細胞分解能によるホールマウントRetinal Organoidの可視化

サマリー

このプロトコールは、光学的透明化と免疫標識を組み合わせて、ホールマウント網膜オルガノイドの全容積共焦点イメージングを実現します。3D構造を保持し、主要なニューロン経路の詳細な視覚化を可能にし、網膜の成熟、空間構成、および疾患モデリングや個別化医療への応用の可能性の研究を改善します。

要約

ヒト人工多能性幹細胞に由来する網膜オルガノイドは、ヒトの網膜を模倣した複雑な3D構造であり、網膜の発達、疾患メカニズム、および潜在的な治療戦略を研究するための強力なプラットフォームを提供します。また、患者由来であることから、個別化医療のツールとしても期待が寄せられており、人気が高まっています。従来の2D細胞培養とは異なり、網膜オルガノイドは網膜の本来の3D構造を保持しているため、より現実的な表現が可能になり、より生理学的に関連性のある研究が可能になります。しかし、その構造の複雑さ、高い細胞密度、および多様な組成は、特性評価に大きな課題をもたらします。

これらの課題に対処し、3Dコンテクストを維持しながら網膜オルガノイドの成熟の理解を深めるために、光学的透明化法と免疫標識を組み合わせて、共焦点顕微鏡でホールマウントオルガノイドの全体構造を可視化しました。このために、低開口および高開口の対物レンズと互換性のあるクリアリング法を採用し、フルボリュームイメージングを容易にし、細胞分解能で特定の関心領域をキャプチャしました。このアプローチを使用して、視覚情報の伝達に関与する3つの主要なニューロン経路(錐体および桿体光受容体、双極細胞および神経節細胞)の形態と分布を3Dで特定しました。私たちの発見は、オルガノイド内の網膜細胞の空間的組織に対処するための視覚化技術にさらに光を当てます。

概要

レチナールオルガノイド

網膜オルガノイドは、ヒトの網膜を模倣した複雑な3D構造であり、網膜の発達、疾患メカニズム、および潜在的な治療戦略を研究するための貴重なプラットフォームを提供します¹。それらは、網膜の自然な3D構造を維持し、トランスクリプトームの忠実度と機能的能力を実証し、光伝達とシナプス結合性を再現します²。さらに、in vivoでの現像^3,4を厳密に模倣しているため、フラットな細胞培養と比較してより現実的な表現が可能です。これまでの研究では、Isla-Magranéらは、ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)に由来する多眼オルガノイドを得るための2段階のプロトコルを確立し、開発中のヒト眼の細胞特性をモデル化しました^5,6。胎児組織が不足しているため、ヒトの眼の発達研究は解剖学的研究に限定されてきました。

このプロトコルで得られた網膜オルガノイドは、適切な層状化を示し、光受容体、双極細胞、神経節細胞、アマクリン細胞、水平細胞、マクログリアなどのすべての主要な網膜細胞サブタイプを、主要な形態学的特徴および正しい空間構成および接続とともに含んでいました。オルガノイドモデルは、解決策として有望ではありますが、大きなばらつきがあり、一貫した結果を得ることが困難です。そのため、より信頼性の高い人体モデルにさまざまな先進技術を採用することが急務となっています。これまで、これらのオルガノイドは、その複雑な細胞組成、密度、およびサイズが光の透過を妨げ、より深い層での光学イメージング性能が低下し、包括的な解析が制限されるため、組織学的切片を用いてのみ研究されてきました。

ホールマウントイメージング

固定組織の切片化と染色を含む従来の組織学的手法は、特定の領域に関する詳細な情報を提供することがありますが、オルガノイド全体の全体的な構造と空間的関係を捉えることはできません。この制限を克服するために、ホールマウントイメージングは、網膜オルガノイドを研究するための貴重なツールとして浮上しています。ホールマウントイメージングにより、オルガノイド全体を無傷の3D形態で可視化することができ、細胞タイプと細胞外マトリックス成分の空間分布を維持することができます。このアプローチは、オルガノイド内およびオルガノイド間の細胞組成を調査するのに特に有益であり、オルガノイドの発生過程と機能組織をより完全に理解することができます。しかし、その細胞密度と圧縮により、網膜オルガノイドは不透明です(図1、未確認)。サンプルの固有の不透明さは光散乱を引き起こし、顕微鏡による内部構造の詳細な視覚化を妨げます。ここでは、光学クリアリング技術が強力なツールとして登場します。

光クリアリング技術

光学的透明化とは、組織の屈折率(RI)勾配を透明化剤の勾配に一致させるとともに、光吸収物質を除去することにより、厚い生体試料を透明化する物理化学的処理を指す⁷。これらの方法により、光の散乱が劇的に減少し、透明度が向上します。この変換により、網膜オルガノイド全体を見通すことができ、ホールマウントイメージング技術を通じてその複雑な細胞組織と形態を包括的に分析することが可能になります。実際には、これはサンプルに高屈折率物質を含浸させ、脂質と色素を除去することによって達成されます。

さまざまな側面(例えば、透明性の程度、顕微鏡技術、試料、蛍光分子との適合性、実現可能性、持続時間)が異なるさまざまな透明化方法が利用可能であるが、最も^{一般的なプロトコルとして}際立っているものはない8。それらは、(1)単純な浸漬、(2)有機溶媒ベースの疎水性、(3)過水和性ベース、および(4)組織形質転換またはヒドロゲル包埋ベースの4つの主要なグループに分類され^ます。すべての方法には、通常、組織の平均RIに一致する溶液にサンプルを浸すことによるRIマッチングのステップが含まれています。疎水性法では、サンプルを増加した有機溶媒(メタノールやプロパノールなど)に浸すことにより、脂質と水を除去します。

提示されたプロトコールは、光学的透明化と免疫標識を統合して、共焦点顕微鏡による網膜オルガノイドのホールマウント3D可視化を容易にする最適化された方法であり、構造的完全性を維持しながらフルボリュームイメージングを可能にします。このアプローチにより、オルガノイド内の主要な網膜細胞の種類を同定することができ、研究者は生理学的に関連性のある状況で網膜オルガノイドの成熟と空間構成を調査するための強力なツールを得ることができます。

プロトコル

1. カスタムメイドの蛍光二次抗体の調製

注:このアプローチは、市販の蛍光抗体の使用に代わるものとして機能します(蛍光二次抗体を調製する利点については、ディスカッションを参照してください)。さらに、このプロトコールは、直接免疫蛍光法を行う必要があり、蛍光一次抗体が市販されていない場合に、蛍光色素を一次抗体に結合するために使用できます。標識反応中の蛍光色素の量を調整して蛍光色素分子と抗体の比率を制御すると、より明るい標識抗体が生成されます。しかし、カスタムメイドの二次抗体は安定性が低く、得られるコンジュゲートの濃度は市販の蛍光抗体の濃度よりも10倍低くなっています。このプロトコルは、Bálint et al⁹によって記述された研究から採用されています。

1. 1 mgの蛍光色素を無水DMSOに溶解し、チューブに分注して、チューブあたり最終的に0.02 mgの蛍光色素を調製します。速度真空濃縮器を使用して、1時間30分間運転して、すべてのDMSOを取り外してください。アリコートは-20°Cで保管し、光から保護してください。Alexa Fluor 405の場合、超高純度のH₂Oはアリコートの作製に適した溶媒です。
2. 標識反応を行うには、蛍光色素の1アリコートを1〜10 μLのDMSO(またはAlexa Fluor 405の場合は超高純度H₂O)に溶解します。
   注:DMSOの正確な量は、以前の制御標識試験によって決定されます。これらの試験は、蛍光色素の新しいバッチを使用するとき(または以前の蛍光色素のバッチがなくなるとき)、または新しい蛍光色素が初めて標識で使用されるときに実行されます。コントロール標識試験では、さまざまな量の蛍光色素で標識反応を行い、標識中の最適な蛍光色素分子と抗体の比率を決定します。私たちの場合、最適な比率は通常、3μLから5μLの間にあります。
3. 50 μLの二次IgG(または一次)、6 μLの1 M NaHCO₃、および1-5 μLの蛍光色素を、光から保護されたロッキングプラットフォーム上で室温(RT)で40分間インキュベートします。
4. 反応が進行している間に、精製サイズ排除カラムの蓋を外してバッファーを通過させて調製します。カラム(標識反応ごとに1つ)を3 x 2-3 mLのPBSをカラムに通して平衡化します。インキュベーションが終了する前に最後の平衡化ステップが終了した場合は、蓋が乾かないように蓋を戻し、標識反応が終了するまで待ちます。
   注:精製サイズ除外カラムは重力によって機能します。カラムが乾かないように注意してください、さもなければ精製反応は適切に機能しません。
5. 反応が終了したら(ステップ1.3)、標識反応に140μLのPBSを加えて容量を約200μLにし、ボルテックスします。この溶液をカラムの中央に加え、サンプルをカラムに注入し、最後の一滴が溶出した後、550 μLのPBSを加えて押し込みます。液の落下が止まったら、PBSを300 μL加えて溶出し、1.5 mLの微量遠心チューブに回収します。
6. 280 nmでのサンプルの吸光度と使用した蛍光色素の吸光度を測定することにより、抗体濃度と標識比を計算します。ランベルトベールの法則を適用して、次のように濃度(モル濃度)を決定します。
   
   ここで、Aは吸光度、εはモル吸光係数、CF₂₈₀ は特定の蛍光色素が280nmで持つ吸光度の測定値であり、補正係数として機能します。次に、抗体の濃度は次のようになります。
   
   また、ラベルの比率は次のとおりです。
   
7. 標識した抗体は、光から保護した4°Cで最大6ヶ月間保存してください。

2. 免疫蛍光標識

1. オルガノイドを4%パラホルムアルデヒド(PFA)で室温で45分間固定します。
   注:オプション:オルガノイドを抗原賦活化溶液(ステップ2.2および2.3)とインキュベートして、抗原の免疫反応性を高めます。
2. 0.117 mgのクエン酸ナトリウム三塩基性二水和物を超高純度H₂Oに混合して40 mLの抗原賦活化溶液を調製し、pH 9に調整します。
3. オルガノイドを抗原賦活化溶液と軽度振とう(30 rpm)し、60°Cで1時間インキュベートします。
4. オルガノイドをPBST(PBS、1%Triton X-100を含む)で透過処理し、RTで4時間軽度に振とうします。
5. オルガノイドをブロッキング溶液(2%ウシ血清アルブミン(BSA)と0.1%トリトンX-100)で室温で一晩(または1日以上)ブロックします。
   注:一次抗体と二次抗体の濃度は、特定の抗体によって異なります。ホールマウントサンプルの免疫蛍光染色には、切片サンプルと比較して高濃度を使用します。一次抗体を10 μg/mLでインキュベートしますが、これはほとんどの場合、ストックから1:100に相当します(表1)。カスタムメイドの二次抗体を20-50 μg/mLでインキュベートします。
6. オルガノイドを洗浄液(0.1% BSAと0.1% Triton X-100)で希釈した一次抗体とオルガノイドを4°Cで2日間、軽度の振とうでインキュベートします。
7. オルガノイドを洗浄液で15分間3回、室温で軽く振とうしながら洗浄します。
8. オルガノイドを、4°Cの洗浄液で希釈した二次抗体とオルガノイドを2日間、軽く振とうしながらインキュベートします。
9. オルガノイドを洗浄液で15分間3回、室温で軽く振とうしながら洗浄します。
   注:免疫標識後、選択した蛍光色素をインキュベートできます。通常、アクチンフィラメント網の可視化には、DAPI(1:1,000)やDRAQ5(1:500)などの蛍光核マーカーや、ファロイジン(1:100)を使用します。
10. オルガノイドを、室温洗浄液で希釈した蛍光色素とオルガノイドを1時間インキュベートし、軽度の振とうを行います。
11. オルガノイドを洗浄液で15分間3回、室温で軽く振とうしながら洗浄します。

3. FluoClear BABBによる光学クリアリング

注:1-プロパノールは、特に長期間の暴露により、プラスチック容器を損なう可能性があります。安全のため、ガラス容器を使用してください。

1. 脱水ステップ
   1. 超高純度H₂O中の1-プロパノール溶液を所定の割合(15%、30%、45%、60%、75%、90%)で調製し、トリメチルアミンでpH 9.5に調整します。
      注意:トリエチルアミンは吸入すると有毒です。ヒュームフードの下で作業します。溶液は、適切に保管すれば再利用できます(密閉容器)。使用前にpHを調整してください。
   2. 1-プロパノール溶液(15%、30%、45%、60%、75%、90%)のグラジエントを増やしながら、30°Cでそれぞれ2時間、穏やかな振とうをしながらサンプルをインキュベートします。
   3. サンプルを100% 1-プロパノールと100%プロパノールと共溶かし、30°Cで一晩インキュベートします。
2. クリアステップ
   注意: BABBは、多くのプラスチックを溶解または大幅に損傷する能力で知られる強力な溶剤混合物です。安全のため、互換性のある蓋付きのガラス容器を使用し、ドラフト内で作業してください。
   1. ベンジルアルコール(BA)と安息香酸ベンジル(BB)を1:2の比率で混合して、BABBを調製します。
   2. サンプルをRTのBABBに一晩浸漬します。
   3. イメージングする前に、TABBをリフレッシュしてください。
      注:直径~1 mmのオルガノイドの場合、BABBは数十分で明らかな透明化効果を誘発します。サンプルのサイズと性質に応じて、透明化の程度が異なる場合や、透明化溶液への曝露時間が長くなる可能性があります。クリアリングプロトコルを改善するために、BABBイマージョンの前後に画像を取得することをお勧めします。
   4. BABBクリアサンプルは、BABB溶液で4°Cで長期間保存してください。 蛍光を保つために光から保護してください。

4. ホールマウント画像取得

1. ガラスピペットを使用して、オルガノイドをガラス底のペトリ皿に置き、BABBを一滴垂らします。サンプルがカバーガラスの表面に接触していることを確認してください。
   注意: サンプルを含むBABBの滴が皿のプラスチックの端に接触しないように注意してください、またはプラスチックを溶かしてサンプルとイメージングの品質を損ないます。
2. 低倍率と高倍率の対物レンズを備えた倒立共焦点レーザー走査型顕微鏡を使用して、Zスタック画像を取得し、細胞の詳細を含むサンプルの完全な3D洞察を取得します。
   注:この研究では、10倍開口(NA)0.4エア対物レンズと63倍NA1.4対物レンズを使用し、ステップサイズはそれぞれ3.5μmと1μmでした。

5. 画像処理

1. クリアリング溶液と液浸媒体との間の屈折率(RI)の不一致を考慮して、Zスタック取得のステップサイズを再校正します。
   1. 再キャリブレーションされたステップ サイズを次のように計算します。
      
      BABBに埋め込まれたサンプルを、3.5 μmステップサイズのエア対物レンズでイメージングすると、次のようになります。
      
   2. ImageJ を使用して、 ボクセルの深度 を変更します ( [Image |プロパティ...)(再計算されたステップ サイズ)。
2. Z スタックの画像投影を作成します。
   1. ImageJ を使用して、Z スタックを詳細に調べます ( [Image |スタック |直交ビュー)。網膜オルガノイドのXY、XZ、およびYZビューが表示されます。
   2. 目的の関心領域を保存します( [ファイル]|名前を付けて保存...)。
3. 処理ソフトウェアを使用して、Zスタックの3Dレンダリングのアニメーションを作成します( マテリアルの表を参照)。
   1. 視覚化するチャネルを選択するには、そのチェックボックスを有効にします。
   2. Z平面を調整して、サンプルの内部を視覚化します(チェックボックスの クリッピング を有効にします)。
   3. ムービーエディタを使用してアニメーションを録画します(チェックボックスでムービーエディタを有効にします)。ドラッグアンドドロップし、マウスを使用して直接ズームインおよびズームアウトします。[追加] をクリックして、アニメーションに別のクリップを含めます。Z平面を調整する場合は、クリップ平面オプションを有効にします([設定]をクリックします...|[クリップ平面]ボックスをオンにします)。 

結果

図1:3つの清算方法の比較。左:(A)未クリアサンプルと(B-D)クリアサンプルの明視野画像。右:10倍の対物レンズ(RI = 1.00)を備えた共焦点レーザー走査型顕微鏡で取得した核マーカーDRAQ5(黄色)で染色した90のDIV網膜オルガノイドのxzおよびyz直交図のZスタック。(A)未クリアの網膜オルガノイド(N = 3)。PFA固定網膜オルガノイドは、3D可視化には十分な透明ではありません。(B)フルクトース/グリセロールクリアオルガノイド(N = 3)。(C)ECiクリアオルガノイド(N = 3)。(D)FluoClear BABBクリアオルガノイド(N = 3)。スケールバー = 100 μm。略語:BF =明視野;CLSM = 共焦点レーザー走査型顕微鏡;RI =屈折率;PFA = パラホルムアルデヒド;ECi =桂皮酸エチル;BABB =ベンジルアルコール/安息香酸ベンジル;DIV = in vitro の日数。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

神経網膜オルガノイドの免疫蛍光研究のための光学的透明化法の比較

ここでは、網膜オルガノイドを透明化するためのFluoClear BABBの有効性を実証するための3つの透明化法の結果を示します。図1では、フルクトース/グリセロール(図1B)、ECi(図1C)、およびFluoClear BABB(図1D)で透明化されたレチナールオルガノイドを観察しています。試験したクリアリング法は、^10,11 で免疫蛍光染色に適合し、内因性タンパク質(GCaMPsに存在するGFPなど)からの蛍光を保存することが証明されているため、選択されました。

フルクトース/グリセロール¹²は、脱水を必要としない無毒でシンプルな浸漬清法であり、他の方法と比較して処理時間を大幅に短縮します。気道、腎臓、肝臓、ヒト乳がんなど、さまざまな組織に由来するオルガノイドの透明化に効率的であると報告されています¹²。

ECi(桂皮酸エチル)¹¹は、FDAが承認した化粧品^13,14用の食品フレーバーおよび添加剤であり、無害と考えられており、哺乳動物組織に対する優れた清澄試薬であることが証明されています。迅速なクリアリング能力と組織の歪みが少ないことで知られています。疎水性のクリア法に分類されますが、BABBベースの溶媒と比較すると、毒性がなく、蛍光タンパク質からの蛍光をより長く(最大14日間)保持します。ほとんどのクリアリングプロトコルで一般的であるように、ECiは事前の脱水ステップを必要とします。最適な結果を得るには、アルコール濃度を徐々に上昇させる溶液にサンプルを浸すことで、このステップを達成します。ECiは有害ではないため、サンプルがクリアされると、安全に操作してプラスチック容器に保管できます。ただし、脱水ステップは、ヒュームフードの下で操作してガラス容器に保存する必要がある有機溶媒である1-プロパノールを使用して実行されます。

FluoClear BABB¹⁰ は、屈折率マッチングソリューションとしてベンジルアルコール/安息香酸ベンジル(BABB)をベースにした疎水性プロトコルの変形型です。非常に毒性が高く腐食性が高いことが知られているため、取り扱いには注意が必要です。FluoClear BABBは、以前のバージョンよりもGFPとRFPをよりよく保存し、脱水剤として1-プロパノールまたはtert-ブタノールのいずれかを使用できる改良版であると説明されています。

3つのクリアリング方法の性能を評価するために、10x NA0.4空気対物レンズを搭載した共焦点顕微鏡でZ面をイメージングし、2.5 x 2.5 x 2.56 mmの広い視野(FoV)を提供して網膜オルガノイドの全容積を捕捉しました。成熟の中間段階(90日 in vitro (DIV))のレチナールオルガノイドを使用し、すべての網膜ニューロン(神経節細胞、双極細胞、および光受容体)を含み、細胞密度と圧縮を達成し、不透明にしました。冒頭で説明したように、光学的クリアリングは、撮像対象のオブジェクト全体でRIが一致したときに達成されます。したがって、イメージングに使用される液浸媒体は、達成される透明性に大きく影響します。 表2 に、液浸媒体のRIと試験した清澄溶液の詳細を示します。

	解決	屈折率
液浸メディア	空気	1
	水	1.33
	グリセロール	1.45
	油	1.51
清算ソリューション	フルクトース/グリセロール	1.468
	ECIの	1.558
	フルークリア BABB	1.56

表2:光学顕微鏡に最も使用される液浸媒体の屈折率(RI)と、網膜オルガノイドの透明化のために試験された光学的透明化方法。略語:RI =屈折率。

得られた共焦点画像(図1、右パネル)を比較すると、フルクトース/グリセロール処理は透明性の改善が最も少なく、網膜層の可視化を制限し、オルガノイドコアの可視化を妨げました。ECiは透明性を向上させ、網膜層の可視化を可能にしましたが、光散乱によるサンプル内部からの蛍光検出が妨げられるため、網膜オルガノイドコアの可視化はまだ制限されていました。FluoClear BABBは、透明性を最大限に向上させ、網膜オルガノイドのコアと皮質の両方を、同様の蛍光強度でより高い分解能で鮮明に可視化することを可能にしました。

ECiとFluoClear BABBのプロトコルはどちらも顕著なサンプルの収縮を引き起こしたことは、クリアされた各網膜オルガノイドの対応する明視野画像に示されていることに言及する価値があります(図1、左パネル)。サンプルの収縮は、水分を除去する前の脱水ステップによるものであり、それがフルクトース/グリセロールプロトコルがサンプルを収縮させない理由です。しかし、この縮小は、より深い探求のためのユニークな機会を提供します。オルガノイドの全体的なサイズを圧縮し、内部距離を過小評価する可能性がありますが、コンパクトさも向上します。この等方性コンパクトさは、すべての方向に比較的均一であるため、作動距離(WD)が短いため、最も外側のセル層のみをイメージングする優れた解像力(NAが大きいため)で高倍率の対物レンズを活用できます。例えば、10x NA 0.4 エア対物レンズの WD は 2.53 mm ですが、分解能が大幅に向上した 63x NA 1.4 オイル対物レンズの WD はわずか 0.14 mm です。BABBクリアのよりコンパクトなオルガノイドを利用することで、この制限を効果的に克服し、オルガノイドの内部に位置する神経節細胞層などのより深い構造の高解像度イメージングを実現できます(図2)。

図2:レーザー走査型共焦点顕微鏡でイメージングされたFluoClear BABBでクリアされた網膜オルガノイド(200 DIV)の3D再構成。 顕微鏡には、(A)10x NA 0.4空気対物レンズと(B)63x NA 1.5オイル対物レンズが装備されていました。クリアリングとイメージングにより、オルガノイド全体の可視化が可能になると同時に、関心のある領域の一部を細部までイメージングすることができます。DRAQ5(核)、オプシンB+GR(錐体)、TUJ1(ニューロン)。略語:DIV = in vitroでの日数。BABB =ベンジルアルコール/安息香酸ベンジル;NA = 開口数。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

結論として、クリアリングに選択したのは、高解像度とS/N比で網膜オルガノイド全体を優れた可視化を実現したFluoClear BABBでした。重要なのは、BABBによる収縮により、オルガノイドが等方的に圧縮されることです。このコンパクトさにより、高倍率の対物レンズを活用して、より深い構造の詳細な探索を行うことができました。最後に、BABBの油浸対物レンズとの互換性により、光散乱が最小限に抑えられ、倍率を問わず高品質のイメージングが可能になりました。

オルガノイド内の網膜細胞の成熟過程における同定と時空間分布

ここで詳述した方法論に従い、 表1に詳述した特異的抗体で免疫標識したオルガノイドにホールマウントイメージングを用いて、初期発生段階(40 DIV)からより成熟した段階(最大250 DIV)まで、成熟のさまざまな段階にあるオルガノイドから神経網膜がどのように形成されるかを研究し、明確に定義された3D構造を示します。このアプローチにより、このセクションで説明するさまざまな網膜成分の形成と組織化を視覚化することができました。

抗体	特異 性	ターゲット	Retina での場所	[ ]最終(希釈)	ホスト	#RRDI
アンチGFP	GFPの	GFPの	GCaMP6s陽性細胞	10 μg/mL (1:1,000)	チ	AB_300798
チャックス10	腹内側視床下部ホメオボックス2(Vsx2)	転写因子	神経芽細胞と双極細胞	10 μg/mL (1:2)	さん	AB_10842442
オプシンB	オプシンブルー	ブルーコーンの外側のセグメント	ブルーコーン	10 μg/mL (1:100)	Rbの	AB_177457
オプシンRG	オプシングリーンとレッド	緑と赤の円錐の外側のセグメント	緑と赤のコーン	10 μg/mL (1:100)	チ	AB_11213279
レコブ	リカバーイン	カルシウム結合タンパク質	光受容体	10 μg/mL (1:100)	Rbの	AB_2253622
RHO(RET-P1)	ロドプシン	ロッドの外側セグメント	棒	63 μg/mL (1:100)	さん	AB_260838
テュージ1	ニューロン特異的クラスIIIベータチューブリン	β-IIIチューブリンアイソフォーム	ニューロン	50 μg/mL (1:200)	さん	AB_2315514

表1:成熟のさまざまな段階から網膜オルガノイドで試験された一次抗体。略語:チキン= Ch;マウス = Ms;ウサギ = Rb。

異なるマーカーによる免疫標識により、この層状構造に適合する細胞の同定が可能になりました。TUJ1は、ニューロン特異的なクラスIIIベータチューブリン(表1)であり、その豊富さから、通常、切片化されたサンプルで網膜神経節細胞(RGC)¹⁵ を標識するために使用されます。TUJ1は、すべての網膜ニューロン¹⁶ および神経分化の初期段階¹⁷に存在します。TUJ1の発現は、オルガノイドの皮質におけるすべての成熟段階で見られ、層状網膜細胞の組織化の追跡を可能にしました。 図3では、開発の初期段階(40 DIV)では、TUJ1が薄く均一な1つの層に均一に分布していることがわかります。90 DIVから、オルガノイドの頂端領域は、頂端領域に蓄積する細胞がさらに多く存在するため、より密度が高く、よりコンパクトになります。170 DIVでは、レチナールオルガノイドは、離散的な頂端層を持つ3D層状網膜構造を獲得しました。200 DIVでは、オルガノイドの奥深くに、はるかに少ない数の長い突起を伸ばす他の細胞体があることがわかります。最後に、250 DIVでは、 図3 (右下)に示すように、(1)成熟した視細胞によって適合した外側の核層(ONL)、(2)主にバイポーラ細胞が占める内側の核層(INL)、および(3)RGCによって形成された神経節細胞層(GCL)に対応する3つの核層の構造が明らかになります。

図3:層層構造で成熟した網膜オルガノイドのニューロン組織。TUJ1で染色したFluoClear BABBクリア網膜オルガノイドの共焦点像のZスタック投影。40 DIV では、層状構造は形成されません。170 DIVから、神経網膜は層状に形成されます。網膜核層が示されています:ONL、INL、およびGCL(黄色の矢印)。スケールバー = 25 μm (左) と 10 μm (右)。略語:BABB =ベンジルアルコール/ベンジル安息香酸;DIV = in vitro の日数;ONL =外側の核層、INL =内側の核層。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

この方法論では、軸索の束の組み立てを報告することもできます。拡大した領域(図4)に見られるように、オルガノイドの内核から周辺に向かって伸びる繊維の束が、遠く離れた領域(最大1mm)に向かって突き出ているのが観察されました。興味深いことに、これらの繊維の形成は、成熟のさまざまな段階で発生しました。オルガノイドが成長するにつれて、繊維は太くなり、より複雑になり、より多くの細胞突起を収集します(図4 [250 DIV]および 補足ビデオS1)。RGCは、網膜の発達中に最初に分化する細胞であるため、発生の非常に早い段階から投影を配置できます。RGCは、オルガノイド内での最終位置を確立する前であっても、神経突起伸展を開始することがあります。私たちの調査結果は、網膜オルガノイドと脳オルガノイドの共培養における視神経様構造の形成を実証した以前の報告¹⁸ と一致しています。

図4:成熟のさまざまな段階でのニューロンの突起の組み立て。 線維は、網膜オルガノイドの内面から末梢に向かって伸びています。これらの繊維の形成は、40 DIVから研究対象の最も古い成熟点(250 DIV)まで、さまざまな成熟段階で発生しました。スケールバー = 25 μm (上段) と 100 μm (下段)。略語:DIV = in vitroでの日数。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

レチナールオルガノイドの頂端部位では、一部の光受容体は桿体に成熟し、薄暗い条件下での単色視力を検出するために外側のセグメントにロドプシンを含み、他の光受容体は錐体に成熟し、青、緑、赤のオプシンを発現し、明るい光条件下での色と高視力に関与します。 図5 (上)は、青色および/または緑/赤色のオプシンを発現した網膜オルガノイド内の錐体光受容体の集団を示しています(OPSIN BおよびGR、 表1)。これらの細胞は、核を除く細胞体全体に分布するさまざまなオプシンを持つ細長い形態を示します。特に、これらの細胞の外側の先端はより明るく見え、椎間板を含む視細胞の外側のセグメントに似ている可能性があります。蛍光検出のために単一のチャンネルを使用して青錐体と緑/赤錐体の両方を可視化するために、青色オプシン(OPSIN B、ウサギ)と緑/赤色オプシン(OPSIN GR、ニワトリ)に対する二次抗体を同じ蛍光色素でタグ付けし、チャネルの使用を最適化し、スペクトルのオーバーラップを回避しながらイメージングプロセスを合理化しました。 図5 (下)の視細胞のサブセットは、ロドプシンを発現し(RHO、 表1 および 補足ビデオS2)、桿体としてのそれらの同一性を明確に示しています。これらの桿体細胞は、前述した細長い形態を共有しており、核は中央に位置し、オプシンに富む細胞体はオルガノイドの周辺に向けられています。

図5:発達後期の網膜オルガノイド。 上:成熟したコーン、下:ロッド。TUJ1(ニューロン)、DRAQ5(核)、オプシン-B + GR(錐体)、およびRHO(桿体)で染色されたFluoClear BABBクリア網膜オルガノイドの共焦点画像のZ投影。概略図は参考のために示されています。スケールバー = 100 μm (左) と 10 μm (右)。略語:DIV = in vitroでの日数。BABB = ベンジルアルコール/安息香酸ベンジル。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

バイポーラ細胞とその時空間分布は、Chx10発現(Vsx2としても知られる)を250 DIVの成熟度で追跡することにより同定されました(図6)。Chx10(表1)は、発生中の網膜^19,20における前駆細胞の増殖および双極性細胞の決定に重要な転写因子である。ホメオボックス遺伝子として、神経芽細胞の発生初期に発現し、成熟した網膜では、双極細胞にのみ見られます。図6は、発生中のオルガノイド内のChx10陽性細胞の分布を示しています。最初に、多数のChx10陽性細胞が神経網膜末梢から中心に向かって伸びていることが観察されます。オルガノイドが成熟するにつれて、これらの細胞は存在量が少なくなり、双極性細胞が存在するINLに移動します。

図6:成熟度が250 DIVを超えるChx10発現。 DRAQ5(核)およびChx10(神経芽細胞および成熟双極細胞)で染色されたFluoClear BABBクリア網膜オルガノイドのZ投影共焦点画像。スケールバー = 100 μm。略語:DIV = in vitroでの日数。BABB = ベンジルアルコール/安息香酸ベンジル。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

最後に、GCaMPカルシウムマーカー由来の内因性GFPが、この方法論で透明化した後も保存されることを示します。 図7では、Ad5-CMV-GCaMP6sに感染し、抗GFPで免疫標識した70種類のDIV網膜オルガノイドの神経網膜を観察し、長期固定後の蛍光を増強することができます(表1)。

図7:FluoClear BABBクリア法で保存された内在性GCaMP。 Ad5-CMV-GCaMP6sに感染した70 DIVレチナールオルガノイドで、抗GFP(GCaMP発現細胞)、Chx10(神経芽細胞および初期バイポーラ細胞)、およびDRAQ5(核)で免疫標識されています。スケールバー = 100 μm (左) と 25 μm (右)。略語:BABB =ベンジルアルコール/ベンジル安息香酸;DIV = in vitro の日数。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足ビデオS1:ニューロンの投射の集合体を示す網膜オルガノイドの3D再構成。 紫色で表されたTUJ1(ニューロン)と黄色で表されたDRAQ5(核)で染色された250 DIVでのFluoClear BABBクリア網膜オルガノイドの共焦点画像のZ投影。略語:BABB =ベンジルアルコール/ベンジル安息香酸;DIV = in vitro の日数。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ビデオS2:発達後期のレチナールオルガノイドの表面に整列した桿体の3D再構成(200 DIV)。 FluoClear BABBクリア網膜オルガノイドの200 DIVでの共焦点画像のZ投影で、緑色でRECOV(光受容体)で染色され、緑色で表され、RHO(桿体)が紫色で表されます。略語:DIV = in vitroでの日数。BABB = ベンジルアルコール/安息香酸ベンジル。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

ここで説明するプロトコルは、成熟のさまざまな段階で網膜オルガノイドを形成する細胞の時空間分布の研究を促進し、その自然な3Dアーキテクチャを維持し、将来の個別化医療の文脈でこれらのモデルを理解するための重要な側面です。これは、異なる層と個々の細胞タイプのレベルで網膜構造の詳細なビューを提供し、グローバルな3Dコンテキストを維持しながら細胞内構造を視覚化することを可能にします。

ホールマウントイメージングの代替手段は、従来の切片(パラフィンまたは凍結保存)でイメージングを行うためのサンプルの後処理です。セクショニングは、タンパク質や構造の局在に関する貴重な情報を提供しますが、このデータは単一の平面に限定されているため、空間的な細胞接続の理解は困難です。その結果、錐体と桿体の割合や特定の領域における軸索束の形成などの特徴が正確に表現されない可能性があり、3次元での解釈が複雑になります。網膜オルガノイドは非常に不均一であり、異なる領域が異なる細胞タイプを含む可能性があり、および/または異なる程度の複雑さと分化を示します。ホールマウントイメージングは、サンプルの全体を表さない可能性のあるセクションのサブセットの選択に依存することなく、不均一性勾配をグローバルに分析できるため、この問題を解決します。

ライトシート蛍光顕微鏡(LSFM)21,22,23は、レーザー走査型共焦点顕微鏡の代替として使用できる。LSFMでは、厚さ数ミクロンの薄い光のシートで試料を照射し、照射された光学部から発生する蛍光を全てカメラで検出します。LSFMは広視野ベースの検出技術であり、光退色と光毒性の影響を最小限に抑えながら、大量のサンプル(最大センチメートルスケールのサンプル)を迅速に可視化するための非常に効率的な戦略を表しています。しかし、オルガノイドは、曲面を通過する光が入射角によって屈折が異なるため、大きな球面収差を示すことがあります。これらの実験では、この歪みが焦点の合わなさを生み、より深い構造のぼやけて解像度を損なうことにつながりました。当社の網膜オルガノイド(直径約1 mm)のイメージングには、レーザー走査型共焦点顕微鏡法が最も効果的なアプローチであることが証明されました。

このプロトコルは、私たちの実験要件に合わせて調整されています。これは、光学的にクリアされた網膜オルガノイドのホールマウントイメージングに挑戦する研究者の出発点として使用でき、それらが異なる場合は適応させる必要があります。このセクションでは、方法論の重要な手順、変更、および制限について詳しく説明します。

重要なステップは、クリアリングプロトコルの決定です。多くの基準を考慮する必要があります。まず、サンプルの類型について考えます。骨の透明化は脳組織の透明化と同じではなく、網膜オルガノイドの透明化と胃オルガノイドの透明化が異なるのと同様に、それぞれに異なるアプローチが必要です。異なるタイプの透明化されたオルガノイドを可視化するには、文献をレビューして、目的のサンプルに特に最適化されたプロトコルを特定することが不可欠です。フルクトース/グリセロールは、さまざまな組織(ヒト気道、結腸、腎臓、肝臓、乳がんオルガノイド、マウス乳腺オルガノイ^ド)に 由来するオルガノイドの透明化に有用であることが証明されている迅速で毒性のない透明化法ですが、ヒト網膜オルガノイドを透明にするには適していませんでした。私たちの知る限り、フルクトース/グリセロールを神経組織/オルガノイドに適用したと報告している研究はありません。したがって、この透明化方法は神経組織の清澄化には適していないと結論付けます。この非互換性の根本的な理由を解明するには、さらなる調査が必要です。

考慮すべきもう一つの重要な要素は、イメージング戦略と光学部品の選択に直接影響するため、必要なFoVです。大きなFoVは通常、低倍率の対物レンズで達成されますが、これは多くの場合、液浸媒体(空気、RI = 1.00など)を使用しないように設計されています。これらの対物レンズは、BABBクリアされたサンプル(RI = 1.56)をイメージングする際にRIのミスマッチが大きくなり、後処理中に深度の焦点がずれて修正する必要があります。対照的に、油浸対物レンズ(RI = 1.51)は、BABB(RI = 1.56)のような清澄溶液とのRIのミスマッチが少ないため、再校正の必要がありません。

単純な液浸法では、通常、高い透明性が得られず、ホールマウントサンプルの高品質な画像を取得するのには適していません。組織透明化プロトコルは、サンプルの膨潤または収縮を通じて効果的な分離に影響を与えます。実験の目的に応じて、膨潤または収縮のいずれかが有益です。サンプルを拡張するプロトコルは、同じ光学系で、以前は同じ詳細を表示できなかった微細な詳細の解像度を向上させることができます。収縮は、他の方法ではサンプルチャンバーに収まらない、または目標の作動距離に調整できない大きなサンプルを視覚化するために望まれる場合があります。ただし、収縮はサンプルを圧縮し、内部距離を歪める可能性があるため、この手法は寸法評価や細胞間距離の正確な測定には適していません。

考慮すべきもう一つの重要な要素は、蛍光タンパク質との適合性です。主に有機溶媒ベースのプロトコルは、高温を必要とする蛍光タンパク質をクエンチするか、RIマッチング溶液を埋め込みながら蛍光タンパク質を分解します。幸いなことに、ほとんどの方法は免疫標識技術と互換性があります。ただし、各エピトープの適合性は実験的に確認する必要があります。

さらに、大きなIgG分子の組織への浸透が妨げられ、染色効率が低下し、サンプル表面への標的構造の可視化が制限される可能性があります。抗体によるホールマウント検体の染色には、サンプルのサイズや性質によっては数日(または数週間)かかる場合があり、プロトコールの期間が大幅に長くなります。

最後に、光学機器との互換性は必須です。ほとんどの有機溶媒ベースの分析法(ECiを除く)は腐食性が高く、市販のサンプルチャンバーや液浸対物レンズと化学的に適合しません。さらに、一部のクリアリングソリューションには、利用可能な目的(通常は水)に必要な範囲と一致しないRIがあります。

プロトコルには、特別な注意が必要な手順がいくつかあります。FluoClear BABBは、疎水性のクリア法として、事前に脱水ステップが必要です。pHは、GFPなどの内因性タンパク質の蛍光を保持する上で重要な役割を果たします。次に、アルコール溶液のpHが適切に調整されていることを確認することが重要です。脱水症状は完全なクリアの鍵です。最適な結果は、アルコール溶液の勾配を増やしてサンプルをインキュベートすることで得られます。

サンプルのサイズは、抗体が特定の標的に到達するために重要な役割を果たします。抗体が均一に浸透せず、サンプルの外側に保持される可能性があります。このような場合は、別のタイプの界面活性剤(Tween-20またはSaponin)に切り替えて、界面活性剤と抗体の濃度とインキュベーション時間を増やすことを検討してください。これらの調整が不十分な場合、代替戦略で抗体の透過化を改善することができます。大きな標本(センチメートルスケール)のホールマウント免疫標識の場合、研究者はSDSが抗体のより深い浸透を促進できることを発見しました²⁴。SDSは、抗体の三次構造の部分的な喪失を誘発し、タンパク質を効果的に直鎖化し、組織のより深く浸透できるようにします。次に、SDSを洗い流すと、抗体の抗原結合特性が回復し、より厚い組織のより均一な染色が可能になり、サンプルの表面に一般的に観察されるより強い標識の勾配が減少します。

独自の蛍光二次抗体を調製すると、免疫標識設計の柔軟性が向上し、特定の蛍光色素と二次抗体の組み合わせを選択でき、同じサンプルで使用できる色の数が増えるなど、いくつかの利点があります。さらに、蛍光色素分子と抗体の比率を調整できるため、一般的に明るくなります。ただし、いくつかの側面を考慮する必要があります。カスタムメイドの二次抗体は、一般的に市販のものよりも安定性が低いため、新鮮な状態で使用する必要があります。ほとんどのリガンドは、4°Cで3〜6ヶ月間リガンド親和性を保持しますが、組み合わせによってはより早く劣化する可能性があるため、安定性を実験的に判断する必要があります。さらに、一部の抗体とフルオロフォアのペアは、抗体のエピトープに対する親和性を変化させ、部分的または完全な非特異的標識をもたらす可能性があります。信頼性を確保するために、まず培養細胞などのコントロールを用いてカスタムメイドの二次抗体を試験し、その後、実験検体に適用することをお勧めします。

この最適化されたプロトコールは、光学的透明化と免疫標識を統合し、ホールマウント網膜オルガノイドの共焦点イメージングを容易にします。構造的完全性を維持し、オルガノイド内の主要な網膜細胞タイプの同定を可能にします。したがって、このプロトコルは、研究者に網膜オルガノイドの成熟と空間的組織化を調査するための強力なツールを提供します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10x NA0.40 DRY 対物レンズ	ライカ	HC PL APO CS2	-
63x NA1.40 OIL対物レンズ	ライカ	HC PL APO CS2	-
抗GFP抗体	アブカム	アブ13970	-
ベンジルアルコール(BA)	シグマ・アルドリッチ	13162	-
安息香酸ベンジル(BB)	シグマ・アルドリッチ	W213802	-
底ガラスシャーレ	マットテック	P35G-1.5-14-C	-
ウシ血清アルブミン(BSA)	シグマ・アルドリッチ	A7030	-
Chx10抗体	スタ・クルス・バイオテック	SC-365519	-
Cytiva Illustra Nap-5 ゲルろ過カラム、Sephadex G-25	シグマ・アルドリッチ	17-0853-02	-
DAPIの	シグマ・アルドリッチ	D9542	-
DMSOの	シグマ・アルドリッチ	D8418	-
ドラキュ5	サーモフィッシャー	62251	-
染料(カルボン酸、スクシンイミジルエステル)	Invitrogen または Abberior	-	-
ImageJ/フィジー	NIHの	v1.50i	-
倒立共焦点レーザー走査顕微鏡	ライカマイクロシステム	TCS SP8 ステッド 3X-ファルコン	-
LAS X 3D処理ソフトウェア	ライカマイクロシステム	-	-
mQ H2O	-	-	Synergy浄水システムによる超純水
NaHCO3	アクロスオーガニック	424270010	-
非標識二次IgG	ジャクソン免疫研究	-	-
オプシンブルー抗体	ミリポア	AB5407	-
オプシンRG抗体	ミリポール	AB5745	-
パラホルムアルデヒド(PFA)4%	サーモサイエンティフィック	J199943-K2	-
PBSソリューション	ギブコ	18912-014	-
ファロイジン標識プローブ	サーモフィッシャー	-	-
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	ギブコ	10010023	-
RECOV抗体	ミリポール	AB5585-I	-
RHO(RET-P1)抗体	シグマ・アルドリッチ	O4886	-
クエン酸ナトリウム三塩基性二水和物	シグマ・アルドリッチ	C8532	-
トリトンX-100	シグマ・アルドリッチ	T8787	-
TUJ1抗体	コーバンス	MMS-435P	-