Method Article

マウスバレル皮質における概日シナプス可塑性の解析のための可視化技術としての透過型電子顕微鏡

DOI:

10.3791/68385

⸱

August 19th, 2025

 ,  , 
1Department of Cell Biology and Imaging, Institute of Zoology and Biomedical Research, Faculty of Biology, Jagiellonian University, 2Department of Histology, Jagiellonian University Medical College

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Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

提示されたプロトコルは、主にシナプス数と樹状突起棘の形態に焦点を当てて、マウスバレル皮質の概日変化を定量化するための透過型電子顕微鏡(TEM)の使用を説明しています。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

概日シナプス可塑性を調べるには、マウスを異なる照明条件(明暗サイクル、LD 12:12、および一定の暗闇、DD)下に収容し、走行中の車輪へのアクセスを提供し、24時間以内の4つの定義された時点でそれらを犠牲にする必要があります-日の初めと真昼/主観的な日中および夜の初めと真夜/主観的な夜。その後、透過型電子顕微鏡(TEM)のために脳を適切に固定します。正確な体性組織を持つ樽皮質は、そのような分析に理想的なモデルを提供します。必要な脳領域を得るために、脳をビブラトームで接線方向に切断し、バレル皮質を含むセクションを選択し、ポリベッド樹脂に埋め込みます。選択したバレルを含む準備されたブロックから、連続した極薄切片が切断されます。興奮性および抑制性のシナプス密度は、立体解剖法を使用して電子顕微鏡写真から分析されます。さらに、TEM 画像は樹状突起棘の 3D 再構成に使用されます。樹状突起棘の形状の変化は、日中のニューロンのリモデリングを示しています。興奮性シナプスの数は、マウスの睡眠中(日中)にピークに達し、抑制性シナプスは活動段階(真夜中)でピークに達します。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

概日リズムは、生物のほぼすべてのプロセスで概日時計によって生成されます。動物やヒトでは、分子レベル、細胞レベル、生物全体レベル、およびその行動で検出されています。生物の概日システムは、主要な概日時計(ペースメーカー)と末梢時計で構成されています。すべての概日時計は、タンパク質によって制御される時計遺伝子の周期的な発現を通じて概日振動を生成します。時計の分子メカニズムは、~1日(24時間より長いまたは短い)の周期で概日リズムを生成しますが、昼/夜の条件下では、内因性リズムの周期は24時間に同期します。多くの概日リズムは、無脊椎動物と脊椎動物の神経系の生理学で検出されています。しかし、いくつかの研究では、それらがシナプスおよびニューロンの可塑性、つまりシナプスと樹状突起の数と構造の変化にも存在することが示されています1,2,3,4。

マウスの体性感覚皮質は、その明確に定義された組織と動物の自発運動活動との直接的な関係により、一日を通してシナプス可塑性を研究するための優れた場所を提供します5,6,7,8,9。体性感覚野のIV層には、染色されていない脳でも非常に目立つ明確な神経構造(バレル)があります10,11。それらの配置は動物の鼻のひげの形態と組織を反映しており、感覚刺激を正確にマッピングすることができます。大きな樽は5列に並んでおり、それぞれに4〜7本の樽が入っています。大きなひげに対応する樽の列は、AからEまでの大文字でマークされ、鼻に沿って目の部分から下に配置されたひげを表しています。各樽は、中空、ニューロピルで満たされた中央部分、および星状細胞の体が支配する側面と呼ばれる壁の2つの主要な領域で構成されています。バレルは、セプタムと呼ばれる細胞密度の低い領域によって互いに分離されています。各バレルは、動物の鼻の反対側にある特定のひげからインパルスを受け取ります10,12。

規則的な列に配置された特定のバレルへの分割により、選択された領域10,13を迅速かつ容易に識別することができる。概日変化の分析のための行Bからのバレルの選択は、活動依存性可塑性の研究に基づいています14,15,16,17。行 B は、明確に定義された体性境界が特徴で、4 つの異なる大きな樽のみが含まれているため、サンプル内の位置が簡素化されます。その中心位置により、列Bニューロンの活動は、環境探索や自発運動などの自然なマウスの行動と相関しています。樹状突起の棘とシャフトのシナプスを数えるには、細胞体がまばらであるバレルの中央部分を選択することが重要です12,15,18。

共焦点顕微鏡イメージングと組み合わせた免疫組織化学は、マウスのシナプス可塑性の重要なメカニズムを明らかにする上で重要な役割を果たしている技術です。共焦点顕微鏡を使用すると、バックグラウンド蛍光が減少し、細胞構造の明瞭さが向上した高解像度画像が得られますが、光退色に悩まされ、複雑なサンプル前処理が必要となり、生体組織の状態が変化する可能性があります。蛍光マーカーに依存すると、重複しているため、同時に研究できるタンパク質の種類が制限される可能性があります。共焦点免疫蛍光顕微鏡は、抗体を使用して固定組織切片の標的抗原を検出することにより、特定のタンパク質、その発現レベル、およびシナプス活性に関連する局在を標識する手段を提供します。この方法は、神経伝達に関与するさまざまなタンパク質を研究するための特異性と柔軟性を提供しますが、固定ステップが関係するため、動的プロセスに関するリアルタイムデータを提供できないという制限があります。抗体結合の不一致は、信頼性の低い結果をもたらす可能性もあります19、20、21。

光学顕微鏡による免疫蛍光法の代わりに電子顕微鏡を使用すると、局在化の選択と神経構造の区別の両方において、大幅に高い解像度と精度が向上します。連続透過型電子顕微鏡 (TEM) 切片は、超微細構造レベルでシナプス構造を視覚化するのに役立ち、シナプスの形成または除去の研究に使用されるという利点があります。TEMは、シナプスの物性や、シナプスの可塑性と呼ばれる密度や構造の変化を解析することができます。サンプルの調製とイメージングは労働集約的ですが、TEMは、学習、記憶形成、感覚情報の処理中、および日、年、動物の年齢の間に起こる変化をより詳細に理解します。

私たちの方法は、連続 TEM 画像に基づく立体解剖法と組み合わせた最小 4 つの時点ベースのアプローチを使用して、シナプス密度と形態の概日ダイナミクスを調査することを目的としています。立体解剖法は、少数の極薄シリアルセクション22、23、24、25、26のみを使用する場合でも、シナプス数の信頼性の高い推定を可能にする。バレル皮質の明確に定義された体性組織により、研究場所の正確な解剖学的選択が保証され、連続 TEM によりシナプスの種類 (興奮性および抑制性) とその位置 (樹状突起棘およびシャフト上) の区別が可能になります。この方法は、日内および概日神経可塑性を調査する研究者にとって貴重なツールを提供し、環境要因と内部要因がシナプスダイナミクスにどのような影響を与えるかを調査できるようにします。私たちの方法の個々のコンポーネントは、必ずしも概日関連の変化に限定されるものではなく、はるかに幅広い研究における神経可塑性の変化の分析への応用を可能にします。

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

動物を含むすべての実験手順は、適切な機関倫理委員会によって承認され、科学目的で使用される動物の保護に関する欧州議会および理事会の指令2010/63 / EU、および国内規制に従って実施されました。動物の苦しみを最小限に抑え、使用する動物の数を減らすためにあらゆる努力が払われました。

1.脳組織の準備

  1. 24時間サイクルで、6時間ごとに4つの異なる時点で、明暗(LD 12:12)および一定の暗闇(DD)条件の両方でマウスを犠牲にします(図1)。LD 12:12の条件では、ZT0は光相の始まりに対応し、ZT12は暗相の始まりに対応するツァイトゲーバー時間(ZT)を参照してください。絶え間ない暗闇の中では、概日時間 (CT) を参照し、CT0 は主観的な一日の始まりを表し、CT12 は主観的な夜の始まりを示します。
    注: 時点は、ZT0/CT0 (一日の始まり、主観的な日)、ZT6/CT6 (日中、主観的な日)、ZT12/CT12 (夜の始まり、主観的な夜)、および ZT18/CT18 (真夜中、主観的な夜)。
  2. 0.1 Mリン酸緩衝液(pH 7.4)に2.5%グルタルアルデヒドと2%パラホルムアルデヒドでマウスの脳を灌流して固定します。
  3. 頭蓋骨から各脳を取り出し、固定液(0.1 Mリン酸緩衝液、pH 7.4中の2.5%グルタルアルデヒドおよび2%パラホルムアルデヒド)に4°Cで24時間放置します。
  4. セクショニングのために脳を準備するには、小脳を切断し、脳を2つの半球に分割します(図2A、B)。
  5. 1つの半球(右または左)を選択し、セクションがバレル皮質に接線方向に切断されるように向きを変えます。選択した半球をビブラトームチャックに取り付け、しっかりと接着します(図2C)。
  6. 厚さ60μmの切片(ビブラトーム切片速度:7.10、周波数:5.00)で切片を切断し(図2D)、切片を0.1Mリン酸緩衝液と固定液(1:5の比率)の混合物に移します。
  7. 4倍の倍率の光学顕微鏡で切片を検査し、次のステップのために可視バレルフィールド皮質を持つ切片のみを収集します(図2E)。凹面スライドを使用して、セクションが常に液体のままになるようにします。

2.脳の固定と切片化

  1. 絵筆を使用して、ティッシュを小さなガラスのペトリ皿にそっと移します。次に、脳切片を0.1 Mカコジレートバッファー(BC、pH 7.4)で3 x 5分間すすぎます。
  2. 切片を1.5%フェリシアン化カリウムを含む0.1 M BCの1%四酸化オスミウム(OsO4)に固定し、+4°Cで1時間放置します。
    注:OsO4 は不安定であり、その活性は時間の経過とともに低下するため、使用直前にOsO4溶液を準備してください。
  3. 1% OsO4 の 0.1 M BC 溶液中で室温で 1 時間、ポストフィックス切片。
    注: OsO4 は非常に有毒であるため、保護手袋を着用し、換気がうまく機能するヒューム フードの下でこれらすべての手順を実行してください。
    廃棄物は、しっかりとキャップをした別のボトルに保管する必要があります。 製品を排水管に入れないでください。
  4. 固定後、切片を蒸留水で2 x 5分間すすぎます。
  5. 次のステップでは、1%酢酸ウラニルを含む70%エタノールの溶液中で脳切片を40分間インキュベートします。混合後、フィルター(25 mm)付きのシリンジを使用し、2 mLの溶液を組織とともに各ペトリ皿にゆっくりと注ぎます。
  6. アルコールの上昇濃度で組織を脱水します:70%、80%、および90%エタノールをそれぞれ5分間、および100%エタノールをそれぞれ3 x 5分。
    注:組織を70%エタノール中で+4°Cで一晩放置することが可能です。
  7. プロピレンオキシドで組織を2 x 10分洗浄します。
    注: プロピレンオキシドは腐食性の高い化学物質です。保護手袋を着用し、ヒュームフードの下で作業するときは注意して使用してください。このステップでは、ガラス容器(ガラスペトリ皿)を使用することが重要です。
    プロピレンオキシドは非常に可燃性の液体および蒸気です。廃棄物は、別の密閉されたガラス容器に保管する必要があります。 製品を排水管に入れないでください。爆発の危険があります。
  8. プロピレンオキシドをポリベッド樹脂とプロピレンオキシドの混合物(1:1の比率)に置き換えます。少なくとも2 mLの溶液を切片とともに各ペトリ皿に注ぎ、蓋をして40分間インキュベートします。
  9. 最後に、Polybed樹脂とプロピレンオキシドの混合物(3:1の比率)に脳切片を埋め込みます。ペトリ皿ごとに少なくとも2 mLの混合物を使用し、蓋をして1.5時間放置します。
    注: 組織が完全に浸されていることを確認し、液体の上に浮かんでいないことを確認してください。
  10. Aclarフィルムをスライドガラスのサイズに合わせた小片にカットします。プラスチックピペットを使用して、少量の樹脂をAclarフィルムに塗布し、ペイントブラシでペトリ皿からレジンに脳切片を移します。各セクションを2つのAclarフィルムの間に埋め込み、65°Cのオーブンで48時間インキュベートして重合させます。

3. バレル皮質のイメージングと切片化

  1. 光学顕微鏡で2倍の対物レンズ倍率で脳切片を撮影します(図2F)。
  2. すべての画像を収集し、グラフィックソフトウェアにインポートします。
    1. 画像を開くには、[ファイル] |Shift |開く。画像は別のウィンドウで開きます。
    2. 皮質(最小の部分)から画像の積み重ねを開始し、すべてのセクションが正しく整列するまで続けます。
    3. レイヤー1を右クリック |各画像にレイヤーを複製 します。ダイアログボックスで、名前として画像番号を入力し、保存先ファイルとして 1 つの画像を選択して、[ OK] をクリックします。すべての画像に対してこれらの手順を繰り返し、同じ保存先ファイルに複製します。
    4. 画像を整列させてバレルフィールドを再構築し、適切な解剖学的順序を確保します。移動ツールを使用して各レイヤーを手動で配置し、編集 |変換 |必要に応じて、回転または反転ツールを使用して方向を調整します。線形を微調整するには、[編集] |変換 |画像の角を歪めて移動して、解剖学的構造に個別に一致させます。配置を簡単にするには、レイヤーパネルで最上層の描画モードをオーバーレイに設定します。
    5. 樽の輪郭や血管などの解剖学的ランドマークを比較して、正しい位置を確認します。スタックを保存するには、[ ファイル] |名前を付けて保存し、ファイルに名前を付けて、その形式(PSDまたはTIFF)を選択します。次に、[ OK] をクリックします。
  3. バレル フィールドを含む複数のセクションを順番に確認し、各セクションで表示されているバレルを特定します。
  4. 追加の共通レイヤーに目に見える各バレルの輪郭を手動で描き、バレルフィールド全体の再構築を確実にします。追加のレイヤーを作成するには、[ レイヤー] |新規 |レイヤーに名前を付けて、[ OK]をクリックします。ツールバーから ブラシ ツールを選択し、新しいレイヤーに、表示されている各バレルを手動で描画します。
    1. 精度を高めるには、 ズーム を使用し、必要に応じてブラシ サイズを調整します。画像をズームインおよびズームアウトするには、 ズーム ツールを使用するか、 Ctrl + "+" / Ctrl + "-" を押します。ブラシサイズを変更するには、 ブラシ ツールがアクティブなときにキャンバスを右クリックし、 サイズス ライダーを動かします。
  5. この再構成に基づいて選択したバレルを特定します。
  6. バレルフィールドのパターン(5列、それぞれ4〜7バレル)とバレルフィールド内の位置を示す血管の配置に基づいて、光学顕微鏡で選択したバレルを見つけます。
  7. バレル皮質が見える各セクションで、選択したバレルを実体顕微鏡で識別し、カミソリの刃を使用して隣接するバレルと一緒に切り取ります。
  8. セクションから小片を取り出し、樹脂ブロックに接着し、乾燥させます。その後、組織の周囲の余分な樹脂をトリミングします。
    注:ティッシュ片を樹脂の表面に平らに置いてください。
  9. ウルトラミクロトームとダイヤモンドナイフを使用して、極薄の連続切片(3〜6切片、厚さ65 nm)を切断し(図3A)、フォームバーコーティングされたシングルスロットニッケルグリッド(2 x 0.75 mm)に収集します。
  10. 乾燥したら、サンプルを2%酢酸ウラニルで3分間、0.03%クエン酸鉛で1.5分間造影します。
    注意: 対照的に、グリッドを数回洗浄し、各ステップの後に完全に乾かすことが重要です。酢酸ウラニルとクエン酸鉛のフィルター付き注射器を使用してください。
  11. 選択したバレルのくぼみ(B2など)から、TEM(分析に必要な面積と体積に応じて、4Kまたは8K倍率で80kVの加速電圧)下で連続した画像を撮影します。
    注:通常、動物あたり少なくとも100μm3 の総体積が分析されます。

4. 画像解析

注:TEM画像のスタックの作成と位置合わせは、フリーソフトウェア(GIMPなど)と商用ソフトウェア(Photoshopなど)の両方を使用して同じ方法で行うことができます。再構成も、市販のソフトウェア(3D Studio Maxなど)とBlenderなどの完全に無料のプログラムの両方を使用して、同じ方法で実行できます。

  1. シナプスの密度を推定するには、グラフィックスソフトウェアに少なくとも3つのTEM画像を積み重ねます(図6)。シリアル画像の数が多いほど、計算の精度は高くなります。
    1. 画像を開くには、[ファイル] |Shift |開いている;画像は別のウィンドウで開きます。
    2. 画像ごとに、 レイヤー 1 |レイヤーを複製します。ダイアログボックスで、名前として画像番号を入力し、保存先として画像を 1 つ選択して、[ OK] をクリックします。すべての画像に対して同じ手順を繰り返し、同じ宛先に複製します。
    3. スタックを保存するには、[ ファイル] |名前を付けて保存し、ファイルに名前を付け、その形式(PSDまたはTIFF)を選択して、[ OK]をクリックします。
  2. TEM画像を整列させるには、最上位の画像レイヤーを選択し、レイヤーパネルでブレンドモードをオーバーレイに設定します。編集を使用する |変換 |回転または反転ツールを使用して、画像の向きを調整します。移動ツールを使用して、構造を整列させます。
    1. より正確な調整を行うには、 編集 |変換 |歪み 画像の角を個別に移動します。精度を上げるには、 Ctrl キーを押しながら個々のコーナー ポイントをドラッグします。連続するTEM画像間でミトコンドリアと軸索ミエリン鞘のサイズと形状の変化を使用して、画像の正しいシーケンスを確認します。
  3. シナプスを数えるには解剖法を使用します。
    1. レイヤー |新規 |レイヤー |わかりました。新しいレイヤーが透明であることを確認します (背景の塗りつぶしなし)。
    2. 解析領域を定義するには、[ レイヤー] |新規 |レイヤー |わかりました。次に、 長方形 ツールを選択し、 レイヤー|レイヤースタイル |ストローク、ストロークの色、太さ(サイズ)、位置(内側推奨)を設定し、[ OK]をクリックして、長方形を描画します。[Fill: 0%] を選択します。TEM画像に存在する、長方形の2つの隣接する選択されたエッジ(たとえば、右と下または上と左)を交差しないすべてのシナプスをマークします。
    3. [ レイヤー] |新規 |レイヤー |わかりました。 ブラシ ツールを使用して、新しいレイヤーのシナプスをマークします。 ズーム ツールと ハンド ツールを使用して、正確なマーキングを行います。
    4. 興奮性シナプスをマークするには1つの色を選択し、抑制性シナプスには別の色を選択します。色を変更するには、ツールバーの前景色ボックスをクリックし、[ カラーピッカー] ウィンドウで色を選択して、[ OK]をクリックします。
  4. TEM画像に大きな構造(有髄神経線維、大きな樹状突起、細胞体の一部など)が含まれている場合は、複数の正方形を持つグリッドを使用します。これにより、大きな構造物で完全に占められている正方形を除外できます。
    1. レイヤー |新規 |レイヤー |わかりました。[表示] |ショー |グリッドをクリックし、[表示] |スナップ先 |グリッド。
    2. グリッド間隔を設定するには、 編集 |環境設定 |ガイド、グリッド、スライス。 線 ツールを選択し、 モード を 形状 または ピクセルに設定し、線の太さ(例:1ピクセル)を設定し、表示されているグリッドに沿って垂直線と水平線を描画して、画像領域全体をカバーします。
  5. 各画像スタックの「上」セクションと「下」セクションを定義します。最後の画像には存在しないが、前の画像には存在するシナプスのみをカウントします。これにより、シナプスの数を過大評価することなく、シナプスを正確に識別できます。
  6. 画像のスケールを使用して、サンプルの体積(TEM画像のスタック)を計算します。シナプスがカウントされる領域を測定し、スタック内のTEM画像の数と極薄切片の厚さを掛けます。
  7. シナプスの数を体積で割って、単位体積あたりのシナプス密度を決定します。
  8. 樹状突起棘を含むすべてのTEM画像(通常は10〜12枚の連続した電子顕微鏡写真)を使用して、樹状突起棘とそれが形成するシナプスを再構築します。
    1. グラフィックスソフトウェアで画像スタックを開きます。切り抜きツールを選択し、スタック内の樹状突起の棘を含む領域に印を付けて、Enter キーを押します。選択した領域は、表示されているすべてのレイヤーでトリミングされます。一度に1つだけ表示し、レイヤーパネルの目のアイコンを使用して他のレイヤーを非表示にします。
    2. トリミングした各画像を個別に保存するには、[ ファイル] |名前を付けて保存し、ファイルに名前を付け、形式 (JPG を推奨) を選択して、[ OK] をクリックします。スタック内の各レイヤーについて繰り返します。
      注: 画像を 3D 再構成ソフトウェアに転送する前に、まず再構成される要素に色でマークを付けることをお勧めします。
    3. [ レイヤー] |新規 |レイヤー |わかりました。
    4. レイヤーパネルで レイヤーの不透明度 を30〜50%に設定 します 。
    5. ブラシツールを選択し、構造ごとに異なる色(樹状突起棘、シナプスなど)を選択し、要素にマークを付けます。元の画像を保持するために、新しいレイヤーでのみ作業します。完了したら、注釈レイヤーを画像と結合し、一番上のレイヤーを右クリックして下に結合します。樹状突起棘の断面を含む各TEM画像に対して、これらの手順を繰り返します。
  9. 樹状突起棘の可視断面を含むTEM画像を3D再構成ソフトウェアに転送します。既定の Cube オブジェクトを削除するには、オブジェクトを右クリックして削除します。イメージをアップロードする前にビューポートのパースペクティブを位置合わせするには、ナビゲーション ギズモの Z をクリックするか、 テンキー 7 を押します。画像をアップロードするには、[追加] |画像 |参照し、最初の画像を選択し、ダブルクリックして確定します。画像ごとに繰り返し、ビューポートのパースペクティブが全体を通して一貫していることを確認します1。
    注: ビューを回転させるには、マウスの中ボタンを押したままマウスを動かすか、ナビゲーション ギズモを使用します。ビューをパンするには、 Shift + マウスの中ボタンを押したまま、マウスを動かすか、[ ビューを移動] を使用します。
  10. 極薄切片の厚さを考慮して、TEM画像を適切な距離に配置します(図4A)。最後のTEM画像をZ軸に沿って配置するには、画像をクリックし、[ オブジェクトのプロパティ] (右側のサイドバー)をクリックして、[位置Z]に値を入力します。これで、画像は最初の画像と最後の画像の間に分散できます。それらを配布するには、すべての画像を選択し、 N を押して Nパネルを開き、 編集タブ( Nパネル内)をクリックします 。Z 区。
    注: 調整を行う前に、ビューポートのパースペクティブを位置合わせし、ナビゲーション ギズモの Z をクリックするか、 テンキー 7 を押します。
    画像を配布するには、 配布 ツールを有効にする必要があります。有効にするには、 編集 |環境設定 |拡張機能を取得し、「 配布」を検索して、「 インストール」をクリックします。有効にすると、配布ツールはセッション間でアクティブなままになり、同じバージョンのプログラムが使用されている限り、再アクティブ化する必要はありません。
  11. TEM画像ごとに1つの曲線を使用して、各画像の樹状突起棘の形状を手動で輪郭を描きます(図4B、C)。
    1. 最初のTEM画像のみが表示されていることを確認してください。 シーン コレクションで、 目の アイコンを使用して他のすべてのオブジェクトを非表示にします。アウトラインのベースカーブを作成するには、 追加 |カーブ |円。BézierCircle オブジェクトを移動し、 G を押しながらマウスを動かし、クリックして変更を 受け入れ ます。
    2. 樹状突起の脊椎プロファイルのサイズに合わせるには、オブジェクトを拡大縮小し、 S キーを押しながらマウスを動かしてクリックします。BézierCircleオブジェクトを選択した状態で[ モデリング] タブに入ります。ビューポートのパースペクティブをもう一度整列し、ナビゲーション ギズモの Z をクリックするか、 テンキー 7 を押します。
    3. 曲線の形状を調整するには、制御点を選択し、 G を押しながらマウスを動かしてクリックします。
    4. ハンドルの方向と強度を調整するには、ハンドル ポイントを選択し、 G キーを押して移動するか、 S キーを押して拡大縮小し、クリックして確定します。各ポイントについて繰り返します。
    5. 新しい制御点を追加するには、既存の制御点を 2 つ選択し、 Shift キー を押しながら各点をクリックし、右クリックして [ 細分化] を選択します。曲線が樹状突起の脊椎プロファイルの境界に十分対応したら、[ レイアウト] タブに入り、[ ベジェ円]オブジェクト と [オブジェクトを複製]を右クリックし、マウスを動かさずにクリックします。再構成に使用されるTEM画像と同じ数のBézierCircleコピーを作成します。手順4.10のように、 分布 ツールを使用して、配置されたTEM画像に位置合わせします。
    6. モ デリングタブ の各ベジェ円曲線を調整して、各画像の樹状突起脊椎プロファイルに一致させます。現在編集されているベジェサークルオブジェクトと対応するTEM画像のみが一度に表示されることを確認してください。
      注: 特定のステップに必要なすべての右クリック アクションは、シーンの境界内で実行する必要があります。連続する曲線は、連続する樹状突起脊椎セクションの境界に対応し、同じ数の制御点を含む必要があります。
  12. 3D再構成機能を使用して隣接する線を接続して連続したサーフェスを形成し、最終的な3D形状を作成します(図4D)。
    1. BézierCircle オブジェクトのみが表示されていることを確認します。 シーンコレクションで、サイドバーの 目の アイコンを使用して、他のすべてのオブジェクトを非表示にします。
    2. 樹状突起の背骨オブジェクトを作成するには、[ レイアウト] タブに移動し、すべてのベジェサークル オブジェクトを選択して右クリックして、[結合]をクリックします。結合したオブジェクトをメッシュに変換するには、右クリックして [変換先] |メッシュ。
    3. 結合されたオブジェクトのエッジを接続するには、[ モデリング] タブに入り、 2 を押して [エッジ選択]モードに入ります。選択 |すべて |右クリック |ブリッジエッジループ。
    4. オブジェクトの上部のギャップを埋めるには、オブジェクトの横をクリックしてすべての選択を解除し、 Alt キーを押しながら上部の棚の1つのエッジセクションをクリックし、右クリックして [エッジを押し出し]を選択し、Z軸を上にドラッグし、 S キーを押しながらマウスを動かして新しいエッジループを縮小し、クリックして変更を受け入れます。新しいエッジループが選択されたまま、右クリックして[ エッジから新しい面]を選択します。同じ方法で下部の隙間を埋めます。
    5. オブジェクトをスムージングするには、[ レイアウト] タブに入り、右クリックして[ シェード スムーズ]を選択します。形状をさらに滑らかにするには、 モディファイアー (右側のサイドバー) |モディファイヤを追加 |生成 |サブディビジョンサーフェス。 ビューポート(Viewport )レベルと レンダー(Render) レベルの両方を同じ値( 推奨 1)に設定します。
  13. シナプス再構築のためにステップ4.11〜4.12を繰り返します(図4E、F)。
  14. 各構造に色を割り当て、レンダリング機能を使用して最終的な画像を準備します(図4G、H)。 [ビューポート シェーディング](Viewport Shading )メニューに移動し、[ レンダリング](Rendered) を選択して、マテリアルの変更をプレビューします。色を付けるオブジェクトを選択し、 マテリアル( 右側のサイドバー) |新しい|adjustベースカラー。
    1. マテリアルの外観を微調整するには、必要に応じて [粗さ] または [メタリック] スライダーを調整します。この方法を使用して、各構造物に個別の色を割り当てます。
    2. シーンの照明を調整するには、ライトオブジェクトをクリックし、 G を押したままマウスを動かして位置を変更します。光の強度を変更するには、[ データ ] (右側のサイドバー) に移動し、[ パワー ] の値を調整します。
    3. カメラを配置するには、再構築された背骨が最終画像に表示されるようにビューポートの向きを合わせ、 Ctrl + Alt + テンキー 0 を押します。表示されているカメラフレームを選択し、Gを押したまま、必要に応じてマウスを動かして位置を変更します。
    4. レンダリングの準備をするには、 出力 (右側のサイドバー) に移動し、 解像度 X と Y の値を目的の画像に合わせて変更します。画質を向上させるには、 レンダリング (右側のサイドバー) |レンダリング、サンプル値を120〜250に調整します。透明な背景の場合は、 レンダリング |映画 |[ 透明](Transparent)にチェックを入れます。画像をレンダリングするには、F12を押すか、 レンダリング( 上部メニュー) |イメージをレンダリングします。

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

概日シナプス変化の分析に私たちの方法を適切に適用するには、動物の活動の各段階(6時間ごと)に2つのポイントを、等間隔で少なくとも4つの時点を選択することから始める必要があります。これらの指定された時点で、動物は生け贄に捧げられ、脳が収集されます。このアプローチにより、シナプス可塑性の毎日または概日パターンの特定が可能になり、それらを動物の自発運動活動の変化に関連付けることができます(図1)。2つの時点のみを使用すると、活動段階間のシナプス密度の違いを分析できますが、シナプス変化の実際のパターンを正確に反映できない可能性があります。概日効果を検出するための検出力分析は、0.9を超える統計的検出力を達成するには、時点あたり5匹の動物のグループサイズで十分であることを示しました。このサンプルサイズは、統計的堅牢性と動物使用に関する倫理的考慮事項のバランスをとるために最適であると考えられていました。

マウスの体性感覚皮質の構造により、研究場所の正確かつ再現性のある選択が可能になり、染色されていない脳でも見ることができます(

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、シナプスの概日可塑性とマウスの樽皮質における樹状突起棘の再構築を研究するために使用した方法論を紹介しました。信頼できる結果を確保するために、概日可塑性研究には少なくとも 4 つの時点を含める必要があります。私たちの研究は、休息期(日中)と活動期(夜間)の2つの時点のデータが、LD 12:12条件下での動物の活動段階間の毎日の違いに関する情報を提供することを示しました。総シナプス密度(興奮性と抑制性の両方)は、活動(運動活動)段階と比較して、休息段階(睡眠)中に21%高かった。さらに、興奮性シナプスの数は、活動期と比較して休止期に約40%増加し、抑制性シナプスは活動期に26%多く増加しました5。

分析を4つの時点に拡大することで、シナプス可塑性の毎日のパターンを特定することができました。総シナプス密度は一日の初め以降に徐々に減少し、真夜中に対応するZT18で最低レベルに達しました。興奮性シナプスでも同様の傾向が観察され、さらに顕著な低下が見られました。対照的に...

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Disclosures

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著者には宣言すべき利益相反はありません。

Acknowledgements

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この研究は、ポーランドの国立科学センター、NCN OPUS20 nr UMO-2020/39/B/NZ7/03366 から EP およびヤギェウォ大学医科大学 (nr N41/DBS/001129 から MJ への助成金によって支援されています。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
アクラフィルム寒天科学AGL4458
ブレンダーソフトウェア バージョン: v. 2.91.2
カコジル酸、ナトリウム塩三水和物ポリサイエンス01131-100
凹面スライドメンゼル9.161 151
ダイヤモンドナイフ 珪藻土15-米国ナイフ角度:ウルトラ45° 
デジタルカメラ ニコン DXM 1200 F
リン酸水素二ナトリウム十二水和物ポック799280115
埋め込み樹脂ポリサイエンス08792-1ルフト配合 
エタノールポルオーラPA-11-0004
GIMPソフトウェアバージョン: v 3.0.4
クエン酸鉛TAABのL018
光学顕微鏡 ニコン オプティショット
四酸化オスミウム ポリサイエンス0223C-10結晶性 (99.95%)
絵筆
Photoshopソフトウェアバージョン: CS5
フェリシアン化カリウムシグマルドリッチP8131
プロピレンオキシド シグマルドリッチ82320ピュリス。p.a.、≥99.5% (GC)
シングルスロットグリッド寒天科学AGG25252 x 0.75 mmまたは2 x 1 mm
塩化ナトリウム ケムプール117941206
リン酸二水素ナトリウム二水和物ケムプール117991808
実体顕微鏡PZO
シリングフィルター バイオセンスBS25PES045
TEM ヨエルJEM-2100型
ウルトラミクロトームライカUC7
酢酸ウラニルラケマ
ビブラトームライカVT1000 S

References

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