前立腺癌関連線維芽細胞の単離、培養、および特性評価

前立腺がん (PCa) は、世界のほぼ 3 分の 2 の国で男性で最も頻繁に診断されるがんです。2022年には、世界で約150万人の新規感染者が報告され、39万7,000人が死亡した。これらの数字により、PCa は男性のがん関連死亡の 2 番目に多いがんであり、5 番目に多い原因となっています¹.

PCa は多巣性で生物学的に複雑な疾患であり、腫瘍間の実質的な不均一性 ^2,3,4、多様な分子サブタイプ、およびさまざまな臨床転帰 ^5,6 を特徴とし、これらはすべて予後と治療反応に大きな影響を与えます⁷。

前立腺腫瘍の開始と進行における腫瘍微小環境 (TME) の重要な役割は十分に確立されていますが ^8,9、腫瘍細胞と周囲の間質コンパートメントとの間の分子相互作用は完全には理解されていません。前立腺腫瘍微小環境 (TME) が腫瘍の発生と進行に重要な役割を果たすことは十分に確立されていますが、腫瘍細胞と周囲の間質との間の分子相互作用は十分に定義されていません。TMEは、間葉系および免疫起源の間質細胞を含むさまざまな間質細胞で構成され、腫瘍由来のシグナルに応答して活性化され、その後腫瘍促進機能を獲得します^10,11。これらの中で、がん関連線維芽細胞 (CAF) は、多くの場合、最も豊富な間質集団を表します。CAFは、細胞外マトリックス(ECM)のリモデリングに寄与し、腫瘍の増殖を促進し、がん細胞の浸潤と遊走を促進します4,11,12,13。CAF は、分泌因子と直接的な細胞間相互作用を通じて、増殖、浸潤、および治療抵抗性にも影響を与えます。特に、CAF は不均一な集団です。一般に腫瘍形成促進機能に関連していますが、一部のサブタイプは腫瘍抑制の役割を果たす可能性があります^14,15。重要なことに、CAFの固有のマーカーが存在しないため、CAFの正確な識別と多様な役割の機能的解剖に課題が生じます^12,16。

CAFと腫瘍細胞の間の機能的クロストークを調査するための堅牢なアプローチには、初代CAFと一致する正常線維芽細胞(NF)を単離し、増殖、遊走、コロニー形成、固定非依存性増殖などの腫瘍細胞の挙動に対するそれぞれの影響を評価することが含まれます17,18,19.この記事では、高リスクPCa患者の根治的前立腺全摘除術標本からCAFおよびNFを単離するための、洗練された再現性の高いプロトコルについて説明します。このプロトコルの重要な要素は、専門の泌尿器病理学者による腫瘍および無腫瘍領域の正確な同定と解剖であり、同じ患者から CAF と NF を導き出すことができます。この対応のあるサンプルアプローチは、線維芽細胞の表現型に影響を与える可能性のある腫瘍間の不均一性と個々の患者固有の変数を制御するのに役立ちます^20、21、22。十分な腫瘍組織が利用可能であることを確認するために、グリーソンスコアが ≥7 の患者の標本に焦点を当てます。

単離された線維芽細胞の信頼性の高い表現型特性評価には、それらを他の細胞型、特に重複するマーカー発現を共有する可能性のある上皮細胞と区別するために複数のマーカーを使用する必要があります¹⁶。初代PCa線維芽細胞は通常、10〜15回の継代後に老化を起こし、長期分析を複雑にするため、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)²³の安定した発現による細胞不死化のプロトコルも提示します。

腫瘍細胞に対する CAF と NF の機能的効果を調査するために、いくつかの実験戦略をテストし、最適化しました。CAFが分泌因子と細胞間直接接触の両方を通じて影響を及ぼすことを考えると²⁴、2つの補完的なアッセイシステムが開発されています:(1)線維芽細胞条件培地(CM)による癌細胞の治療、および(2)線維芽細胞と腫瘍細胞の直接共培養。これらのアッセイは、増殖、固定に依存しない増殖、遊走などの主要ながん細胞特性を評価します。分泌因子の影響を標準化するために、CAFおよびNFからのコンディショニング培地を濃縮し、総タンパク質含有量に基づいて定量(conCM)しました。

これらのアッセイを通じて重要な機能的効果を実証することは、CAF 主導の腫瘍形成の重要なメディエーターの同定をサポートし、治療介入の潜在的な標的を提供することができます。

この研究は、イタリアのトリノにあるチッタ デッラ サルート モリネット病院の生命倫理委員会によって承認された、臨床サンプルの使用に関する施設のガイドラインに完全に準拠して実施されました。すべてのサンプルは、参加患者によるインフォームドコンセントへの署名後に採取されました。次のセクションでは、がん関連線維芽細胞(CAF)およびそれらに一致する正常線維芽細胞(NF)の対応物を単離するための詳細なステップバイステップのプロトコルを提供します。このプロトコルには、腫瘍および隣接する非腫瘍領域の解剖、組織処理、細胞培養、および単離された細胞の表現型および機能的特性評価の両方が含まれます。すべての手順は、認定されたバイオセーフティキャビネット内の無菌条件下で実行する必要があります。細胞は、特に明記されていない限り、10%ウシ胎児血清(FBS)、100 U/mLペニシリン、および100 μg/mLストレプトマイシンを添加した完全なダルベッコ修飾イーグル培地(cDMEM)を使用して、5%CO₂ を含む加湿雰囲気で37°Cで培養しました。すべての遠心分離ステップは、ブレーキをかけた状態で実行されます。プロトコル全体で使用される試薬、材料、および機器の包括的なリストについては、 材料表 を参照してください。この方法論は、グリーソンスコアが 4+3 以上の高リスク前立腺がん標本に最適化されています。

1. 外科的サンプルの解剖

注: この手順は、高悪性度前立腺がん (PCa) 患者に対して実施された根治的前立腺全摘除術 ²⁵ から採取された手術標本に対して実施され、内部の施設ガイドラインおよび確立された国際文献およびベスト プラクティス^26、27、²⁸ に基づいて、標準化されたプロトコルに従って管理されました。

1. 前立腺を滅菌ドレープの上のバイオセーフティフードの下に置き、解剖学的ランドマークに従って向きを変えます。
   注:この手順は、経験豊富な泌尿器病理学者が行う必要があります。
2. 滅菌ブレードを使用して、術前生検レポートで腫瘍性または腫瘍細胞がないと特定された領域から組織スライスを切除します。
3. 厚さ2.5μmの組織切片を調製し、ヘマトキシリンとエオシン(H&E)で染色して、選択した領域における腫瘍細胞の有無を確認することにより、両方の組織サンプルに対して迅速な凍結分析²⁹を実施しますWHO分類³⁰ の前立腺腺癌の診断基準に従って( 図1Aを参照)。
   注:不一致が発生した場合は、腫瘍性領域と非腫瘍性領域の両方の組織学的確認が得られるまで、サンプリングプロセスを繰り返します。
4. 腫瘍性および非腫瘍性領域から約10 mm² サンプルを切除し、7 mLの氷冷組織保存バッファーを含む15 mLの円錐形チューブに入れ、その後の手順のために氷上に保管します。
   注:サンプルは、このバッファーで4°Cで最大48時間保存できます。

2.線維芽細胞の分離

注:以下のすべての処理手順は、特に明記されていない限り、4°Cの氷上で実行する必要があります。スキームについては、図 1 A を参照してください。

1. 1日目:組織サンプルの重量を量ります。
   注:平均して70〜100mgが得られます。
2. 6 cmの皿に移動し、4 mLの氷冷PBSで2回、4 mLの氷冷cDMEMで2回、どちらも200 U / mLペニシリン、200 μg/mLのストレプトマイシン(2回)を添加し、滅菌鉗子を使用して組織を1つの皿から次の皿に移します。
3. 100 U/mLペニシリン-Gと100 μg/mLストレプトマイシンを添加した1 mLのDMEMを氷上の6 cmプレートに入れて組織を機械的に破壊し、ハサミまたは刃を使用して小さな断片(<1 mm²)にみじん切りにします。
4. 5 mLの氷冷cDMEMを含む15 mLのコニカルチューブに移します。754 x g で 4 °C で 5 分間遠心分離します。
5. 10 mLピペットを使用して上清を慎重に除去し、ペレットを5 mLの氷冷cDMEMに再懸濁します。再び754 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
6. 上記のように上清を除去し、1 mL / 100 mgの組織を使用して、ペレットをコラゲナーゼII(DMEMで1mg / mL)に再懸濁します。1.5 mLマイクロチューブに移動します。
   注:コラゲナーゼバッチにはばらつきがあるため、さまざまなバッチをテストし、予測されるすべての単離を実行するのに十分なバッチがあることを確認します。
7. チューブをパラフィンフィルムで覆い、サンプルを37°CでO/N(8〜12時間)連続ロッキングで消化します。
   メモ:2日目に次の手順を実行します。
8. サンプルを15 mLのコニカルチューブに移し、5 mLの氷冷cDMEMを細胞懸濁液に加えてコラゲナーゼを不活性化し、4°Cで5分間754 x g で遠心分離します。
   注:コラゲナーゼは、洗剤を含む容器に吸引することによって廃棄されます。
9. 10 mLピペットを使用して上清を吸引し、ペレットを1 mLの0.05%トリプシン/ EDTAに再懸濁します。時々振とうしながら、37°Cで5分間インキュベートします。
10. 1 mLのDNase Iをサンプルに加え、よく混合します。新たに調製した25 mg / mL溶液をPBSで使用します。
    注:この段階でのDNase I処理は、単一細胞溶液を得るのに役立ちます。
11. 754 x g で 4 °C で 5 分間遠心分離します。
12. 10 mLピペットを使用して上清を吸引し、ペレットを5 mLの冷たいcDMEMに再懸濁します。754 x g で 5 分間 4 °C 遠心分離します。
13. 細胞を20%FBS cDMEMに再懸濁します。プレートをプレートし、37°C、5%CO₂、および95%湿度で少なくとも3日間インキュベートします。皿を動かしたり傾けたりしないように注意してください。70〜100 mgの組織の場合、細胞懸濁液を2 x 3.5 cmの皿、2 mLの培地に分配します。必要に応じて、それに応じて縮小します。
    注:組織が50 mg未満の場合、細胞誘導が非効率になります。分割および凍結方式を 図1Bに示します。
14. 3日後、細胞の形態/生存率をチェックし、培地の2/3を交換して、細胞産生成長因子を維持します。細胞がコンフルントに達するまでに約7〜10日かかり、1日おきに培地を交換します。
15. コンフルエントしたら、細胞を20%FBS cDMEM中の1つの10 cm皿に継代します。
16. 培地を1日おきに交換し、15%FBS培地を2回、次に1回、12.5%、次に10%使用します。FACS分析では、RNAおよびタンパク質の抽出と凍結ストックは、 図1Bのスキームに従います。
17. 約100%コンフルエント(約10日)のときにセルを分割します。豊富なPBSで2〜3回、それぞれ5分間洗浄します。1%トリプシン/ EDTA(2x)を加え、インキュベーターに入れ、数分ごとに細胞の剥離を確認します。

3. 培養条件

1. 100%コンフルエント(1:3以下)にのみ細胞を継代します。
2. コンフルエント10 cmディッシュの50%に対応するアリコートを0.5 mLの氷冷凍結培地(FBSでは10%DMSO)に凍結します。10cmの皿で各アリコートを解凍します。
   注:平均倍加時間は80〜90時間です。

4. FACS解析

注:このプロトコルは、線維芽細胞集団の信頼性の高い特性評価を保証し、上皮細胞、内皮細胞、または免疫細胞からの潜在的な汚染を特定します。FACS分析は、 図2Aに示すように、伝代2で実行されます。

1. 細胞を回収し、10⁶ 細胞/ mLの濃度でFACSバッファー(PBSと2%FBS)に再懸濁します。
2. フローサイトメトリーチューブにラベルを付け、それぞれに100 μLの容量で1 x 10⁵ 個の細胞を追加します。4つの抗体で染色する場合は、次のように染色とゲーティングの両方を考慮して11本のチューブを準備します(表1)
   注:1本のチューブ、抗体なし(未染色対照)、細胞の自家蛍光を評価するため、抗体アイソタイプコントロールを備えた1本のチューブ、非特異的結合を評価するためのチューブ1本、補償のために、それぞれ1つの抗体を含む4本のチューブ。補償ビーズは細胞を置き換えることができ、ゲーティング用の蛍光マイナス1(FMO)チューブ4本、それぞれ抗体の1つを除外し、1本のチューブに4つの抗体すべて(実際のサンプル)を置き換えることができます。以下の蛍光標識抗体が使用されます( 材料表を参照):(1)抗EpCAM-PE(上皮細胞マーカー)、(2)抗CD31-VioBlue(内皮細胞マーカー)、(3)抗CD45-FITC(免疫細胞マーカー)、(4)抗CD90-APC(線維芽細胞マーカー)。利用可能なフローサイトメーターフィルターに従って、他の蛍光色素に結合した抗体を使用することができます。細胞の生存率を維持するために、氷上ですべてのステップを実行します。
3. 精製された抗CD16/CD32抗体やブロッキングバッファー(PBS 1%-2%BSA)などのフラグメント結晶化性受容体(FcR)ブロッカーで細胞をインキュベートします。細胞懸濁液100 μLあたり1〜5 μLのFcRブロッキング試薬を使用し、4°Cで10〜15分間インキュベートします。
4. 洗わずに直接染色を進めてください。 表1に指定されているように、適切な抗体希釈液または対応するアイソタイプコントロールをチューブに追加します。
5. 穏やかに混合し、暗所で4°Cで30分間インキュベートします。
6. 2 mLのFACSバッファーで洗浄します。
7. 4°Cで300 x gで5分間遠心分離します。
8. 上清を廃棄し、細胞を1 mLの新鮮なFACSバッファーに再懸濁します。
9. 製造元の指示に従って生存率染料(ヨウ化プロピジウム)を追加します( 材料表を参照)。
10. フローサイトメーターでサンプルを取得します。
11. 単一染色補正コントロールを使用して、補正マトリックスを設定します。データ解析では、FACS密度プロットに次のゲーティング戦略を適用します。
12. 前方および側面散乱ゲーティング:FSC-A とSSC-Aを作成し、細胞破片を排除するために主要な細胞集団の周囲の領域を設計します。
13. ダブレット除外の場合:FSC-A とFSC-W(またはFSC-H 対FSC-A)を設計し、細胞の塊を除外する領域を設計し、領域に対して幅が大きくなる(または高さに対して面積が大きくなります)を示します。単一のセルを選択し、同じ手順を実行して、SSC-A とSSC-W(またはSSC-H 対SSC-A)を使用して、単一細胞集団の純度を高めます。
14. 生存率染料(すなわち、ヨウ化プロピジウム)とプロットします 。SSC-Aを選択し、陰性生細胞を選択します。
15. 生細胞で、CD326(x軸) とCD31(Y軸);対応するFMOサンプルを使用して、ゲートを正確に設定します。FMOを使用すると、他の蛍光色素によって引き起こされる特定のチャネルへの蛍光の拡散を説明できます。
    1. CD326 FMOサンプルを見て、左象限のすべての細胞を含む象限ゲートを描きます(つまり、CD326に対して陰性)。CD31 FMOサンプルを使用して同じ手順を繰り返し、すべてのFMO細胞を下部象限に持たせるためにゲートを調整します(つまり、CD31に対して陰性)。この象限を使用してサンプルを分析し、左下の象限(CD31-CD326^-)の細胞を選択します。
16. CD326(x軸)とCD45(y軸)、CD326 FMOとCD45 FMOを使用して象限ゲートを設定します。この象限を使用してすべてのサンプルを分析し、左下の象限(CD45-CD326^-)の細胞を選択します。
17. プロットCD90とSSC-Aを使用し、CD90 FMOを使用して、陰性細胞を除外し、CD90⁺のみを含む領域を設定します。この領域を使用してすべてのサンプルを分析し、CD90⁺細胞の割合を測定します。代表的な結果を図2Aに示します。

5.線維芽細胞の不死化

注:CAFおよびNF集団の不死化は、hTERT発現レトロウイルスベクターによる安定した形質導入によって達成されます。以下は、感染性偽ウイルス粒子を調製し、細胞を形質導入するためのプロトコルです。

1. レトロウイルス粒子の生成
   1. 1日目、ポリ-L-リジンコーティングと細胞プレーティング:10 cmのディッシュに6 mLのポリ-L-リジン溶液(H₂Oで0.1 mg / mL)をコーティングし、TCフードの下で5分間インキュベートし、吸引し、開いたディッシュをフードの下で乾燥させてから、3 x 10⁶ HEK293T細胞をプレーティングします。
   2. 2日目:30 μLの陽イオン脂質を介したトランスフェクション試薬を0.75 mLの抗生物質を含まないリポフェクション最適化培地に加えます。
   3. 並行して、2 μgのpCL-Ampho Retrovirus Packaging Vectorと2 μgのpBABE-puro-hTERTプラスミドを、抗生物質を含まない脂肪受付最適化培地0.75 mLに加えます。
   4. RTで5分間インキュベートします。
   5. 2つの希釈液を15 mLのコニカルチューブで混合し、RTで20分間インキュベートします。
   6. その間、HEK293T培地を10%FBSを添加した6 mLのリポフェクション最適化培地に置き換えます。
   7. DNA複合体を皿表面に穏やかに分散させ、加湿したCO₂インキュベーターでO / Nまで6時間インキュベートします。
   8. 3日目:培地を7 mLのcDMEMと交換し、48時間インキュベートします。
      注:このステップから始めて、施設の規則に従って、バイオセーフティレベル3(BSL3)組織培養施設で作業を実行する必要があります。
   9. 5日目に、ウイルス含有培地を回収し、0.22μmのシリンジフィルターでろ過します。
   10. 分注し、-80°Cで保存します。
2. ウイルス形質導入
   1. 1日目:6ウェルプレートの2ウェルに60%の合流点で低継代線維芽細胞をプレートします。
   2. 2日目:培地を、8 μg/mLのポリブレンを含む以前に作製したpBABE-puro-hTERTレトロウイルス製剤1 mLと交換し、12〜16時間インキュベートします。
   3. 3日目:ウイルス含有培地を2 mLのcDMEMに置き換えます。
   4. 4日目:24時間後、ピューロマイシン選択(2μg/mL)の48時間ラウンドを2回開始します。
      注:濃度は、抗生物質および細胞タイプのバッチごとに経験的に決定する必要があり、選択から4日以内にすべての細胞を殺すために最低濃度を選択する必要があります。
   5. 8日目:感染していない対照細胞がすべて死滅したことを確認します。培地をcDMEMに置き換え、感染した細胞をコンフルエントになるまで増殖させてから、1:3で継代します。細胞をコンフルエンスに到達させ、再び1:3で分割します。この段階で、セルはBLS3ファシリティを終了できます。
      注:冷凍アリコートはできるだけ早く準備してください。不死化が確実に起こったことを確認するために、細胞を5〜6回継代し、それらの形態と重複率をスコアリングします。以下に説明する方法を使用して、不死化細胞を主要な対応物と機能的に比較します。

6.線維芽細胞の特性評価

1. 単離された細胞のCAF/NFマーカーの発現を表現型的に分析し、腫瘍細胞に対する潜在的な発癌促進活性を機能的に特徴付けます。
   注:RNAレベルとタンパク質レベルの両方でマーカー発現レベルを評価するために最適化されたqPCRオリゴヌクレオチドおよび抗体は、それぞれ表2および材料表に報告されています。線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)に対する抗体は非特異的であることが多いことに注意してください。適切なポジティブコントロールとネガティブコントロール^31,32を必ず含めてください。線維芽細胞と腫瘍細胞の間のクロストークを評価するには、さまざまな方法を使用できます。ここでは、CAFまたはNFに由来する条件付け培地(CM)で腫瘍細胞を処理するか、線維芽細胞と腫瘍細胞を共培養するかのいずれかからなる2つの代替アプローチについて説明します。腫瘍細胞の増殖を促進するためのいずれかのアプローチの有効性が説明されています。

7. コンディショニング培地の調製と濃縮

注:コンディショニング培地は、異なる細胞間の比較を容易にするために、収集後に濃縮され、正確に投与されます。

1. cDMEMの15 cm皿に細胞を70%コンフルエンスでプレートします。
2. 翌日、15 mLの飢餓培地(FBSを含まないDMEM)に切り替え、48時間インキュベートしてCMを生成します。
3. CMを回収し、RTで300 x g で5分間遠心分離し、0.22 μmフィルターでろ過して細胞破片を除去して滅菌します。
4. 濃縮チューブ(MWCO 10,000 Da)に移し、2000 x g および4°Cで20分間遠心分離するか、製造元の指示に従って、約1 mLの濃縮CM(conCM)、つまり15 x濃度を取得します。
5. conCMを分注し、-80°Cで保存します。
6. 比色タンパク質アッセイを使用して、収集したconCMのタンパク質含有量を定量します。
   注:得られた平均濃度は0.5および2μg/μLです。より低い濃度でも使用できます。

8. 増殖アッセイ

注:細胞増殖(DU145またはLNCaPヒトPCa細胞株を使用)は、腫瘍細胞をconCMで処理するか、CAFまたはNFと共培養するかの2つの異なる設定で生細胞分析装置を使用して評価しました。この場合、蛍光腫瘍細胞を使用する必要があります。代表的な結果を 図3に示します。

1. conCMによる治療時の増殖アッセイ
   注:このプロトコルはDU145細胞用に最適化されています。セルが異なれば、調整が必要な場合があります。
   1. 96ウェルプレート(750細胞/ウェル)のcDMEMの腫瘍細胞をプレートし、条件ごとに少なくとも3回の反復を考慮し、O / Nをインキュベートします。
   2. cDMEMを飢餓培地に置き換えますが、補充の有無にかかわらず、50 μg/mLのconCMで。
   3. プレートをインキュベーター内の生細胞分析装置チャンバーに移します。
   4. 37°Cで30分間温めてから、最初のスキャンを開始します。
   5. 位相差チャネルを使用し、適切な対物レンズと希望するフィールド/ウェルの数(10倍対物レンズと5フィールド/ウェルを推奨)、および標準スキャンタイプを選択します。4〜5日間、6時間ごとにスキャンします(期間は、条件と細胞の種類について経験的に決定する必要があります)。
   6. 製造元の指示に従って分析を実行します( 材料表を参照)。
   7. 各ウェル(各条件の技術的反復)について、時間ゼロでの値に対するフォールドの変化を計算します。対応するグラフを生成し、適切なソフトウェアを使用して統計的有意性を評価します。
2. 共培養時の増殖アッセイ
   1. 750 RFP発現DU145細胞とCAFまたはNFを、96ウェルプレートのcDMEMに1:3の比率で共プレートします。
   2. 翌日、2%FBS DMEMに切り替えます。プレートをインキュベーター内の生細胞分析装置チャンバーに移し、位相差とオレンジ色チャンネルの両方を使用して、6時間ごとに4日間標準スキャンを開始します。
   3. 製造元の指示に従って増殖分析を実行します( 材料表を参照)。
   4. 各ウェル(各条件の技術的反復)について、時間ゼロでの値に対するフォールドの変化を計算します。対応するグラフを生成し、適切なソフトウェアを使用して統計的有意性を評価します。

9. 創傷治癒移動アッセイ

注:ここでは、生細胞分析装置を使用して細胞遊走を測定するために、古典的なスクラッチアッセイ³³の自動化バージョンが提示される。

1. 生細胞分析装置に適した96ウェルプレートに腫瘍細胞をプレートして、コンフルエント単層を取得します。
2. 翌日、細胞を10 ug / mLのマイトマイシンCで2時間処理します。
   注:このステップは、結果を混乱させるアッセイ中の細胞増殖を回避するために不可欠です。
3. 製造元の指示に従ってウェルに傷を付けます( 材料表を参照)。
4. 100 μLのPBSで洗浄して、剥離した細胞を除去します。
5. 飢餓培地を50 mg / mLまたはなし(対照)で添加します。
6. プレートをインキュベーター内の生細胞分析チャンバーに入れます。
7. 30分後、細胞と状態に応じて、推奨される創傷治癒スキャンプロトコルを4時間ごとに1日以上プログラムします。
8. 製造元の指示に従って結果を分析します( 材料表を参照)。

10. 軟寒天アッセイによる固定非依存性成長

1. CAFまたはNFを12ウェルプレートに70%のコンフルエンスでプレートし、3つの空のウェルをコントロールとして残します。
2. 翌日、無菌条件下で50 mLコニカルチューブ内の12.5 mL PBSに0.45 gの低融点寒天培地を加えて、4x軟寒天原液(3.6%)を調製します。
3. 電子レンジに溶かします。溶液が濃縮される原因となる過度の沸騰に注意してください。
4. 37°Cで冷却し、予熱したcDMEMで1:4に希釈して1x作業溶液を調製します。
5. 12ウェルプレートから培地を吸引し、各ウェルに500 μLの1x寒天溶液を加えます。
6. 残りの寒天溶液を37°Cで保存しながら、4°Cで20分間固化させます。
7. その間に、腫瘍細胞をトリプシン化し、2 x 10⁴ 細胞/ mLの細胞懸濁液を調製します。
8. 細胞懸濁液と寒天1x溶液を数回ピペッティングして等量混合し、各ウェルの最初の寒天層の上に500 μL(すなわち、5000細胞)を分注します。少なくとも10%余量の細胞懸濁液を調製してください。
9. 寒天を4°Cで20分間インキュベートして固めます。
10. 各ウェルに1 mLのcDMEMを加え、ウェルの端から培地を穏やかに吸引し、柔らかい寒天層の変位を避けるために、ほぼ滴下して新鮮な培地を中央に加えることにより、1日ごとに更新します。
11. 簡単に見えるコロニーが現れるまでインキュベートします。DU145細胞は通常約12日かかりますが、若干の違いがあります。
12. 200 μLのニトロブルーテトラゾリウム塩化物溶液(PBS中で1 mg / mL)を加えて、培地と染色コロニーを廃棄します。加湿インキュベーターで37°Cで一晩インキュベートします。
13. コロニーが染色されたら、色素溶液を廃棄し、実体顕微鏡を使用して画像を取得します。プレートを顕微鏡ステージに置き、倍率を最小値(0.8倍)に設定して、ウェル全体が見えるようにします。粗いフォーカスノブを使用してコロニーにシャープな焦点を合わせ、画像をキャプチャする前に照明とモード設定を調整します。
14. 適切なソフトウェア³⁴ を使用して、 補足ファイル1に規定されている手順に従って、コロニー数および占有面積を定量化する。
15. コロニーの数とサイズ分布をスコアリングします( 図4を参照)。

7 人の高悪性度 PCa 患者からの CAF と NF のペアは、このプロトコルで単離に成功しました。患者の手術年齢とグリーソンスコアを表 3 にまとめます。由来線維芽細胞集団の純度を評価するために、継代2つの一次CAFおよびNFを分離し、示された蛍光抗体またはヨウ化プロピジウムで染色し、アポトーシスを評価しました。その後のFACS分析の代表的な結果を図2Aに示し、ゲーティング戦略と各マーカーに対して陽性の細胞の割合を強調しています。分析には、上皮細胞 (EpCAM)、内皮細胞 (CD31)、免疫細胞 (CD45)、および活性化線維芽細胞 (CD90) のマーカーが含まれていました。この結果は、細胞が上皮、内皮、または免疫細胞マーカーに対してほとんど陰性であり、CAF活性化のマーカーと考えられているCD90に対してさまざまな陽性を示したため、純粋な線維芽細胞の単離が成功したことを確認しています35,36。多くの場合、特に初期継代では、図2Bに示すように、CAFはNFと比較してより紡錘体のような形態を示しました。しかし、これらの形態学的違いは、その後のパッセージで減少する傾向がありました。

DU145細胞増殖に対するCAFおよびNFの効果を評価するために、増殖アッセイは、PCa細胞をCAF/NFペアのconCMで処理するか(図3A、B)、またはPCa細胞と線維芽細胞を1:3の比率で共プレーティングするか(図3C、D)。生細胞分析装置オレンジフィルターで特異的に検出できる蛍光RFP-DU145細胞を使用することで、2つの細胞タイプを区別することができました。示された実験は、同じ患者に由来するCAFとNFを使用して実行されました。どちらのアプローチも、線維芽細胞の増殖促進活性を実証する可能性があります。ただし、CAFとNFの違いは、グラフに明確に示されているように、主にconCMアプローチで明らかでした(図3B、D)。異なるCAF/NFペアからのconCMのさまざまな効果を 図3Eに示します。

アンカレッジに依存しない成長は、転移能力の代用としてよく考えられる特徴です。PCa細胞の固定非依存性増殖に対するCAF/NFの効果を評価するいくつかの方法の中で、線維芽細胞と腫瘍細胞を直接接触せずに共培養することによって最良の結果が得られました。線維芽細胞を12ウェルプレートに播種し、cDMEM中の0.9%軟寒天培地の層で覆い、その上に0.45%軟寒天培地cDMEM中の腫瘍細胞を層状にしました。コロニー形成は12日間にわたって監視されました。得られたDU145コロニーの代表的な画像を、さまざまなサイズのコロニー数を分析した対応するグラフとともに、 図4Aに示します。注目すべきは、CAFとNFの両方が、線維芽細胞フィーダー層なしでプレーティングされた対照細胞と比較して、DU145細胞のコロニー形成能力を同様に刺激することができたことです。コロニーも大きくなる傾向があり、増殖の増加を示唆しています。このアッセイで時折遭遇する問題の1つは、おそらくプレーティング時の軟寒天の密度または温度が正しくないことが原因で、線維芽細胞層の早期剥離です。これらの場合、実験は中止されました(図4B)。

&E凍結切片を表しています

著者らは、競合する利益はないと宣言している。