります。
    1. https://www.ensembl.org/biomart/martview/ のBiomartからマウスヒト遺伝子オルソログのリストをダウンロードし、データベースensembl genesを選択し、ヒト遺伝子データセットを選択し、左側のタブで属性選択をクリックします。
    2. 事前に選択したフィーチャーから、EXTERNALタブを開き、HGNCシンボルにフラグを立て、ページ上部のボックスで Homologues を選択し、Mouse orthologues / Mouse gene nameにフラグを立てます。
    3. 左上隅にある[ 結果 ]ボタンをクリックし、CSV形式を選択して、[ GO ]ボタンをクリックしてファイルをダウンロードします。
  3. 遺伝子発現シグネチャー(遺伝子のセット)をRにロードします。この場合、マウスCAFのSTAT3サイレンシングによりダウンレギュレーションされる遺伝子のリストを使用します。
  4. マウス-ヒト遺伝子オルソログのリストをRで読み込み、Biomartテーブルを介してSTAT3シグネチャを対応するヒトオルソログにマッピングします。
  5. 原発腫瘍遺伝子発現データを R に読み込み、原発腫瘍データを含む ssgseaParam オブジェクトとしてのパラメーターと STAT3 シグネチャを含むリストを使用して GSVA 関数を呼び出します。

12. 遺伝子シグネチャーの発現と臨床的特徴との関係を試験する

  1. 関心のある変数を特定します。間質パーセンテージは、腫瘍間質に属する配列決定された腫瘍サンプル中の細胞の割合を表します。オミクスデータによく関連する次の臨床的特徴を使用します:腫瘍のサイズ、病期、診断時の患者の年齢、リンパ節の状態、転移の状態など。TCGAでは、事前に計算された間質パーセンテージの推定値を使用できます。
    注:具体的には、利用可能な間質の推定値は次のとおりです:EDec Immune/Stromal = 間質/免疫率37のエピゲノムデコンボリューション。免疫スコア = 141 の免疫遺伝子の遺伝子発現プロファイルに基づくssGSEA 38;LUMP = Leukocytes Unmethylation for Purity、これは平均して44の非メチル化免疫特異的CpG部位39;間質スコア = 141 の間質遺伝子の遺伝子発現プロファイルに基づくssGSEA 38;IHC = Nationwide Children's Hospital Biospecimen Core Resource40 によって作成されたヘマトキシリンおよびエオシン染色スライドの画像分析によって推定されます。ABSOLUTE = 体細胞コピー数データ41に基づく。
  2. http://genboree.org/theCommons/documents/569 からのEDEcデータ、https://bioinformatics.mdanderson.org/estimate/disease.html からのStromalおよびImmune scores(RNASeqV2)、およびTCGAbiolinksからのTumor purityデータ(LUMP、IHC、ABSOLUTE)をダウンロードします。その他のデータセットについては、GSVAパッケージを利用した間質の割合を計算し、Yoshihara et al.38から得られた間質と免疫シグネチャーのssGSEAを計算します。
  3. 推定された間質比率の数値ベクトルと、原発腫瘍サンプル全体の STAT3 シグネチャ発現の数値ベクトルとの間の相関を計算します。これは、R の cor.test 関数で実現できます。
  4. 原発腫瘍のトランスクリプトームデータセットに関連付けられた臨床データを、行にサンプル、列に臨床特徴を含む表としてダウンロードします。
  5. 臨床データをRに読み込み、トランスクリプトームマトリックスとメタデータテーブルのサンプルがmatch関数と同じ順序になっていることを確認します。
  6. 数値変数 (腫瘍サイズなど) の場合、原発腫瘍サンプル全体の STAT3 シグネチャ発現の数値ベクトルと、cor.test 関数を使用して臨床的特徴の値のベクトルとの間の相関を計算します。
  7. カテゴリー変数(例、転移状況)については、ノンパラメトリックなウィルコクソン順位和検定(2つのサンプルグループが独立していると仮定)を使用して、2つのサンプルグループ(例、転移性腫瘍と非転移性腫瘍)間のSTAT3シグネチャ発現の差を検定します。これは、R の wilcox.test 関数で実現できます。

13. 腫瘍間質におけるシグネチャーの制御の検査

注:バルクRNAシーケンシングを通じて分析された原発腫瘍における間質シグネチャの発現には、詳細な臨床アノテーションを持つ大規模な患者コホートに依存するという利点があります。一方、間質と上皮を分離することだけが、正常組織42と比較した場合、腫瘍の2つの細胞区画のいずれかにおける遺伝子発現の変化を定義することを可能にする。MetaLCMは、レーザーキャプチャーマイクロディスセッション乳房腫瘍のトランスクリプトームデータセットの分析を容易にするShinyAppです。このツールを使用すると、レーザーキャプチャー顕微鏡解剖乳房腫瘍のトランスクリプトームデータセット全体で、2つの条件間で発現差のある堅牢な遺伝子を検索し、腫瘍間質における以前に定義された遺伝子シグネチャの制御をテストできます。次の手順では、MetaLCM の使用方法について説明します。

  1. リンク https://aurorasavino.shinyapps.io/metalcm/ からアプリにアクセスします。分析を開始するには、比較した条件の特徴を選択します。
  2. 比較の方向を選択します。アップレギュレーションされた遺伝子を選択することにより、条件1でより高い発現を持つ遺伝子が表示されます。
  3. 差次式の p 値しきい値を選択し、[ 実行 ] を押して解析を実行し、設定が変更されるたびに解析を実行します。
  4. 解析を事前定義された遺伝子リストに限定するには、遺伝子記号をカンマで区切って入力するか、遺伝子記号を1つの列に含むCSVファイルをインポートします。
  5. Submit gene listを押して、遺伝子シンボルをインポートします。Resetを押すと、すべての遺伝子を使用して解析が復元されます。差次的に発現する遺伝子のリストを保存する:遺伝子リストが提供されると、それらの遺伝子に対してのみ複数のテスト補正が行われます。このテーブルは、使用可能な各データセットの平均 logFC、折りたたまれた p 値、および個々の logFC と差分発現の p 値で構成されます。
  6. 差次的に発現する遺伝子の倍率変化を含むヒートマップをプロットします。ヒートマップは、データセット間で発現差の完全に一貫した符号を持つ差次的に発現された遺伝子のみを示しています。

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結果

CAFの活動に関するin vitro評価
乳がん(BC)の攻撃的な特徴に対する乳腺腫瘍由来がん関連線維芽細胞(CAF)の寄与は、ステップ3に従って生成された不死化CAF(iCAF)を使用して研究されました。iCAFは、ステップ6で説明したようにスーパー活性化され、その後、sDMEMで飢餓状態にしてCMを収集し、4T1細胞を48時間治療するために使用しました(ステップ7.1を参照)。この治療に続いて、 in vitro 機能アッセイが行われました。 図1 は、4T1細胞の増殖が、対照飢餓培地(CTR)と比較して、s.a. iCAFs CMによる処理によって有意に増強されることを示しています。この増殖の増加は通常24時間以内に始まり、その後数日間上昇し続けます。これらの実験では、CMで処理する前に、プレーティングされた細胞の数と培地中の血清の割合の両方を最適化することが重要です。CM処理後、4T1細胞の遊走能は2倍になり、浸潤ではより控えめではあるが統計的に有意な増加が観...

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ディスカッション

この研究では、マウスCAFの不死化と、 in vitro および in vivoの両方での腫瘍形成促進活性の特性評価のために最適化されたプロトコルを提示します。マーカー発現に基づいて特定のCAFサブタイプを選択的に単離するのではなく、不均一性を維持するために細胞集団全体を保持することを選択しました。細胞は全体として機能的に特徴付けられ、その遺伝子発現プロファイルはそれらの多様性を捉えるために分析されました。CAFを不死化することは、一次CAFが老化する前に通過できる回数が限られているため、この研究にとって非常に重要でした。このアプローチを用いて作製された不死化細胞は、CAFがさまざまな治療に対するがん細胞の応答にどのように影響するかを調べることができるため、化学療法抵抗性を含むさまざまなCAF媒介現象を研究するための貴重なツールとなります。不死化細胞では遺伝子操作が容易であるため、機能研究に特に有用です。ただし、不死化は細胞の表現型と活性を変化させる可能性があることを認識する必要があるため、不死化CAFとその主要な対応物とを徹底的に比...

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開示事項

著者は、競合する利益を宣言しません。

謝辞

この研究は、イタリア癌研究協会(AIRC、IG16930、IG24851からVP)の支援を受けました。イタリア大学研究省(MIUR PRIN 2017および2022からVP);リヒテンシュタインのTruus and Gerrit van Riemsdijk Foundation、V.P.への寄付。ピードモント地方(ディフレクト)。A.S.はイタリアがん研究財団(FIRC)のポスドクフェローシップによって支援され、LAはFondazione Umberto Veronesiによって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1KbプラスDNAラダーサーモフィッシャーサイエンティフィック10787018
24ウェルプレートザルシュテット833922
96ウェルプレートザルシュテット833924
酢酸シグマ・アルディルチ695092
エイジI-HFニューイングランドバイオラボR3552-20度で保管します。C
ベタジンメダファーマ23907076
Bürker カウンティングチャンバー VWRの40443703
焼灼低温ファインチップディスプキーラーAX10339KL
遠心機エッペンドルフ5810R型
コニカルチューブ 15 mLザルシュテット62554502
コニカルチューブ 50 mLザルシュテット62547254
Cryopure 2 mLマイクロチューブザルシュテット72380992
クリスタルバイオレットシグマ・アルディルチC0775RTに保管し、ヒュームフードで使用 
培養プレート直径100mm ザルシュテット833902
培養プレート直径60mm ザルシュテット833920
ddH20ホームメードRTで保管し、生物学的フードで使用
デジタルノギスプレシバ02-301-2
デジタルマイクロスコープライカDM6B型
ジメチルスルホキシドシグマ・アルディルチD8418生物学的フードでの使用
ダルベッコ'の改造されたイーグル」s ミディアム (DMEM)ギブコ119650924度で保管します。C、生物学的フードでの使用
エコリ-HFニューイングランドバイオラボR3101-20度で保管します。C
エチレンジアミン四酢酸(EDTA)シグマ・アルディルチE6758RTで保管し、生物学的フードで使用
ウシ胎児血清 (FBS)ギブコ160000444度で保管します。C、生物学的フードでの使用
フィルター付きチップ 10 & マイクロ;Lザルシュテット703010255
フィルター付きチップ 100 & マイクロ;Lザルシュテット703030255
フィルターチップ 1000 & micro;Lザルシュテット703060255
フィルター付きチップ 20 & マイクロ;Lザルシュテット703030265
フィルター付きチップ 200 & マイクロ;Lザルシュテット703031255
フィルトロプール S プラス 0,20 & マイクロ;m ザルシュテット831826102
フィルトロプール S プラス 0,45 & マイクロ;m ザルシュテット831826
細かいはさみ2バイオール1406009
鉗子2バイオール1102412
ジェネチキンギブコ101310354度で保管します。C、生物学的フードでの使用
リポフェクタミン 2000 トランスフェクション試薬サーモフィッシャーサイエンティフィック116680194度で保管します。C、生物学的フードでの使用
8&muのマトリゲル侵入室;m PETメンブレン コーニング354480
マイクロプレートリーダー(吸光度600nm)プロメガGM3500型
マイクロチューブ 1.5 mL ザルシュテット7269001
オプティメムギブコ319850474度で保管します。C、生物学的フードでの使用
パラホルムアルデヒド(PFA)シグマ・アルディルチ158127RTで保管し、ヒュームフードで使用
pBABE-neo largeTcDNA アドジーン1780-20度で保管します。C、生物学的フードでの使用
pCL-アンフォノバスバイオロジカル 18746853-20度で保管します。C、生物学的フードでの使用
pCMV-R8.74アドジーン22036-20度で保管します。C、生物学的フードでの使用
pCMV-VSVG アドジーン8454-20度で保管します。C、生物学的フードでの使用
ペニシリン-ストレプトマイシン(ペンストレプト、10,000&μ;g/mL) ギブコ151401224度で保管します。C、生物学的フードでの使用
位相差顕微鏡 オリンパス BX42
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)ホームメードRTで保管し、生物学的フードで使用
pLKO.1-ピューロ アドジーン10878-20度で保管します。C、生物学的フードでの使用
ポリ-L-リジン溶液シグマ・アルディルチP89204度で保管します。C、生物学的フードでの使用
  からのピューロマイシン二塩酸塩;ストレプトミセス・アルボニガーシグマ・アルディルチP8833
rCutSmart バッファー ニューイングランドバイオラボB6004-20度で保管します。C
げっ歯類シェーバーエスキュラップGT416
ロズウェルパーク記念研究所(RPMI)ギブコ618700104度で保管します。C、生物学的フードでの使用
丸い先端の喉の渇きの綿棒シグマ・アルディルチZ744127
メスギマ27041
セキュラセミマイクロ天びんザルトリウスSECURA125-1S
血清ピペット 10 mL ザルシュテット861254001
血清ピペット 2 mL ザルシュテット861252001
血清ピペット 25 mL ザルシュテット861256001
血清ピペット 5 mL ザルシュテット861253001
ステッチ 5-0エチコン1866G
シリンジ 10 mLペンタフェルテ00202250E14
シリンジ 5 mLペンタフェルテ00202250E12
シリンジオムニカンインスリン1mLブラウン9151125S
ティッシュアデシブ3Mベットボンド1469SBの
トランスウェルインサート 8 & マイクロ;m 細孔 隼353097
Transwell Matrigel インサート 8 & micro;m 細孔 コーニング354480
トリプシン-EDTA(0.5%)、フェノールレッドなしギブコ15400054
Vivaspin 20遠心濃縮機MWCO 10,000 Da シグマ・アルディルチZ614602

参考文献

  1. Bhattacharya, S., et al. Group behavior and emergence of cancer drug resistance. Trends Cancer. 7 (4), 323-334 (2021).
  2. Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nat Rev Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
  3. Marusyk, A., et al. Spatial proximity to fibroblasts impacts molecular features and therapeutic sensitivity of breast cancer cells influencing clinical outcomes. Cancer Res. 76 (22), 6495-6506 (2016).
  4. Su, S., et al. Cd10(+)gpr77(+) cancer-associated fibroblasts promote cancer formation and chemoresistance by sustaining cancer stemness. Cell. 172 (4), 841-856.e16 (2018).
  5. Sahai, E., et al. A framework for advancing our understanding of cancer-associated fibroblasts. Nat Rev Cancer. 20 (3), 174-186 (2020).
  6. Watson, S. S., et al. Microenvironment-mediated mechanisms of resistance to HER2 inhibitors differ between HER2+ breast cancer subtypes. Cell Syst. 6 (3), 329-342.e6 (2018).
  7. Xie, J., et al. Cancer-associated fibroblast-derived extracellular vesicles: Regulators and therapeutic targets in the tumor microenvironment. Cancer Drug Resist. 8, 2(2025).
  8. Du, R., et al. PDPN-positive CAFs contribute to HER2-positive breast cancer resistance to trastuzumab by inhibiting antibody-dependent NK cell-mediated cytotoxicity. Drug Resist Updat. 68, 100947(2023).
  9. Zhang, H., et al. Define cancer-associated fibroblasts (CAFs) in the tumor microenvironment: New opportunities in cancer immunotherapy and advances in clinical trials. Mol Cancer. 22 (1), 159(2023).
  10. Zheng, S., et al. Dissecting the role of cancer-associated fibroblast-derived biglycan as a potential therapeutic target in immunotherapy resistance: A tumor bulk and single-cell transcriptomic study. Clin Transl Med. 13 (2), e1189(2023).
  11. Bainer, R., et al. Gene expression in local stroma reflects breast tumor states and predicts patient outcome. Sci Rep. 6, 39240(2016).
  12. Farmer, P., et al. A stroma-related gene signature predicts resistance to neoadjuvant chemotherapy in breast cancer. Nat Med. 15 (1), 68-74 (2009).
  13. Winslow, S., Leandersson, K., Edsjo, A., Larsson, C. Prognostic stromal gene signatures in breast cancer. Breast Cancer Res. 17 (1), 23(2015).
  14. Xie, J., et al. Turning up a new pattern: Identification of cancer-associated fibroblast-related clusters in TNBC. Front Immunol. 13, 1022147(2022).
  15. Chen, Y., Mcandrews, K. M., Kalluri, R. Clinical and therapeutic relevance of cancer-associated fibroblasts. Nat Rev Clin Oncol. 18 (12), 792-804 (2021).
  16. Bartoschek, M., et al. Spatially and functionally distinct subclasses of breast cancer-associated fibroblasts revealed by single-cell RNA sequencing. Nat Commun. 9 (1), 5150(2018).
  17. Liu, S. Q., et al. Single-cell and spatially resolved analysis uncovers cell heterogeneity of breast cancer. J Hematol Oncol. 15 (1), 19(2022).
  18. Massa, D., Tosi, A., Rosato, A., Guarneri, V., Dieci, M. V. Multiplexed in situ spatial protein profiling in the pursuit of precision immuno-oncology for patients with breast cancer. Cancers. 14 (19), 4885(2022).
  19. Tietscher, S., et al. A comprehensive single-cell map of T cell exhaustion-associated immune environments in human breast cancer. Nat Commun. 14 (1), 98(2023).
  20. Tzoras, E., et al. Dissecting tumor-immune microenvironment in breast cancer at a spatial and multiplex resolution. Cancers. 14 (8), 1999(2022).
  21. Wu, S. Z., et al. A single-cell and spatially resolved atlas of human breast cancers. Nat Genet. 53 (9), 1334-1347 (2021).
  22. Ning, L., et al. Scrna-seq characterizing the heterogeneity of fibroblasts in breast cancer reveals a novel subtype sfrp4(+) caf that inhibits migration and predicts prognosis. Front Oncol. 14, 1348299(2024).
  23. Salemme, V., et al. The role of tumor microenvironment in drug resistance: Emerging technologies to unravel breast cancer heterogeneity. Front Oncol. 13, 1170264(2023).
  24. Attalla, S., Taifour, T., Bui, T., Muller, W. Insights from transgenic mouse models of pymt-induced breast cancer: Recapitulating human breast cancer progression in vivo. Oncogene. 40 (3), 475-491 (2021).
  25. Ferreira, T., Azevedo, T., Silva, J., Faustino-Rocha, A. I., Oliveira, P. A. Current views on in vivo models for breast cancer research and related drug development. Expert Opin Drug Discov. 19 (2), 189-207 (2024).
  26. Holen, I., Speirs, V., Morrissey, B., Blyth, K. In vivo models in breast cancer research: Progress, challenges and future directions. Dis Model Mech. 10 (4), 359-371 (2017).
  27. Pedroza, D. A., Gao, Y., Zhang, X. H., Rosen, J. M. Leveraging preclinical models of metastatic breast cancer. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1879 (5), 189163(2024).
  28. Nuckhir, M., Withey, D., Cabral, S., Harrison, H., Clarke, R. B. State of the art modelling of the breast cancer metastatic microenvironment: Where are we. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 29 (1), 14(2024).
  29. Avalle, L., et al. Stat3 induces breast cancer growth via angptl4, mmp13 and stc1 secretion by cancer associated fibroblasts. Oncogene. 41 (10), 1456-1467 (2022).
  30. Halaban, R., Alfano, F. D. Selective elimination of fibroblasts from cultures of normal human melanocytes. In Vitro. 20 (5), 447-450 (1984).
  31. Avalle, L., et al. Micrornas-143 and -145 induce epithelial to mesenchymal transition and modulate the expression of junction proteins. Cell Death Differ. 24 (10), 1750-1760 (2017).
  32. Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. Uncovering the complexity of transcriptomes with rna-seq. J Biomed Biotechnol. 2010, 853916(2010).
  33. Ura, H., Togi, S., Niida, Y. A comparison of mrna sequencing (rna-seq) library preparation methods for transcriptome analysis. BMC Genomics. 23 (1), 303(2022).
  34. Kim, D., et al. Tophat2: Accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), R36(2013).
  35. Hanzelmann, S., Castelo, R., Guinney, J. Gsva: Gene set variation analysis for microarray and rna-seq data. BMC Bioinformatics. 14, 7(2013).
  36. Mounir, M., et al. New functionalities in the tcgabiolinks package for the study and integration of cancer data from gdc and gtex. PLoS Comput Biol. 15 (3), e1006701(2019).
  37. Onuchic, V., et al. Epigenomic deconvolution of breast tumors reveals metabolic coupling between constituent cell types. Cell Rep. 17 (8), 2075-2086 (2016).
  38. Yoshihara, K., et al. Inferring tumour purity and stromal and immune cell admixture from expression data. Nat Commun. 4, 2612(2013).
  39. Aran, D., Sirota, M., Butte, A. J. Systematic pan-cancer analysis of tumour purity. Nat Commun. 6, 8971(2015).
  40. Liu, J., et al. An integrated tcga pan-cancer clinical data resource to drive high-quality survival outcome analytics. Cell. 173 (2), 400-416.e11 (2018).
  41. Carter, S. L., et al. Absolute quantification of somatic DNA alterations in human cancer. Nat Biotechnol. 30 (5), 413-421 (2012).
  42. Savino, A., De Marzo, N., Provero, P., Poli, V. Meta-analysis of microdissected breast tumors reveals genes regulated in the stroma but hidden in bulk analysis. Cancers. 13 (13), 3371(2021).
  43. Wiederschain, D., et al. Single-vector inducible lentiviral rnai system for oncology target validation. Cell Cycle. 8 (3), 498-504 (2009).
  44. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of crispr-cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  45. Pfefferle, A. D., et al. Transcriptomic classification of genetically engineered mouse models of breast cancer identifies human subtype counterparts. Genome Biol. 14 (11), R125(2013).
  46. Hahn, W. C., et al. Enumeration of the Simian virus 40 early region elements necessary for human cell transformation. Mol Cell Biol. 22 (7), 2111-2123 (2002).
  47. Counter, C. M., et al. Dissociation among in vitro telomerase activity, telomere maintenance, and cellular immortalization. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (25), 14723-14728 (1998).
  48. Ferrari, N., et al. Dickkopf-3 links hsf1 and Yap/Taz signalling to control aggressive behaviours in cancer-associated fibroblasts. Nat Commun. 10 (1), 130(2019).
  49. Herrera, M., et al. Cancer-associated fibroblast-derived gene signatures determine prognosis in colon cancer patients. Mol Cancer. 20 (1), 73(2021).
  50. Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumours. Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).
  51. Cobos, F. A., et al. Effective methods for bulk RNA-seq deconvolution using scRNA-seq transcriptomes. Genome Biol. 24 (1), 177(2023).
  52. Cheng, P. S. W., Zaccaria, M., Biffi, G. Functional heterogeneity of fibroblasts in primary tumors and metastases. Trends Cancer. 11 (2), 135-153 (2025).

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