方法論記事

ロングリードシーケンシング技術を用いたアンプリコンシーケンシング

DOI：

10.3791/68370

⸱

2025年8月29日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Science and Innovation - National Research Foundation Centre of Excellence for Biomedical Tuberculosis Research, South African Medical Research Council Centre for Tuberculosis Research, Division of Molecular Biology and Human Genetics, Faculty of Medicine and Health Sciences, Stellenbosch University

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、ロングリードシーケンシングプラットフォームを使用して結 核菌 の18の薬剤耐性領域のターゲットディープシーケンシングに最適化され、その後、ロングリードデータ用に設計された結核固有のバイオインフォマティクスパイプラインで分析されました。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

世界保健機関 (WHO) は、結核 (TB) および薬剤耐性結核 (DR-TB) の迅速で費用対効果が高く、使いやすい診断方法の緊急の必要性を強調し続けています。WHO によって承認された次世代シーケンシング (NGS) 技術により、DR-TB の検出が大幅に改善されました。このうち、標的NGS(tNGS)は、薬剤耐性に関連する遺伝子変異を集中的に検出できるため、従来の培養ベースの診断が不要になります。広く使用されている tNGS アッセイの 1 つは、迅速かつ包括的な薬剤感受性試験を提供しますが、主に高精度のシーケンシングプラットフォーム向けに最適化されています。しかし、これらのシーケンス システムのコストが高いため、低所得国および中所得国、特にアフリカ全土でのアクセスが制限されています。ポータブル シーケンス技術は、柔軟性とインフラストラクチャ要件の軽減を提供する有望な代替手段を提供します。この研究では、リファンピシン耐性結核(RR-TB)分離株からDNAを抽出し、tNGSアッセイを使用して増幅し、ポータブルシーケンシングプラットフォームで配列決定しました。同じ増幅産物も、リファレンスとして機能するために、高精度のショートリードシーケンシングプラットフォームでシーケンスされました。ポータブルシーケンサーからのデータは、ロングリードシーケンシング用に設計されたバイオインフォマティクスパイプラインを使用して処理され、ショートリードシーケンシングデータは確立されたWebベースのアプリケーションを使用して分析されました。分析の結果、ロングリードシーケンシングアプローチは、ショートリードシーケンシングで検出された高周波耐性関連バリアントの同定に成功したが、低周波バリアントの検出には限界があることが示されました。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

結核 (TB) は引き続き世界的に主要な死亡原因であり、特に低所得国および中所得国において継続的な公衆衛生上の課題となっています 1,2。結核対策の強化を目的とした取り組みにもかかわらず、迅速、正確、費用対効果が高く、包括的な診断技術を実現することが困難であることもあって、進歩は遅れています 3,4,5。ラインプローブアッセイ(LPA)や自動核酸増幅検査(NAAT)などの分子診断法は、結核や薬剤耐性結核(DR-TB)の同定を加速させてきましたが、それらの限られた変異検出により、徹底的な薬剤感受性試験(DST)が制限されています。この制限は、結核の負担の高い国で特に重要です 6,7,8,9。

これらの制限に対処するために、世界保健機関 (WHO) は、結核の監視と耐性検出のための強力なツールとして浮上した次世代シーケンシング (NGS) 技術の使用を推奨しています10,11。全ゲノム配列決定(WGS)と標的NGS(tNGS)アプローチはどちらも、より広い変異カバレッジを提供し、複数の薬物にわたる耐性関連バリアントの同定を可能にします8,12,13,14,15。全ゲノム配列決定(WGS)は包括的なDSTレポートを提供するが、培養に最大6週間かかる可能性があるため、培養に依存しているため、迅速な診断には適していない15、16、17。標的NGSは、培養に依存しないため、より良い代替手段を提供します。シーケンシングは、臨床検体から直接実行することができます18。その結果、WHO は DST に 3 つの tNGS アッセイの使用を推奨しています。Deeplex Myc-TB アッセイ: このアッセイは、リファンピシン、イソニアジド、フルオロキノロン、アミノグリコシド (アミカシン、カナマイシン、カプレオマイシン)、エタンブトール、ピラジナミド、およびエチオナミドに対する耐性を検出します 19,20,21。センチネル結核アッセイ:これは、リファンピシン、イソニアジド、フルオロキノロン、および二次注射薬に対する耐性を対象としています18,20。AQ-TB アッセイ: これは、リファンピシン、イソニアジド、フルオロキノロン、および二次注射薬に対する耐性を特定します。これらのアッセイは、その高精度により、ショートリードプラットフォームでの使用に最適化されています20。一方、ONT MinION ロングリード プラットフォームは、リアルタイム データ、移植性、および費用対効果の高い実装の可能性を提供します22,23。しかし、NGSの広範な使用は、特にショートリードシステム10では、インフラストラクチャとコストの要求によって制限されます。

Deeplexアッセイは、推奨される3つのアッセイの中で最も包括的です。このアッセイはもともと、13 種類の抗結核薬に対する耐性に関連する 18 の領域でマルチプレックス PCR を実行するように設計されました。しかし、WHOは10種類の抗結核薬に推奨しており、十分な感度と特異性を示しています。この研究では、ロングリードシーケンシングプラットフォームであるONT MK1B MinIONでの使用に最適化されました。このプラットフォームのポータブルで再利用可能なフローセルシステムは、インフラストラクチャとサンプルあたりの潜在的なシーケンスコストの両方を削減します4,22,23。他のロングリード適合アッセイが開発されていますが、DSTの範囲は限られている傾向があり、通常は狭い範囲の耐性遺伝子のみを標的としています。対照的に、このアッセイは幅広い標的範囲を提供するため、分散型 DST24,25 のより包括的な診断ツールとなります。アッセイによって増幅されたゲノム標的およびそれに対応する薬物関連の詳細なリストを表1に示し、アッセイの診断能力を強調しています25。

DNA抽出の前に、必要な安全対策25、26、27に従って、サンプルをバイオセーフティレベル3(BSL-3)条件下で除染および不活化する必要があります。内部増幅と外部コントロールを各実行に組み込む必要があり、汚染はネガティブコントロールと定期的な実験室評価を通じて追跡されます25。リード深度、カバレッジの幅、増幅の成功などの重要な品質指標は、シーケンシング後に評価する必要があります。標的シーケンシングの場合、WHOは、各アンプリコンの最小読み取り深度を100倍にし、すべての標的薬剤耐性領域を適切にカバーして、≥5%28に存在するマイナーバリアントを検出できるように勧告しています。世界保健機関は、品質保証システムが確立され、すべての標的領域が十分にカバーされていることを前提として、第一選択および第二選択薬に対する耐性を特定するためのこれらの標的配列決定法を承認しています28。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、2021年10月20日にステレンボッシュ大学のヒト研究倫理委員会(HREC)から倫理的承認を受けたTS ELiOTプロジェクトの一環として実施されました(N21/09/093)。さらに、西ケープ州保健研究局から政府施設の使用許可も取得した。サンプルは、NHLS グリーン ポイントおよびステレンボッシュ大学との共同作業を通じて、SU HREC 承認番号 N09/11/296 に基づいて収集されました。使用する試薬と機器は 、材料表に記載されています。

1. サンプル調製

  1. 熱不活化
    1. MGIT培養物を80°Cで1時間インキュベートし、BSL-3条件下で完全な熱不活化を実現します。
    2. InstaGene法29を使用してDNA抽出を進めます。
  2. DNA抽出
    1. 5 mLの熱不活化MGIT培養物を15 mLチューブに入れます。
    2. 室温(RT)で4000 x g で30分間遠心分離します。
    3. 沈殿物を残してピペッティングして上清を慎重に取り除きます。
    4. 200 μLのキレート化ベースのDNA抽出試薬を沈殿物に加え、56°Cで15分間インキュベートします。
    5. 溶液を2 mLのスクリューキャップチューブに移し、それぞれに直径2 mmのガラスビーズを3個加えます。
    6. 10秒間ボルテックスして細胞を拡散させ、チューブを100°Cのドライバスインキュベーターに8分間置きます。
    7. ビードビートホモジナイザーを使用して、サンプルを次の設定で均質化します:4.0 m / sで20秒の3サイクル。
    8. RTで12,000 x g で15分間遠心分離し、沈殿物や破片を避けながら、130 μLの上清(DNA含有液体)を1.5 mLチューブに慎重に移します。
    9. フリックまたはボルテックスによってビーズを再懸濁し、抽出したDNAが入った1.5 mLチューブに156 μLのビーズを加えます。
    10. ゆっくりと上下にピペットを10回上下に移動させて混合し、RTで5分間インキュベートします。
    11. チューブを磁気ラックに5分間置き、DNA結合ビーズを分離します。
      注:透明な上清は、磁石に面したチューブの側面にある暗い磁気ビーズのコンパクトなペレットの上に現れ、上清除去の準備ができていることを示します。
    12. ビーズを乱さずに上清をピペットで取り除きます。
    13. ラックに置いた状態で、調製したばかりの80%エタノール100 μLをビーズペレットに加え、30秒間放置してから、エタノールを除去します。洗浄手順を繰り返します。
    14. ビーズペレットを室温で5分間自然乾燥させます。次のステップに進む前に、ビーズペレットがつや消しで、目に見える液体が残っていないことを確認してください。
    15. 磁気ラックからチューブを取り外します。
    16. 25 μLのヌクレアーゼフリーウォーター(NFW)を乾燥ビーズに直接加え、上下に10回穏やかにピペッティングして再懸濁します。
    17. RTで5分間インキュベートします。
    18. チューブを磁気ラックに戻してさらに5分間。
    19. 溶出したDNA(上清)を新しい1.5mLチューブに慎重に移します。
    20. 高感度蛍光ベースのdsDNA定量試薬を使用してDNA濃度を測定します。
      注:DNAは-20°Cの冷凍庫に保存するか、PCRを続行できます。
  3. 増幅(PCR)
    1. 製造元の指示に従って、マルチプレックスPCRおよびPCR後のクリーンアップ25.
    2. 高感度蛍光ベースのdsDNA定量試薬を使用してDNA濃度を測定します。
  4. 電気泳動
    1. アガロース粉末を1x TAEバッファーにマイクロ波加熱で完全に溶けるまで溶解し、2%アガロースゲルを調製します。
    2. 溶融したアガロースに5 μLの無毒蛍光DNAゲル染色剤を加え、完全に混合します。
    3. ゲル混合物を櫛が取り付けられたゲルキャスティングトレイに注ぎ、ウェルを形成します。
    4. ゲルをRTで固化させます。
    5. 固化したら、コームを取り外し、1x TAEバッファーで満たされた電気泳動タンクにゲルトレイを置きます。
    6. 5 μLのローディングバッファーと混合した5 μLのkb DNAラダーを最初のウェルにロードします。
    7. PCR産物ごとに、5 μLの産物と5 μLのローディングバッファーを混合し、個々のウェルにロードします。
    8. ゲルを100Vで1時間実行します。
    9. 透過照明を備えたゲルドキュメンテーションシステムを使用してDNAバンドを視覚化します。

2. ONTライブラリーの調製

  1. エンドプレップ
    1. 濃度に基づいて各アンプリコンサンプルの100 ngを計算し、必要な量をクリーンなPCRチューブに移します。
    2. 特定のサンプル中のアンプリコンの総質量(ng)を計算するには、品質管理(QC)後にサンプルの濃度(ng / μL)に残りの体積(μL)を掛けます。
      注:たとえば、サンプルの濃度が2 ng / μLで、QC後の残量が1 μLの場合、アンプリコンの総質量は次のようになります。
      総質量 = 2 ng/μL × 1 μL = 45 ng
      シーケンシング用に10 ngのアンプリコンを調製するには、希釈式を使用します。
      C1V1 = C2V2
      ここで、C1 = 45 ng、V1 = 不明、C2 = 10 ng、V2 = 1 μL、V1 = (C2 × V2) / C1 = (10 ng × 1 μL) / 45 ng = μL
      したがって、最初のアンプリコンサンプルのμLを使用して、シーケンシング用の10 ngのDNAを取得する必要があります。
    3. NFWを使用して、各サンプルの総容量を12.5 μLに調整します。
    4. ピペッティングを上下に10回、短時間回転させてサンプルを穏やかに混合します。
    5. 1.75 μLのエンドリペアおよびAテール反応バッファーと0.75 μLのエンドリペアおよびAテール酵素混合物を各サンプルに加えます。
    6. 上下に10回ピペッティングしてよく混合し、短時間スピンダウンします。
    7. チューブをサーモサイクラーで25°Cで30分間インキュベートし、続いて65°Cで30分間インキュベートします。
      注:この段階で、ユーザーがプロセスを中止することを決定した場合は、エンドプレッパされたDNAの精製にビーズを利用することをお勧めします。精製されたDNAは、4°Cで最大7日間保存できます。
  2. ネイティブバーコードライゲーション
    1. 製造元の指示に従って、DNA精製とサイズ選択、常磁性DNAクリーンアップビーズ、EDTA、およびネイティブバーコード(NB01-96)用の磁気ビーズを解凍して準備し、氷の上に置きます。
    2. 新しいPCRチューブに、2.75 μLのヌクレアーゼフリー水、1 μLのエンドプレパップDNA、1.25 μLのネイティブバーコード(NB01-96)、および5 μLのDNAライゲーション酵素ミックスを順番に加えます。
    3. 各反応を10回穏やかにピペッティングして混合し、微量遠心分離機を使用して短時間回転させ、RTで20分間インキュベートします。
    4. 各ウェルに1 μLのEDTAを加え、ピペッティングで完全に混合し、短時間回転させます。
    5. プールバーコードで埋め込まれたサンプルを1.5 mLの微量遠心チューブに入れます。
    6. ボルテックスによってDNAクリーンアップビーズを再懸濁し、プールされたサンプルの総量の0.7倍を追加します(たとえば、総容量が253 μLの23サンプルの場合、177.1 μLビーズを追加します)。
    7. ピペッティングによって溶液を混合し、HulaMixerでRTで10分間インキュベートします。
    8. 1600 μLの純粋なエタノールと400 μLのNFWを混合して、2 mLの80%エタノールを調製します。
    9. 溶出液が透明で無色になるまで、チューブを磁気ラックに5分間置きます。
    10. ペレットを乱すことなく上清を取り除き、廃棄します。
    11. ペレットを乱すことなく、700 μLの新たに調製した80%エタノールでビーズを洗浄し、エタノールを除去して廃棄します。
    12. エタノール洗浄ステップを繰り返します。
    13. チューブを短時間遠心分離し、磁気ラックに戻し、残留エタノールを除去します。
    14. ビーズを30秒間自然乾燥させます。
    15. チューブを磁気ラックから取り外し、ビーズを35 μLのヌクレアーゼフリー水に軽くフリックして再懸濁し、37°Cで10分間インキュベートします。
    16. 溶出液が透明で無色になるまで、チューブを磁気ラックに戻します。
    17. 35 μLの溶出液を清潔な1.5 mL微量遠心チューブに移し、後続のステップを行います。
      注:この段階では、ライブラリは4°Cで一晩保存できます。
  3. アダプターの結紮とクリーンアップ
    1. 製造元の指示に従って迅速DNAライゲーション試薬キットを準備し、氷の上に置きます。
    2. ネイティブアダプター(NA)とクイックリガーゼをピペッティングで混合し、氷の上に置きます。
    3. 溶出バッファー(EB)をRT、ボルテックス、遠心分離機で解凍し、氷の上に置きます。
    4. ショートフラグメントバッファー(SFB)をRT、ボルテックス、遠心分離機で解凍し、氷上に置きます。
    5. 1.5 mLの低結合マイクロ遠心チューブで、30 μLのプールされたバーコードサンプル、5 μLのネイティブアダプター(NA)、10 μLの迅速ライゲーション反応バッファー、および5 μLの速効型T4 DNAリガーゼを混合します。
    6. 穏やかにピペットで混合し、短時間遠心分離し、RTで20分間インキュベートします。
    7. ボルテックスによってDNAクリーンアップビーズを再懸濁し、反応に20 μL(0.4倍)のビーズを加えます。
    8. ピペッティングで穏やかに混合し、HulaMixerでRTで10分間インキュベートします。
    9. 磁気ラック上でビーズをペレット化し、ペレットを乱すことなく上清を吸引します。
    10. 125 μLのショートフラグメントバッファー(SFB)を加えてビーズを洗浄し、フリックで再懸濁し、短時間遠心分離して、磁気ラックに戻します。
    11. ビーズをペレット化し、上清を吸引します。洗浄手順を一度繰り返します。
    12. 短時間遠心分離し、チューブを磁気ラックに戻し、残留上清を吸引します。
    13. チューブを磁気ラックから取り外し、ビーズを15 μLの溶出バッファー(EB)に再懸濁します。
    14. 短時間遠心分離し、37°Cで10分間インキュベートしてDNAを溶出します。
    15. チューブを磁気ラックに置き、溶出液が透明で無色になるまでビーズをペレット化し、15 μLの溶出液をきれいな1.5 mL微量遠心チューブに吸引します。
    16. 1 μLの溶出液を定量します。
    17. ライブラリを20 fmolに希釈し(NEB計算機を使用して計算)、調製した20 fmolライブラリの12 μLをR10.4.1フローセルでのシーケンスに使用します。
      注:ライブラリは-20°Cで保存できるため、繰り返し使用できます。
  4. ナノポアシーケンシングフローセルのプライミングとローディング
    1. シーケンシングバッファー(SB)、ライブラリビーズ(LIB)、フローセルテザー(FCT)、およびフローセルフラッシュ(FCF)をRTで解凍し、ボルテックスで混合し、スピンダウンします。
    2. 5 μLのウシ血清アルブミン(BSA、50 mg/mL)、30 μLのフローセルテザー(FCT)、および1170 μLのフローセルフラッシュ(FCF)を混合し、反転およびピペッティングによって溶液を混合して、フローセルプライミングミックスを調製します。
    3. フローセルのプライミングポートを開き、~20 μLのバッファーを吸引して気泡を除去し、気泡を導入せずにプライミングミックス800 μLをプライミングポートにロードし、5分間待ちます。
    4. 37.5 μLのシーケンシングバッファー(SB)、25.5 μLのライブラリビーズ(LIB)またはライブラリ溶液(LIS)、および12 μLの20 fmol DNAライブラリーを1.5 mLの微量遠心チューブに混合し、ピペッティングで完全に混合してライブラリを調製します。
    5. フローセルのサンプルポートキャップをそっと持ち上げ、気泡を発生させずにプライミングポートにプライミングミックス200 μLをロードし、ライブラリをロードする準備をして、フローセルを再度プライミングします。
    6. 調製したライブラリーをピペッティングして穏やかに混合し、75 μLのライブラリーをシーケンシングフローセルサンプルポートに滴下し、次のドロップを追加する前に各ドロップがポートに流れ込むようにします。
    7. フローセルのサンプルポートキャップを閉じ、栓がフローセルのサンプルポートに入ることを確認してから、プライミングポートを閉じます。
    8. ポータブルシーケンシングデバイスをコンピュータ(無停電電源装置付き)に接続し、シーケンシングデバイスの制御および解析ソフトウェアを使用してシーケンシングを開始します。
  5. ソフトウェアパラメータ
    注: ONT によって開発されたこのソフトウェア アプリケーションは、シーケンス実行の包括的な管理と詳細なレポートの生成に利用されます。
    1. シーケンスプロセスを開始するには、[ 開始 ]オプションを選択し、次に[ シーケンスの開始]を選択してください。
      注: 次に、ファイル ストレージ用のフォルダーを指定し、シーケンス実行の名前 ("sequencing_run_1" など) を指定するように求められます。その後、[ 設定に進む] をクリックして、 library-sequencing-amplicons-native-barcoding-v14-sqk-nbd114-96などの適切なキット名を選択し、目的の実行時間(たとえば20時間(最大実行時間は72時間))をカスタマイズします。
    2. 次に、生出力読み取り用の POD5 やベースコール出力用の FASTQ などのオプションから選択して、出力ファイルの種類を選択します。続いて、FAST-Basecalling モデルを選択します。
    3. デフォルト設定には、1.5時間ごとに頻繁に細孔スキャンを行うこと、最小リード長200 bp、および最小品質スコア8が含まれることに注意してください。最後に、設定を確認し、読み取りプロセスを開始します。

3. 配列決定後の分析

  1. システム要件
    注:ONT-TB-NFパイプラインを使用して環境を設定し、 結核菌 アンプリコンシーケンスデータを分析するためのガイド。この手順は、Windows (WSL 経由 ) と macOS の両方のユーザーに対応しています。
    1. 以下を使用します - オペレーティングシステム: Windows 10/11 (WSL2 を使用) または macOS。メモリ:最小8 GBのRAM(16 GBを推奨);ストレージ: 少なくとも 50 GB の空きディスク容量。インターネット: パッケージとデータのダウンロードに必要です。権限: ソフトウェアをインストールし、環境を管理する機能。
  2. 次の環境設定を確認します: Windows ユーザー (WSL2 を使用)。WSL2 を有効にします。
    1. PowerShell を管理者として開き、wsl - install を実行します。
    2. プロンプトが表示されたら、コンピュータを再起動します。
  3. Ubuntuをインストールする
    1. 再起動後、 Microsoft Store を起動し、 Ubuntu を検索して、希望のバージョン (Ubuntu 22.04 LTS など) をインストールします。
    2. [ スタート ]メニューからUbuntuを起動します。
    3. プロンプトが表示されたら、新しい UNIX ユーザー名とパスワードを作成します。
    4. パッケージの更新リスト: sudo apt update &; sudo apt upgrade -y。
  4. macOSユーザー
    1. Homebrew をインストールします (まだインストールされていない場合): /bin/bash -c "$(curl -fsSL https://raw.githubusercontent.com/Homebrew/install/HEAD/install.sh)"。
    2. 必要なパッケージをインストールします: brew install git wget
  5. CondaまたはMambaのインストール
    1. Minicondaのダウンロードページにアクセスして、オペレーティングシステムに適したインストーラーをダウンロードします。
    2. Miniconda をインストールするには、インストーラーを実行し、画面上の指示に従います。インストールが完了したら、端末を再起動してください。
    3. Conda チャネルの設定:
      conda config --add channels defaults (英語)
      conda config --add channels bioconda
      conda config --add channels conda-forge
    4. Mambaforge (Mamba) のインストール
      Linuxの場合:
      wget
      https://github.com/conda-forge/miniforge/releases/latest/download/Mambaforge-Linux-x86_64.sh
      macOS の場合:
      wget https://github.com/conda-forge/miniforge/releases/latest/download/Mambaforge-MacOSX-arm64.sh
    5. Mambaforgeのインストール:bash Mambaforge-*.sh
    6. プロンプトに従ってインストールを完了し、ターミナルを再起動して Mamba をアクティブ化します。
  6. ONT-TB-NF パイプラインの設定
    1. 新しいConda環境を作成する: conda create -n ont_tb_env samtools=1.15.1 minimap2=2.24 nanoplot=1.40.2 mosdepth=0.3.3 flye=2.9.1 nanofilt fastqc bedtools -c bioconda
    2. または、マンバを使用します: mamba create -n ont_tb_env samtools=1.15.1 minimap2=2.24 nanoplot=1.40.2 mosdepth=0.3.3 flye=2.9.1 nanofilt fastqc bedtools -c bioconda
    3. 環境をアクティブ化する: conda activate ont_tb_env
    4. Nextflowのインストール:curl -s https://get.nextflow.io |bash、sudo mv nextflow /usr/local/bin/
    5. ONT-TB-NF リポジトリのクローン: git clone https://github.com/HKU-BAL/ONT-TB-NF.git
      cd ONT-TB-NF
    6. 必要な Docker イメージをプルする (Docker を使用している場合)
      dockerプルhkubal / clair3:v0.1-r12
      docker pull quay.io/biocontainers/tb-profiler:4.3.0--pypyh5e36f6f_0
  7. パイプラインの実行
    1. 次のコマンドを使用して、各サンプルの Basecalled FASTQ ファイルを個別に連結します。
      猫 *.fastq.gz > concatenated.fastq.gz
      nextflow run run_tb_amplicon.nf \
      read_fq /パス/宛先/concatenated.fastq.gz \
      sample_name SAMPLE_ID \
      amplicon_bed /path/to/amplicon_regions.bed \
      スレッド 16 \
      output_dir /絶対/パス/to/output_directory
  8. 出力ファイルと解釈
    1. 実行が成功したら、パイプラインが指定された出力ディレクトリに次の出力を生成することを確認します。
      1. 整列読み取り: *.bam ファイル。
      2. バリアント呼び出し: *.vcf SNP とインデルを含むファイル。
      3. サマリーレポート:薬剤耐性変異およびその他の関連指標を要約した*.csvまたは*.tsvファイル。
      4. 品質管理レポート:MultiQCなどのツールによって生成された*.htmLファイル。
      5. ログ: パイプライン実行の詳細なログ。
      6. 中間ファイル: work/ ディレクトリに保存されます (正常に実行された後、削除できます)。
        注: 権限エラーが発生した場合は、ファイルの読み取りと書き込み、およびスクリプトの実行に必要な権限を持っていることを確認することが重要です。環境問題については、パイプラインを実行する前に、適切なConda環境が有効になっていることを確認してください。Docker プロファイルを利用する場合は、Docker がインストールされ、動作していることを確認することが不可欠です。さらに、実行中のメモリやストレージの制限を回避するために、システム リソースを注意深く監視する必要があります。これらの方法論の概要を 図1に示します。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

選択したDNA抽出方法は、他の迅速な技術と比較して効率と優れた収率のために選択されました。高品質のゲノムDNA(gDNA)を一貫して生成し、ビーズベースのクリーンアップステップを統合することで、サンプルあたりのコストを削減しながら処理時間を最小限に抑えることができました。これは、蛍光光度測定を唯一のDNA定量ツールとして使用して、分光光度測定などの追加の品質管理評価の必要性を排除することによって達成されました。PCR後の濃度は、ショートリードプラットフォームとロングリードプラットフォームの両方でのシーケンシングに最適であることがわかりました(表2)。アンプリコンの完全性は、アガロースゲル電気泳動によるフラグメント分析によってさらに確認されました(図2)。ただし、表2と図2の両方に反映されているように、分離株89および136はアンプリコ...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ロングリードシーケンシングプラットフォームは、この研究で顕著な利点、特に一貫して高いカバレッジ幅で迅速なシーケンシングを実現する能力を実証しました。配列決定に成功したすべての分離株で、99.9%のカバレッジ幅が達成され、耐性関連ゲノム領域がほぼ完全に表現されていることを示しています。すべての標的遺伝子の平均カバレッジ深度は4462倍で、 eis 遺伝子が22,242.08倍で最も深くなり、 rrs 遺伝子が99.46倍で最も低かった。これらの値は、信頼性の高い薬剤耐性予測のための十分なデータを生成するプラットフォームの能力を反映しています4。

DNA抽出から結果生成までのワークフローは、休憩を除いて36時間以内に完了し、ショートリードシーケンシングのターンアラウンドタイムと互換性がありました4,23。この合理化された...

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謝辞

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重要なリソースと施設を提供してくださったステレンボッシュ大学のSAMRC結核センターに心から感謝の意を表したいと思います。また、この研究に不可欠なサンプルを提供してくれたTS ELiOT研究にも深く感謝しています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
15mLと1.5 mLまたは2 mL Lo結合チューブエッペンドルフEP0030108051-250EA
1KBラダーサーモフィッシャー・サイエンティフィックSM0311
2 mL スクリューキャップ チューブサイエンティフィック・スペシャリティズ社P2TUB056C-0001.5ST
2mmの滅菌ガラスビーズシグマ・オルドリッチZ273627-1EA
AMPure XPビーズベックマン・コルターA63881
Deeplex Myc-TB ジェノスクリーン20090205
電気泳動チャンバーサーモフィッシャー・サイエンティフィックA25977
エチルアルコール、純粋シグマ・オルドリッチE7023-500ML
FastPrep ホモジナイザーMPバイオメディカル116005500
フィルターピペットの先端(10 & micro;L) バイオスマートサイエンティフィックFT-10-R
フィルターピペットの先端(1000 & micro;L) バイオスマートサイエンティフィックFT-1000-R
フィルターピペットの先端(20 & micro;L) バイオスマートサイエンティフィックFT-20-R
フィルターピペットの先端(200 & micro;L) バイオスマートサイエンティフィックFT-200-R
Flow-cell オックスフォード・ナノポール・テクノロジーズFLO-MIN114
加熱ブロックエッペンドルフ5382000031
インスタジーンマトリックスバイオ・ラッドBBRD7326030
磁気ラック サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック 12321D
マイクロ遠心分離機エッペンドルフ 5406000046
ミニオンオックスフォード・ナノポール・テクノロジーズMK1B
ネイティブバーコーディングキット V14 オックスフォード・ナノポール・テクノロジーズSQK-NBD114.24
NEB Blunt/TA Ligase マスターミックスNEBM0367
NEBNextクイックリゲーションモジュールNEBE6056
NEBNext Ultra II エンド修理/dAテールモジュールNEBE7546
ヌクレアーゼフリー水(NFW)サーモフィッシャー・サイエンティフィックAM9937
ピペット(P10、P20、P200、P1000)エッペンドルフEP3123000918-1EA
量子ビットアッセイチューブサーモフィッシャー・サイエンティフィックQ32856
Qubit dsDNA HSアッセイキットサーモフィッシャー・サイエンティフィックQ33231
量子ビットフルオロメーターサーモフィッシャー・サイエンティフィックQ33226
SYBR Safe DNAゲル株サーモフィッシャー・サイエンティフィックS33102
ウルトラピュアアガロースサーモフィッシャー・サイエンティフィック17852
ユニバーサル・フードIIIトランスイルミネーター(分子イメージャーゲルドックXRシステム)バイオ・ラッド170-8170
ボルテックスミキサーラセックWMBB0L0E0216

参考文献

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