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方法論記事

光合成微生物とそのウイルスの環境サンプリング:フィールドからラボまで

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DOI：

10.3791/68379

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2025年7月3日

 , 
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Merced, 2Quantitative Systems Biology Program, University of California, Merced

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、シアノファージ(およびその宿主)を単離するための海洋および淡水生態系のユーフォティックゾーンからのサンプリング方法と、単一の遺伝子型を濃縮し、ウイルスと宿主の相互作用ダイナミクスを特徴付けるサンプリング後のプロセスについて説明します。

要約

光合成微生物とそのウイルスの環境サンプリングは、現代の海洋および淡水の生物多様性と生態系のダイナミクス、および気候変動関連要因(気温上昇や酸性化など)が種とコミュニティ構成の進化の軌跡に与える影響を理解する上で重要な役割を果たします。残念ながら、ウイルス球の多様性は、単一のユニバーサルサンプリングと実験ワークフローをサポートしていません。実際、各ウイルスシステムには独自の特徴があり、研究目標を達成するためにはウイルス学の標準プロトコルに修正を加える必要があります。ウイルスの発見と特性評価には、標的システムに固有のアプローチが必要ですが、すべてのウイルスについて、研究目的は似ています。ホスト範囲を決定します。生産的な感染を確認する。ウイルス、宿主、およびウイルス-宿主のダイナミクスを特徴付けます。ウイルス宿主システムの堅牢な記述は、形態、生理学、生化学、およびオミクスプロファイルの解明から成り立っています。さらなる情報は、感染の多様性、温度、pH、宿主スイッチ、指向性進化などの要因を変更することによってシステムを操作することによって、またはウイルス宿主系の応答を観察するための薬物を適用することによって得ることができる。私たちの研究室では、生命の領域(古細菌、細菌、真核生物)にわたるウイルスを研究しています。本報告では、シアノバクテリアのバクテリオファージ(すなわち、シアノファージ)の単離に焦点を当てて、淡水および海洋環境のユーフォトティックゾーンから光合成微生物をサンプリングする方法について詳しく説明します。シアノバクテリアは、これらの水生生態系における一次生産と栄養循環に不可欠なキーストーン種です。記載されているワークフローは、さまざまな深さでの水のサンプリングから、液体および固体培地培養、高度な分子/遺伝学的方法、および分析アプローチを使用したウイルス宿主システムの特徴の特性評価まで多岐にわたります。記載されている方法は、生命の領域を超えたウイルス宿主系におけるバクテリオファージおよびウイルスの発見に適応できます。

概要

シアノファージとその宿主の感染動態と進化的関係を特徴づけることは、海洋および淡水生態系の現在および将来の状態を理解するための鍵となります。高度なハイスループットシーケンシング技術と最新の分析方法により、シアノファージ(および宿主)ゲノムの迅速なシーケンシングが可能になり、ウイルスと宿主の関係を研究することができます1,2。ただし、ワークフローは、ウイルスとその宿主を分離および特定するための環境サンプリングから始まります3,4,5。ウイルス圏は多様であるため、すべてのウイルスとバクテリオファージをサンプリングして特性評価するための単一のプロトコルはありません。実際、各ウイルス宿主システムには独自の特性があります。それにもかかわらず、ベースラインの目標は、調査対象のウイルスシステムに関係なく似ています。ホスト範囲を決定します。1つ以上の宿主で生産的な感染を示す。定性的および定量的アプローチを使用して、ウイルス、宿主、およびウイルス-宿主感染のダイナミクスを特徴付けます。ウイルスシステムの高度な理解は、システムを攪乱することによって調べることができます。感染の多重度(MOI)6、温度、pH、宿主株などのパラメータを変更したり、薬剤の適用によってシステムの応答方法を決定したりすることで、ウイルスと宿主のダイナミクスの性質についてさらなる洞察を得ることができます。指向性進化などのより高度な操作は、システムの潜在的な進化の軌跡と、共進化のエンドポイントがより大きな微生物群集と生態系にどのように影響するかについての追加情報を提供できます。

この研究では、シアノバクテリアや微細藻類などの光合成微生物の環境サンプリングのためのモデル(ただし、容易に適応可能な)プロトコルを提示します。これらは、海洋、淡水、およびその他の水生生態系における栄養素循環と一次生産に重要な役割を果たします7,8,9,10,11 .このワークフローは、海洋および淡水環境のユーフォトティックゾーンと、これらの生態系の主要な推進力であるウイルスとバクテリオファージから宿主を分離することに焦点を当てています12。ウイルスとバクテリオファージはどちらも、真核生物と原核生物の両方の個体群構造に影響を及ぼし、生態系の多様性と生産性に大きく影響します13。したがって、ここでの目標は、単一ウイルス/単一ホスト、マルチウイルス/単一ホスト、単一ウイルス/マルチホスト、およびマルチウイルス/マルチホストのダイナミクスを調査するためのホストとウイルスの濃縮を容易にするサンプリングプロトコルとサンプリング後のワークフローを提供することです。-ウイルス-宿主感染動態の根底にあるオミクス基質。そして、研究中のウイルス-宿主システム、およびウイルスと宿主が抽出されたより大きな生態系に影響を与える可能性のある共進化の軌跡と進化のエンドポイント。

具体的には、環境サンプリング、サンプルのフィールド前処理(つまり、ラボに到達する前)、バクテリオファージ(およびウイルス)の単離のための後処理、許容宿主の特定に向けた微生物の混合種培養の濃縮、推定宿主の単一コロニー分離株の開発、真正性の確認のためのワークフローについて説明しますウイルスと宿主の関係(すなわち、生産感染)、および基本的な感染特性(例えば、病原性)の特徴付け。感染アッセイは、相対病原性(VR)14および宿主レジリエンス(RR)15の計算を可能にするだけでなく、観察された生理学(すなわち、ウイルスと宿主の相互作用ダイナミクス)の根底にあるオミクス基質を調査するための重要な時点で培養サンプルを抽出するステップも含みます。最後に、潜在的な落とし穴、トラブルシューティング、解決策、および特定の分類群を対象とするように選択した手順を変更する方法について説明します。このワークフローは、シアノファージ-シアノバクテリア、フィコドナウイルス-微細藻類、および好熱性フセロウイルス-古細菌系16,17に適用でき、生命の3つのドメイン(細菌、真核生物、古細菌)すべてにわたるウイルスの特性評価における有用性を実証しています。

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プロトコル

1. 環境サンプリング

注:このプロトコルは、南カリフォルニア沖の海岸線から5マイル以内のユーフォトティックゾーンからの光合成微生物のオフショアサンプリングについて説明しています。ただし、このプロトコルは、湖沼、凍った湖、または地熱温泉からのサンプルに適応しています(図1)。

  1. 南カリフォルニアの海岸線に沿った沖合の環境サンプリング
    注:デュアル150馬力の船外機を備えた6mのディープVセンターコンソール船(つまり、ボート)には、研究機器が搭載されていました(資料の表)。3つのサイトがユーフォトティックゾーンサンプリングのために選択されました:(a)サイト1:N 30° 15.436、W 117° 31.551;(b) サイト2:北緯33度12.521度、西経117度25.275。(c)サイト3:N 32° 59.914、W 117°17.058。各サイトでは、20 Lの水サンプルが正午に各サイトの3つの異なる深さから抽出されました:< 3 m(表面サンプル)、6 m、および14 m。
    1. トランスファーポンプアセンブリ:各サンプルサイトに到着したら、ボートアンカーを展開し、ナビゲーションシステムからGPS座標を記録します。サンプリング・システムを組み立てます。
      1. 簡単に言うと、内径2.54cmのフレックスプラスブルーPVCチューブ(50フィート)の一端を2.54cmのサクションストレーナーに取り付けて、大きな破片がポンプシステムに侵入するのを防ぎます。ストレーナとチューブの接合部をダクトテープで固定します。チューブの反対側の端を1 hpのステンレス鋼トランスファーポンプのインテークマニホールドに取り付けます。
      2. 内径 10 cm 2.54 cm の折りたたみにくいゴム製フレックスホースのセクションをポンプの出口に取り付けます。トランスファーポンプの電気コードをガス駆動の3800Wインバーター発電機に差し込みます。組み立てが完了したら、トランスファーポンプをプライミングし、ポンプシステムが動作していることを確認するためのテストを行います(図1、上段)。
    2. トランスファーチューブのウェイト付け:長さ25 m、直径1.25 cmのナイロンマリンロープの一端を14 kgのマッシュルームアンカーのアイレットに固定します。ダクトテープを使用して、ダクトテープを使用してロープを青いPVCチューブに固定し、吸引ストレーナーをアンカーの約1m上にセットして、ストレーナが砂に詰まったり、水中の岩にぶつかったりしないようにします。アンカーを使用してトランスファーチューブ(青色のPVCチューブ)を水没させ、ボートとチューブの間に大きな角度を作り出す強い底流を避けますamp不正確なサンプル深度が得られます。アンカー/ロープとチューブアセンブリを深さまで下げます。
    3. 海水サンプルの抽出:ストレーナ付きのチューブチップが目的の深さになったら、発電機とポンプの電源を入れます。ポンプを再プライミングするか、トランスファーチューブを振って、水が深部からポンプを開始するようにします。水が着実に流れて深部から移動したら、1〜2本のチューブを海に排出して、目的の深さからの水がポンプを通って流れるようにします。20 Lの水差しで水サンプルを採取します(図1、上段、右端)。
    4. フィールドステーションへのサンプル輸送:20 Lの水差しを約18 Lに充填して、輸送中に水サンプルとヘッドスペース間のガス交換(O2/CO2など)を可能にします。ウォータージョグをキャッピングする前に、原水サンプルから温度、pH、および塩分を記録します。次に、サブデッキストレージの氷床に水差しをキャップして置き、日光や高温に過度にさらされないようにライトシートで覆います。
  2. 水サンプルのフィールド前処理
    注:陸上施設(ホテルの部屋/会議室/フィールドステーションなど)に到着すると、水サンプル内の微生物含有量を保護し、粒子サイズに基づいて海水サンプルのさまざまな画分を分離するための一連の前処理手順が行われました。
    1. ろ過システムの組み立て:長さ1mの9.525mmID透明ビニールチューブの一端を、ポータブルエアダイヤフラム真空ポンプの真空ポートのホースバーブインレットに固定します。同じホースの反対側の端を1.0 L、0.45 μmフィルター真空カップアセンブリに固定します。0.45 μmと0.22 μmの両方のフィルターカップアセンブリを順番に使用して、以下に説明するように海水サンプルの異なる画分を分離します。
    2. システムの漏れやフィルターの欠陥/破れをテストするには、0.45μmのポリエーテルスルホン(PES)メンブレンフィルターカップを介して0.25Lの海水をろ過します。漏れのないシステムでは、海水サンプルが完全にろ過されると、フィルターとグレーティングの間の吸引が見られます。
    3. 0.45 μm PESメンブレンフィルターカップアッセンブリーによるろ過:光合成微生物(微細藻類やシアノバクテリアなど)を分離するために、2つの1 Lフィルターカップ(または4つの500 mLフィルターカップ)を使用して、0.45 μm PESメンブレンフィルターカップを介して2 Lの海水サンプルをろ過することが目標です。すべての濾液ボトルに、フィルターサイズ、サンプルを採取した深さ、日付、およびサンプリング場所の指定子を適切にラベル付けします。最後に、0.45μmの濾液が入ったボトルをスクリューキャップし、半透明の布またはスリーブで覆い、過度の日光を防ぎます。
      注意: フィルターカップのフィルターを乾かさないでください。フィルターの上には常に液体の薄い層を保ってください。フィルターは生物学的破片(細胞など)を蓄積します。フィルターが破片で詰まった場合は、カップアセンブリのネジを慎重に緩め、使用済みのフィルターカップを脇に置きますが、目詰まりしたカップは捨てないでください。新しい0.45μmフィルターを取り付けて続行します。
    4. 0.22 μm PESメンブレンフィルターカップアセンブリによるろ過:大きな真核生物ウイルスを分離するには、前のステップ(ステップ1.2.3)の0.45 μmの濾液を1 L使用し、0.22 μmのフィルターカップでろ過します。限外濾液ボトルには、フィルターサイズ、サンプルを採取した深さ、日付、およびサンプリング場所の指定子を適切にラベル付けします。最後に、0.22μmの限外濾過液(0.45μmの濾液のろ過による)が入ったボトルにキャップをして覆います。
      注意: フィルターカップのフィルターを乾かさないでください。フィルターの上には常に液体の薄い層を保ってください。フィルターは、生物学的サンプルを含む生物学的破片を蓄積します。フィルターが目詰まりした場合は、カップアセンブリのネジを外し、使用済みのフィルターカップを脇に置きます。詰まったカップは捨てないでください。新しい0.22μmフィルターを取り付けて続行します。
    5. 0.45 μmフィルターからバイオマスを濃縮する:48 mLの濾液(0.22 μmろ過から)を2本の滅菌50 mL円錐ポリプロピレン遠心分離チューブのそれぞれに注ぎます。滅菌メスを使用して、カップアセンブリ内の消費された0.45μmフィルターの最も外側の端に沿って均一に切断します。滅菌鉗子を使用して、バイオマスを含んだ湿ったフィルターを取り外します。半分に切ります。濾紙の半分を50mLの円錐形チューブ1本に丸めます。フィルターメンブレンの後半と2本目のチューブで繰り返します。チューブキャップをねじ込み、透明フィルムで固定します。チューブにラベルを付けます。
    6. 0.22 μmフィルターから大きなウイルスバイオマスを濃縮する:14 mLの限外濾過液を2本の滅菌15 mL円錐形ポリプロピレン遠心分離チューブのそれぞれに注ぎます。滅菌メスを使用して、カップアセンブリ内の使用済み0.22μmフィルターの外縁に沿って切断します。滅菌鉗子を使用して、バイオマスを含んだ湿ったフィルターを取り外します。半分に切ります。濾紙の半分を巻き上げて、15mLのコニカルチューブの1つに挿入します。フィルターメンブレンの後半と2番目の15 mLコニカルチューブについても繰り返します。チューブキャップをねじ込み、透明フィルム(パラフィルムなど)で固定します。各チューブにフィルターサイズ(0.22 μm)、部位、深さ、および日付をラベル付けします。
    7. 残りの0.45 μmの濾液と残りの0.22 μmの濾液は、ラボに返送するために保持してください。このろ過プロセス全体(ステップ1.2.2から1.2.6)を、深さとサンプリングサイトごとに繰り返します。
      注:限外濾過液は、(天然のミネラルやその他の栄養素を含む)培地ベースとしてラボで使用されます。
      生サンプル顕微鏡(オプション):0.45 μmフィルターを入れた50 mLコニカルチューブを1本取り、静かに振とうします。プラスチック製のスポイト(またはピペッター)を使用して、50mLのコニカルチューブから30〜50mLの海水を取り出し、サンプルとカバースリップを使用してガラス顕微鏡スライドを準備します。野外顕微鏡とコンピューターを使用して、顕微鏡のスライドの内容を表示し、観察された微生物の特性を検出して記録します(図2D)。

2. ウイルス/バクテリオファージを濃縮し、宿主を濃縮するためのサンプル処理

注:このプロトコルは、サンプルがフィールドサイトからラボに到着した後に必要な最初の処理ステップを説明しています。飛行機による輸送と陸上車両による輸送では、異なる考慮事項が必要になる場合があります。環境サンプルの生存率は、温度、pH、塩分濃度、光への曝露または曝露の欠如、溶存ガス(CO2 やO2など)濃度、および環境抽出とラボ処理の間の時間の急激な変化によって低下します。

  1. スピン濃縮型ウイルス・バクテリオファージの保存
    注:サンプルがラボに到着したら、到着後8時間以内に処理することで、サンプルサイトの抽出からラボへの到着までの時間の経過による生存微生物の損失を最小限に抑えることができます。以下に示す手順は、長期保存および使用のための濃縮バクテリオファージ(またはウイルス)懸濁液(すなわち、作業用ストック)のアリコートを提供します。
    1. 限外濾過液の濃縮:サイトごとのサンプリング深度ごとに、残りの~800 mLの限外濾過液をラボに輸送します。3K NMWL 15 mL遠心スピンフィルターを使用し、6000 x g で10〜20分間遠心分離して、50〜100 mLの限外濾過液を1.0〜1.5 mLまで濃縮します。前述したようにTEMイメージング用のグリッドを準備します16 結果として得られる濃縮限外濾過液にウイルス様粒子(VLP)が存在するかどうかを評価します。VLPが検出された場合は、濃縮液を100 mLアリコートに分割します。4°C(長期保存の場合は-20°C)で保存してください。
    2. 0.22 μmフィルターからの粒子の濃縮:滅菌メスを使用して、0.22 μmフィルターからの破片を、フィルターが輸送された50 mLチューブ内の限外濾液に穏やかにこすり落とします。10K NMWL スピン濃縮器カップアセンブリを使用して、50-200 mL の懸濁液を ~3 mL のサンプル保持液まで濃縮します。前述の16 と同様にTEMイメージング用のグリッドを準備し、0.22 μmフィルターの表面に捕捉された可能性のある0.45 μm濾液からのVLPがあるかどうかを判断します。VLPが検出された場合は、濃縮液を100 mLアリコートに分割し、4°C(長期保存の場合は-20°C)で保存します。
  2. 0.45 μmフィルターからのスピン濃縮および濃縮保持物。
    注:微生物の混合培養物には、上記で単離されたウイルスおよびバクテリオファージの宿主が含まれている場合があります(ステップ2.1.1および2.1.2)。混合培養のスピン濃縮と濃縮は、推定ホストの純粋培養を開発するためのワーキングストックを提供します(ステップ3を参照)。
    1. 混合懸濁液の濃縮:サイトごとのサンプリング深度ごとに、細胞破片を含んだ0.45μmフィルターで~100mLの限外濾過液をラボに返送します。滅菌メスを使用して、0.45 μmフィルターから破片を輸送された50 mLチューブ内の限外濾過液にこすり落とします。サンプルを2000 x g で10分間、4°Cで遠心分離し、バイオマスをペレット化します。ペレットを5mLの1:8希釈BG-11培地18 に再懸濁し、ピペットで穏やかにトリチュレーションします。
    2. 0.45 μmフィルターからの濃縮保持物:50 mLのBG-11培地(フラスコ3個)とサンプル部位の限外濾過液(40 mL)とBG-11(10 mL)の混合物を含む250 mLのバッフル三角フラスコで6つの並行培養物を調製します。各フラスコに0.5 mLの細胞濃縮液を接種します(ステップ2.2.1から)。光強度を20-40 mmol photons/m2/s.19 に設定した光強度で、25°Cでフォトバイオリアクターで最低7〜10日間軽度の振とうでインキュベートします19成長が堅牢になったら(例:OD730nm = 0.8)、2000 x g、10分間、4°Cでペレット化します。ピペットで穏やかにトリチュレーションすることにより、ペレットを1:8希釈BG-11培地10mLに再懸濁します。-80°Cで保存するために、スクリューキャップクライオチューブに0.5 mLの細胞懸濁液を10〜20アリコート調製します。

3. 微生物宿主の単一遺伝子型純粋培養法の開発

注:このプロトコルは、収集された環境サンプルから処理された混合培養物からウイルスおよびバクテリオファージの推定微生物宿主を単離および精製するための手順を説明しています。複数の宿主表現型を単離および精製できるため、保存された水サンプル中に存在するウイルスおよびバクテリオファージの許容宿主を検出する可能性が高くなります(ステップ2.1.1-2.1.2)。

  1. プレートのストリーキングと単一コロニー分離株の選択
    注:環境サンプリング中に捕捉されたウイルスまたはバクテリオファージの感受性および許容性の宿主を単離する確率を高め、ウイルスおよびバクテリオファージの宿主範囲を調査するために、混合培養物から複数の単一遺伝子型の純培養が開発されています。
    1. 以下に説明するように、単一コロニー分離株(SCI)を開発します。
      1. BG-11寒天プレート20を準備します。-80°Cで保存した混合懸濁液の1アリコートを氷上で解凍します(ステップ2.2.2から)。滅菌ループを使用して、標準的な技術20を使用して、細胞濃縮物をBG-11寒天プレート上にストリークします。縞模様のプレートをフォトバイオリアクターで25°Cで~10日間、光強度20-40 mmol photon/m2/sでインキュベートするか、プレート上にコロニーが現れるまでインキュベートします。
      2. 5 mLのBG-11培地および/またはサンプルサイトからの限外濾過液とBG-11の混合物5 mLを入れた20 mLの培養チューブで~10個の種子培養物を調製します。滅菌爪楊枝でプレートからSCIを摘み取り、各チューブに1つのつまようじを落として各チューブを個別に接種します。光強度を20〜40 mmol photon/m2/sに設定して、または増殖が検出されるまで(例:OD730nm = 0.4-0.8)、光バイオリアクターで25°Cで最低10〜15日間、フォトバイオリアクターで軽度の振とうをしながらインキュベートします。
        注:最初のストリークプレートに複数のコロニー表現型(例:形態、透明度、色)がある場合は、コロニー表現型の範囲から接種する個々のコロニーを選択します。
    2. ワーキングストックの純粋培養の開発:正の種子培養成長が検出されたら、プレート上に単一のコロニー表現型のみが現れるまでストリーク手順を繰り返します(図3B および 図4B)。上記のように、250 mLのバッフルフラスコ(図3C および 図4C)で50 mLの培養物にシード培養液をアップスケールします(ステップ2.2.2)。0.5 mLのSCI細胞懸濁液を~20アリコート調製し、-80°Cで保存するための1.0 mLスクリューキャップクライオチューブにピペットで移します。
      注:シアノバクテリアの純粋な培養を開発するためには、培養汚染を減らすために抗生物質または抗真菌剤(例えば、イミペネム、シクロヘキシミド)が必要となる場合がある21。めっき手順は、シアノバクテリアまたは微細藻類の分離が標的となる可能性のあるピボットポイントです。インキュベーション中の光パラメータは、光強度またはオンオフサイクルの点で異なる場合があります。
  2. 単一遺伝子型の特性評価とワーキングストックの保存
    注:個々の推定宿主遺伝子型の単離および濃縮を確認するために、純粋な培養物を形態学的および遺伝的に特徴付けます。
    1. 形態学的特性評価:液体培養と固体培地プレートのサイクルが機能することで単一の細胞表現型が得られたら、光学顕微鏡(図2A-C)と、可能であれば透過型電子顕微鏡(TEM)および/または走査型電子顕微鏡(SEM;図 3A と図 4A)。光学顕微鏡下(例えば、60倍〜100倍の倍率)では、緑色、淡褐色、または透明な単細胞性、コロニー状、糸状、らせん状、分岐状、または毛状突起の細胞組織を観察することができる。これは、分類学上の割り当ての可能性を示します。
    2. 遺伝的特性評価:推定される純粋培養物からのDNA抽出とそれに続く部分的なゲノムシーケンシングにより、単一の微生物遺伝子型の単離を検証します。シアノバクテリアでは、16S rRNA遺伝子がしばしば標的となる(図5A)22。16Sの系統解析により、分類学的グループ22を特定できる。微細藻類では、18S rRNAが標的になることがよくあります23。関心のある分離株または新規分離株については、全ゲノムシーケンシングを追求することができます。

4. 単一遺伝子型ウイルス/バクテリオファージ懸濁液の開発

注:このプロトコルは、環境サンプルから複数の単一遺伝子型ウイルスおよびバクテリオファージ懸濁液を単離および精製する手順を説明しています。

  1. VLP濃縮液の希釈とTEM
    注:TEMおよびプレートベースのプラークアッセイ24を使用して、VLPが宿主細胞に感染する真正なバクテリオファージ(またはウイルス)であることの確認が達成される。
    1. 濾液の透過型電子顕微鏡(0.45 μmおよび0.22 μm):原水サンプルの0.45 μmおよび0.22 μmのろ過(ステップ2.1を参照)の濃縮物を使用して、TEMグリッド16 と画像を調製し、ウイルス粒子の不均一性(すなわち、形態型の多様性)を調べます。30%〜50%のコンフルエントを達成するための後続のステップを完了する前に、高いコンフルエント(例:90%)のグリッドになるサンプルを希釈します。手動の粒子計数またはイメージングソフトウェアの使用を使用して、グリッド上の細胞の密度を推定することができます。
      注:グリッド上の合流性が高いと、選択可能な個々のプラークが出現するのではなく、固体メディアプレート上のホスト芝生がクリアされる可能性があります。したがって、プラークアッセイの前にサンプルを希釈すると、時間を節約できます。あるいは、VLP濃縮物の段階希釈を使用して、複数のホストローンプレートのホストウイルス相互作用を試験することもできます。
    2. 宿主の芝生でのバクテリオファージ(またはウイルス)活性の検出:BG-11寒天プレート上で、シアノバクテリア(または微細藻類)の推定宿主芝生をワーキングストックから育てます(ステップ3.1.2)。4.5 mLの培地に0.5 mLのVLP懸濁液をピペットで移し(図6A、左)、芝生の表面全体が懸濁液でコーティングされるまで静かに渦巻かせます。光強度20〜40 mmol photons/m2/sの光強度で、またはプレート上にプラークが見えるまで、25°Cで3〜10日間、フォトバイオリアクターでインキュベートします(図6A、右)。
  2. プラークの掻き取りと単一遺伝子型ウイルスまたはバクテリオファージ懸濁液の開発
    注:個々のプラーク表現型をスクレイピングし、宿主の液体培養物中でバクテリオファージを増殖させることにより、真正な宿主-バクテリオファージ(または宿主-ウイルス)の相互作用が確認され、感染アッセイ用のバクテリオファージ(またはウイルス)ワーキングストックを開発することができます。バクテリオファージ(またはウイルス)のワーキングストックは、定義された感染多重度(MOI)で感染アッセイを進めるために、いくつかの方法(qPCR、プラークアッセイなど)のいずれかによって力価を測定する必要があります。
    1. 1つのバクテリオファージ(またはウイルス)遺伝子型の単離と増殖:プレート上に個々のプラークが見えたら(VLP濃縮物の適切な希釈による)、滅菌ループを使用して1つのプラークをこすり落とします。宿主の10 mLの種子培養物でループを渦巻きます(図6B、左)。光強度を20-40 mmol photon/m2/sに設定して、またはOD730nm の滴下または細胞破片がチューブの底に検出されるまで、または細胞死/溶解を示す(図6B、右)25°Cで3〜10日間、フォトバイオリアクター内で軽度の振とう(例えば、70〜120rpm)インキュベートする(図6B、右)25。
      注:宿主の芝生にプラークが形成されるが、液体培養で感染の兆候がない場合、プラークはバクテリオファージ(またはウイルス)ではなくバクテリオシン26 によって形成された可能性があります。TEMは、バクテリオファージ(またはウイルス)感染による細胞死を示すことにより、プレートアッセイをサポートすることができます。
    2. バクテリオファージ(またはウイルス)ワーキングストックの力価の定量化:バクテリオファージ(またはウイルス)の単離は、上記のろ過法およびスピン濃縮法を使用して達成されます。バクテリオファージ(またはウイルス)懸濁液の力価を段階希釈プラークアッセイ27により定量します。あるいは、DNA抽出、全ウイルスゲノムシーケンシング、系統学(図5B)を行い、バクテリオファージのqPCRベースの力価測定を実施するためのプライマーを開発し、その後の感染アッセイのためのワーキングストックを確立します。
      注:単一のバクテリオファージ(またはウイルス)遺伝子型の増殖は、力価または作業ストックの量が実験の必要性に対して低すぎる場合、50 mLまたは100 mLの培養にアップスケールできます。ウイルス宿主システムの性質(高病原性または低病原性など)、感染アッセイで計画される感染の多様性(MOI)、およびバクテリオファージ(またはウイルス)のワーキングストックを開発する際にプロジェクトで完了する感染アッセイの数を考慮してください。ウイルスストックを解凍して再凍結することはお勧めできません。各実験について、同じ調製物を同じ力価で複製したウイルスストックを1つ解凍し、1つ完全ウイルスストックを使用します。エレクトロスプレーイオン化/質量分析(ESI/MS)28を含む他の力価技術は、記載された方法を補完し得る。

5. 感染アッセイ

注:このプロトコルは、以下に使用される宿主ファージ(または宿主ウイルス)感染アッセイについて説明しています:固形培地上の病原性、宿主範囲、および感染表現型(複製戦略の指標)を定性的に特徴付けます。また、液体培養における成長動態、ウイルスの病原性14、および宿主の回復力15 を定量的に評価します。

  1. 固体培地上のバクテリオファージ(またはウイルス)の相対的な病原性と宿主範囲の測定
    注:スポットオンローンアッセイ、シングルプレート連続希釈プラークアッセイ、および宿主抵抗プレートアッセイを含むすべての固体培地アッセイは、ウイルスの病原性、宿主範囲、および複製戦略などのバクテリオファージ-宿主感染パラメータに関する定性的データを提供します。液体培養増殖アッセイでは、ウイルス-宿主ダイナミクスのより定量的な測定とモデリングが可能になります。
    1. Spot-on-lawnアッセイ:宿主の範囲を決定するには、環境サンプルまたは他の研究室や培養コレクションから取得した株から分離された複数の推定宿主の芝生を準備します。芝生では、ピペットで芝生に2μLのバクテリオファージ(またはウイルス)懸濁液をスポットします。同じプレートの別の領域で、同じ容量のTriton X-100とナノピュア(18MW)水をそれぞれポジティブコントロールとネガティブコントロールとして見つけます16。所与のバクテリオファージ(またはウイルス)を複数の宿主に対して複数回のスポットオンローンアッセイを実施し、バクテリオファージ16の宿主範囲を評価する。プラーク表現型は、バクテリオファージ(またはウイルス)の複製戦略に関する洞察を提供します。鋭い境界を持ち、寒天まで透明になるプラークは溶解性複製を示し、拡散した境界またはハローを持つプラークは非溶解性複製を示している可能性があります16,17。
      注:あるいは、シングルプレート連続希釈プラークアッセイは、プラークサイズとバクテリオファージ力価との間に線形関係があるかどうかを示します。プレートの裏側にあるマーカーを使用して、プレートをグリッドまたはパイセクションに分割します。次に、同じ容量(すなわち、2 mL)を使用し、バクテリオファージ懸濁液(1:1、1:4、1:16、1:64など)を希釈して、単一のホストプレートでスポットオンローンアッセイを実施します。
    2. 宿主耐性アッセイ:一連のバクテリオファージが特定の宿主に感染を引き起こす可能性があるかどうかを判断するには、上記のようにプレート上に宿主の芝生を準備します。プレートの裏側にあるマーカーを使用して、プレートをグリッドまたはパイセクションに分割します。次に、Triton X-100とナノピュアウォーターをコントロールとして使用して、各バクテリオファージ(またはウイルス)懸濁液2 mLをグリッド(またはパイ)の1つのセクションにスポットします。すべてのバクテリオファージ(またはウイルス)懸濁液を同じ力価で添加する場合は、宿主上のバクテリオファージ株(またはウイルス)間の相対的な病原性を定性的に評価します(すなわち、プラークが大きい=毒性の高いウイルスが多い)。
  2. 液培養感染アッセイにおける病原性、レジリエンス、および増殖の定量化
    注:初期の定性的結果は、特定のバクテリオファージ-宿主ペアを標的とし、ウイルス-宿主相互作用のダイナミクスのより定量的な分析を実施するための基礎を提供します。液体培養では、感染した宿主の成長曲線が生成され、感染していない(制御された)宿主の成長と比較されます。
    1. 以下に説明するように、液体培養の単一ウイルス/単一宿主感染アッセイを実施します。
      1. 固体培地プレートアッセイ(ステップ5.1)によって感受性および許容性があることが証明された微生物(シアノバクテリアなど)の並行液体培養(~6-12)を、1.0 L(320 mLの培養)、500 mL(160 mLの培養)、または250 mL(80 mLの培養)のいずれかで確立します- 前述の17のバッフル培養フラスコ。あらかじめ決められた時点(通常は0.5または1の宿主倍加時間)で、バクテリオファージ懸濁液と三重に並行培養した培養物のサブセットを、利用可能なワーキングストック力価で事前に選択された感染の多重度(MOI)を得るのに必要な適切な量を使用して、同等の細胞密度(例えば、OD730nm = 0.08)で接種します。
      2. 他の並行培養物(これも三重培養)を接種しない(すなわち、感染しない)コントロールとして残しておきます。オプションで、選択したバクテリオファージと宿主のペアを比較するために、異なるバクテリオファージ(またはウイルス)株を3番目の並行培養セットに接種します。光強度を20〜40 mmol photons / m2 / sに設定して、25°Cで3〜10日間フォトバイオリアクターで培養物を成長させます。
      3. バクテリオファージに感染した培養物と感染していない(コントロール)培養物から一定の時間間隔(例:8時間)でOD730nmを読み取ることにより、ホスト成長曲線を生成します(図7A)。未感染のコントロール培養物(図7C)および宿主細胞培養物での生産感染(図7D)のTEM検証を使用します。細胞変性効果29,30は、ほとんどの感染細胞で容易に観察できるが、非感染細胞は形態学的変化またはストレスの徴候を示さない。
    2. 液体培養感染アッセイのベースライン分析:単一ウイルス/単一宿主(SVSH)液体培養感染アッセイから、最大比成長率(μ最大)31、相対的なバクテリオファージ(またはウイルス)の病原性14、相対的な宿主回復力15など、いくつかのベースライン指標を導き出すことができます。バクテリオファージと宿主のダイナミクスのより定量的な説明のために(図7B)).標準的な報告可能な指標には、成長率(多くの場合、最大比成長率、または最大μとして報告される)および相対毒性(VR)14と、感染していない宿主対照および/または同じ宿主上の別のバクテリオファージと比較したものが含まれます。システムの環境収容力(N漸近線)やホストの相対レジリエンス(RR)15などの他の指標も報告される場合があります。

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結果

ポータブルガソリン発電機、水移送ポンプ、および崩壊防止チューブの使用は、選択した深さで海、湖、凍った湖、およびその他の水生環境(ラグーンなど)から水サンプルを抽出する効果的な方法として機能します(図1、上部3行)。地熱温泉、プール、泥鉢などの高温酸性水は、pH<4、温度が90°Cを超える場合があり、代替設備が必要です。 250 mLボトルまたは50 mL円錐管を保持する固定具を備えた長い竹製ポールまたは伸縮式アルミニウム製スイミングプールクリーニングポールを使用して、これらの極端な環境から水サンプルを抽出できます(図1、下段)。いずれの場合も、水温、pH、塩分濃度、GPS座標など、水サンプルのベースラインデータが記録されます。(図1、下段、左中央)。

水サンプルは、サンプリングサイトからフィールドステーションまたは作業室に遅延なく輸送され...

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ディスカッション

ウイルス圏は広大で多様であるため、さまざまなウイルスシステムを研究するためにさまざまな実験的アプローチが必要です。これには、ウイルスとその宿主をさまざまな環境から分離するためのさまざまな戦略や、宿主とそのウイルスの純粋な培養物を生サンプルから作出できるようにするためのさまざまな処理方法が含まれます。これらの純粋な培養物は、固体培地と液体培養の両方でSVSH感染アッセイに使用できるため、システムの特徴とウイルス-宿主ダイナミクスの定量分析を実現できます。このレポートでは、海、湖、氷に覆われた湖の下の水、およびその他の水生環境(地熱プールや温泉など)からサンプリングするための標準的ではあるが変更可能なワークフローについて説明します。このワークフローには、ラボに返送する前に現場でサンプルを前処理する方法の詳細が含まれており、これは、生存可能な微生物叢がより詳細な分析のためにラボに戻るようにするために重要です。さまざまなサイズのフィルターのセットを介してろ過およびフィルター濃縮することにより、生サンプルの画分を分離し、太陽光(紫外線など)や極端な温度などの要因からサンプルを保護...

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開示事項

著者は、利益相反を宣言しません。

謝辞

この研究は、米国国立科学財団(NSF)のOISE助成金第1856091号(PI-Ceballos)およびNSF DBI助成金第2119968号(PI-Ceballos)から一部資金提供を受けました。著者らは、キングモンクット工科大学トンブリー校(タイ)のチンナポン・ワンナイ博士とチャクリット・タチャーパイクーン博士が、それぞれ環境サンプリングのビデオ撮影とフィールドサポートを提供してくれたことに感謝します。また、コスタリカの国立公園からのサンプリング許可を確保し、地熱プールからのサンプル収集を支援してくれたコスタリカ大学グアナカステ校のホルヘ・アルマンド・レイバ・サナブリア博士にも感謝しています。著者は同様に、南カリフォルニア沖とミネソタ州北部の湖のサンプリングをそれぞれ支援したエンリケ・マロキン・ジュニア氏(カリフォルニア大学マーセド校)とアレクシア・マセダ氏(メイン大学オロノ、メイン州、米国)に感謝します。著者らは、φSBL14-SWIIデータセットの感染パラメータを計算してくださったSocheata Hour氏の技術サポートに感謝し、感謝の意を表します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1 hpステンレス鋼移送ポンプ Utilitech、米国ノースカロライナ州シャーロット該当なし
1.5mlチューブwww.eppendorf.com30123611
10K NMWL Centricon Plus 70 スピンコンセントレーター  www.sigmaaldrich.comUFC701008
250 mLバッフル三角フラスコ www.sigmaaldrich.comCLS4450250
3800ワットインバーター発電機 WEN Products、米国イリノイ州ウェストダンディーウェン 56380i
3K NMWL アミコン 15 mL www.sigmaaldrich.comUFC800308
500 mLバッフル三角フラスコ www.sigmaaldrich.comCLS4450500
5ガロンの水差し www.homedepot.com該当なし
長さ80フィート、0.5インチ直径、ナイロン&NBSP;https://facomex.mx/producto/combo/該当なし
26 フィートのディープ V センター コンソール Sailfish 2660 と 2 つのヤマハ 150 馬力船外機 。https://yamahaoutboards.com/該当なし
酢酸アンモニウム(CH3CO2NH4)www.sigmaaldrich.com631618
ホウ酸(H3BO3)www.sigmaaldrich.com10043353
塩化カルシウム二水和物(CaCl2.2H2O)www.sigmaaldrich.com10035048
遠心分離機 5920 Rwww.eppendorf.com5948000107
クエン酸(C6H8O7)www.sigmaaldrich.com77929
硝酸コバルト(II)六水和物[Co(NO3)2.6H2O]www.sigmaaldrich.com10026229
耐崩壊ゴム製フレックスホース swanhose.comCELTF58050
硫酸銅(II)五水和物(CuSO4.5H2O)www.sigmaaldrich.com7758998
Corning 50 mL遠心分離管 www.sigmaaldrich.comCLS430291
リン酸二カリウム(K2HPO4)www.sigmaaldrich.com7758114
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム(Na2EDTA)www.sigmaaldrich.com6381926
DS-11 FX+_Microvolumeおよび分光光度計およびフロロメーターwww.denovix.com該当なし
ダクトテープ www.homedepot.com該当なし
エッペンドルフチューブwww.sigmaaldrich.comEP022364120
エタノールwww.sigmaaldrich.com64175
エチレンジアミン四酢酸(EDTA)www.sigmaaldrich.com60004
クエン酸第二鉄アンモニウム(C6H8O7·xFe3+·yNH<サブ>3)www.sigmaaldrich.com1185575
フレックスプラスブルーPVCチューブ www.carlonsales.com12008-750
Innova S44i - スタッカブルインキュベーターシェーカーwww.eppendorf.com2231001081
LVEM5 卓上型電子Microscope_Transmission電子顕微鏡(TEM)delongamerica.com該当なし
硫酸マグネシウム七水和物(MgSO4.7 H2O)www.sigmaaldrich.com10034998
塩化マンガン(II)四水和物(MnCl2.4H2O)www.sigmaaldrich.com13446349
マッシュルームアンカーブラックビニールコーティング/30ポンドwww.homedepot.com該当なし
シャーレ、ポリスチレンwww.sigmaaldrich.comP5481
ポリエーテルスルホン(PES)メンブレンフィルターカップ、0.22 mmwww.sigmaaldrich.comZ358193-1CS
ポリエーテルスルホン(PES)メンブレンフィルターカップ、0.45 mmwww.sigmaaldrich.comZ370622-1CS
キサントゲン酸エチルカリウム(C2H5OCSSK)www.sigmaaldrich.com140896
炭酸ナトリウム(Na2CO3)www.sigmaaldrich.com497198
ドデシル硫酸ナトリウム [CH3(CH2)11OSO3Na]www.sigmaaldrich.com151213
モリブデン酸ナトリウム二水和物(Na2MoO4.2H2O)www.sigmaaldrich.com10102406
硝酸ナトリウム(NaNO3)www.sigmaaldrich.com7631994
トリス(ヒドロキシメチル)メチル]-2-アミノエタンスルホン酸アシ(TES)(C6H15NO6S)www.sigmaaldrich.com7365448
トリトンX-100 www.sigmaaldrich.comT8787
塩酸トリズマ(Tris-HCl)www.sigmaaldrich.com1185531
真空/圧力ポンプ コール・パーマー;米国イリノイ州バーノンヒルズEW-79204-00
ビニールチューブ www.homedepot.com該当なし
硫酸亜鉛七水和物(ZnSO4.7H2O)www.sigmaaldrich.com7446200

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