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方法論記事

SARS-CoV-2ウイルス様粒子系の作製によるウイルスライフサイクルの in vitro

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DOI:

10.3791/68389

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2025年6月6日

 ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Beijing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

私たちは、本物のウイルスを密接に模倣したSARS-CoV-2ウイルス様粒子を生成するための最適化された in vitro プロトコルを提示します。このアプローチにより、バイオセーフティレベル3の実験室を必要とすることなく、ウイルスの感染、組み立て、および出口メカニズムの調査が可能になります。

要約

重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)ウイルス様粒子(SC2-VLP)法は、バイオセーフティレベル3(BSL-3)の研究所を必要とせずに、SARS-CoV-2のライフサイクルを研究するための強力でアクセス可能なツールを提供します。このシステムは、T20シグナルに融合したルシフェラーゼレポーターを使用して、アセンブリ、ゲノムパッケージング、出口など、ウイルスのライフサイクルの重要な段階を効果的に模倣し、ウイルス粒子の産生を高感度かつ正確に検出します。SC2-VLPは、HEK-293T細胞のRNAパッケージングシグナルとともに、膜(M)、ヌクレオカプシド(N)、エンベロープ(E)、スパイク(S)などのSARS-CoV-2構造タンパク質を共発現させることによって生成されます。従来のウイルス様粒子系とは異なり、SC2-VLP法は正確な定量と自然なウイルスライフサイクルへの忠実度の向上を保証します。さらに、HIVベースのレンチウイルス粒子にSタンパク質を取り込むことでウイルスの侵入を研究するレンチウイルスの疑似タイピング法と比較して、SC2-VLPシステムは、SARS-CoV-2生物学の複数の段階を探索するためのより包括的なプラットフォームを提供します。この方法は、生きたウイルスの取り扱いのリスクを回避し、アクセシビリティを拡大します。SC2-VLP法は、抗ウイルス研究とSARS-CoV-2に対する治療戦略の開発における大きな進歩を表しています。

概要

COVID-19のパンデミックは、現代史で最も壊滅的な世界的な健康危機の1つとして浮上し、世界中で何百万人もの死者を出しています1。原因となるウイルスであるSARS-CoV-2は、感染、ゲノム複製、組み立て、出口などの主要な段階を含む複雑なライフサイクルをたどります。感染プロセスは、ウイルスのスパイクタンパク質(S)が宿主細胞受容体であるアンジオテンシン変換酵素2(ACE2)に結合し、ウイルスゲノムの宿主細胞への放出を促進するときに始まります2,3。次に、ウイルスのRNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRp)は、ゲノムRNAの複製を触媒します。このRNAは、ヌクレオカプシドタンパク質(N)と複合体を形成し、膜タンパク質(M)によって認識される安定した構造を形成します。Mタンパク質は、RNA-N複合体Sとエンベロープタンパク質(E)4,5を動員することにより、ウイルスの集合において中心的な役割を果たします。組み立て後、ビリオンは非標準的なリソソーム媒介の人身売買経路6を通ってその出口を完了する。

パンデミックに対応して、ワクチン、中和抗体、抗ウイルス薬の開発に、世界に多大な資源が動員されました。これらの介入の評価は、SARS-CoV-2研究を進める上で不可欠でした7。しかし、生きたウイルスの研究には、ウイルスに関する実験をバイオセーフティレベル3(BSL-3)の研究所で実施する必要があるため、物流上の大きな課題があります。BSL-3施設の利用可能性が限られているため、SARS-CoV-2の理解と闘いを目的とした研究のペースが制約されています。

これらの課題に対処するために、SARS-CoV-2の研究には、ウイルス様粒子(VLP)とレンチウイルスのシュードタイピングという2つの主要なシステムが広く採用されており、どちらもBSL-3の封じ込めを必要としない8。VLPシステムは、M、S、E、Nなどのウイルス構造タンパク質をコードする遺伝子を細胞に同時導入し、これらが一緒になってウイルス様粒子を生成します。これらの粒子は、ウイルスの構造的および機能的特性を模倣しているため、SARS-CoV-2のライフサイクルにおける主要なプロセスを研究するための貴重なツールであり、さらにはワクチン開発に有効な抗原でもあります9,10,11。

一方、レンチウイルスのシュードタイピングシステムでは、レンチウイルスの水疱性口内炎ウイルス(VSV)Gタンパク質をSARS-CoV-2 Sタンパク質に置き換えることで、ルシフェラーゼやGFPなどのレポーター遺伝子を取り込むレンチウイルス粒子の産生が可能になります。このシステムは、S-ACE2相互作用を阻害する中和抗体の研究に特に有用である12。しかし、レンチウイルスのシュードタイピングは、原形質膜での粒子放出を媒介するHIV構造タンパク質を使用しているため、SARS-CoV-2ウイルスの集合または排出を反映していません。

これらの制限を克服するために、Syedらは最近、RNAゲノム内のSARS-CoV-2パッケージングシグナルを同定し、ウイルスゲノム認識に対するNタンパク質の特異性を実証しました13。このパッケージングシグナルをレポーター遺伝子に融合させることで、これらの遺伝子をSARS-CoV-2ウイルス様粒子(SC2-VLP)に効率的に取り込むことが可能である13。この戦略は、SARS-CoV-2の組み立てと出口のプロセスを再現するだけでなく、感染ステップの高感度な測定も可能にします。本研究では、SC2-VLPシステムを使用するための実験方法論を紹介し、このアプローチを実施するための重要な考慮事項に焦点を当てます。

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プロトコル

1. SC2-VLPの生成

  1. 直径10 cmの組織培養プレートに~3.0 × 106 HEK-293T細胞を10 cmのDMEM完全培地で播種し、10% v/v FBSと1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加します。
    注:高いトランスフェクション効率と最適なSC2-VLP産生を確保するために、HEK-293T細胞は低い継代数~10に維持する必要があります。
  2. HEK-293T細胞を37°C、5%CO2 で約24時間培養し、顕微鏡で細胞の密度を確認します。~70% がコンフルエントな場合は続行します。
  3. 1 mg/mLストックのPEI60 μLを無血清培地で200 μLに希釈します。
  4. 6.7 μgのNプラスミド、10 μgのLuc-T20プラスミド、0.016 μgのSプラスミド、および3.3 μgのM-IRES-Eプラスミドを200 μLの無血清培地に加えます( 補足ファイル1を参照)。
  5. ステップ1.3で希釈したPEIを、ステップ1.4でウイルス構造タンパク質をコードするプラスミドを含む溶液に穏やかに加え、室温で10分間インキュベートします。これがトランスフェクションソリューションです。
  6. ステップ1.5のトランスフェクション溶液をHEK-293T細胞に慎重に滴下し、組織培養プレートを静かに渦巻かせて十分に混合します。
  7. 感染後6時間後に細胞培養培地をDMEM完全培地と交換し、トランスフェクションしたHEK-293T細胞を37°C、5%CO2 で48時間インキュベートします。
  8. 感染したHEK-293T細胞の上清(SC2-VLPを含む)を採取し、0.45μmのシリンジフィルターで上清をろ過して細胞の破片を取り除きます。これがSC2-VLP媒体です。
    注:HeLa、Vero E6、およびCaco2細胞株でSC2-VLPを作製しようと試みましたが、測定可能なウイルス力価は得られず、HEK-293T細胞に対するプロトコルの特異性が示されました。

2. SC2-VLPの有効性の検討

注:ACE2およびTMPRSS2を安定的に発現するHEK-293T細胞株は、レンチウイルス形質導入アプローチを用いて樹立された14,15。ACE2およびTMPRSS2の両方のタンパク質発現は、ステップ3(SC2-VLP組成分析)で説明したのと同様のプロトコルに従って、ウェスタンブロット分析によって確認されました。

  1. 96ウェルプレートでACE2およびTMPRSS2の安定発現を持つ4.0 × 104 HEK-293T細胞を播種し、ステップ1.8から50 μLのSC2-VLP培地を添加します。
  2. 96ウェル組織培養プレートを37°Cで5%CO2 と共に24時間インキュベートします。
  3. 培地を96ウェルプレートから取り出し、137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4、および1.8 mM KH2PO4を含む100 μLのPBSバッファーを37°Cで1回洗浄します。
  4. HEK-293T ACE2/TMPRSS2細胞を20 μLのパッシブ溶解バッファーで溶解し、サンプルを室温のオービタルシェーカーで15分間静かに振とうします。
    注:溶解バッファーには、25 mMのリン酸トリス(pH 7.8)、2 mM DTT、2 mM 1,2-ジアミノシクロヘキサン-N、N、N'、N'-四酢酸、1.25 mg/mLリゾチーム、2.5 mg/mL BSA、10%グリセロール、および1%トリトンX-100)が含まれています。
  5. 96ウェルプレートを冷蔵マイクロプレート遠心分離機で4,000 × g 、4°Cで15分間回転させた後、すぐにプレートをアイスバスに移します。
  6. 再構成したルシフェラーゼアッセイバッファー100 μLを不透明な白色96ウェルプレートに取り、ステップ2.5のライセート20 μLを添加します。ピペッティングで2〜3回軽く混ぜます。
  7. プレートリーダーを使用して、次のパラメータで発光を測定します: 検出モード:発光;波長範囲:フルスペクトル。プレートフォーマット:96ウェル標準不透明プレート;積分時間:200ミリ秒

3. SC2-VLP組成の検討

  1. ステップ 1.8 の SC2-VLP 培地 10 mL に、50% PEG 8000 と 2.2% NaCl を含む 1.36 mL の PEG 8000 溶液を加えます。
  2. 混合物をオービタルシェーカーに保管し、溶液を4°Cで一晩ゆっくりと混合します。
  3. 溶液を4°C、2,000 × g で30分間遠心分離し、SC2-VLPペレットをウェスタンブロッティング分析のために回収します16。
    注:ウェスタンブロッティング分析では、抗体に関するすべての情報が 材料表に記載されています。

4. SC2-VLP産生細胞におけるSおよびその変異体の細胞内局在解析

  1. 直径15 mmのガラス底培養皿に~3.0 × 10個の 6 HEK-293T 細胞を均等に播種し、トランスフェクション前に細胞を ~70% のコンフルエントになるまで接着して増殖させます。
  2. ステップ 1.3 から 1.7 で説明したトランスフェクション手順を繰り返し、次のようにプラスミドの量のみを変更します: N プラスミド: 1.3 μg、Luc-T20 プラスミド: 2 μg、S プラスミド: 0.0032 μg、M-IRES-E プラスミド: 0.66 μg。
  3. 培養皿を氷冷PBS1 mLで2回穏やかに洗浄し、4%パラホルムアルデヒド(PFA)固定溶液1 mLを室温(RT)で15分間加えます。
  4. RTで1 mLのPBSで細胞を2 x 5分間洗浄し、その後、0.25% Triton X-100 1 mLをRTで10分間加えて細胞を透過化します。
  5. RTで1 mLのPBSで細胞を2 x 5分間洗浄し、次にRTで5%ウシ血清アルブミン(BSA)1 mLを1時間加えて、非特異的抗体相互作用をブロックします。
  6. ~200 μLの一次抗体溶液(ガラス底を覆うのに十分)を加え、4°Cで一晩インキュベートします。
    注:一次抗体溶液は、PBSに溶解した5% BSAを次の希釈比で希釈することにより調製します:マウス抗S抗体1:200、ウサギ抗Sec61β抗体1:200、ウサギ抗GM130抗体1:200、およびウサギ抗ERGIC53抗体1:200。5% BSA/PBS溶液は、希釈剤およびブロッキングバッファーの両方として機能し、その後の免疫蛍光染色手順における非特異的結合を最小限に抑えました。
  7. 一次抗体溶液を取り出し、RTで1 mLのPBSで細胞を3 x 5分間洗浄します。
  8. 蛍光標識二次抗体溶液を室温で1時間加えた後、室温で1mLのPBSで細胞を3×5分間洗浄します。
    注:その後のすべての手順は、蛍光コンジュゲートの光退色を防ぎ、シグナルインテグリティを維持するために、暗闇または最小限の光曝露で実行する必要があります。マウスまたはウサギに由来する2種類の蛍光標識二次抗体を使用して、Sタンパク質または細胞小器官マーカータンパク質のいずれかを染色します。
  9. 2.5 μg/mL Hoechst溶液で核を室温で5分間染色し、その後、室温で1 mLのPBSで細胞を3 x 5分間洗浄します。
  10. Sタンパク質またはオルガネラの染色を観察し、共焦点顕微鏡を使用して次のパラメータで画像を取得します:PMTモードをVBF(平均化なし、ラインシーケンシャルスキャン)に設定、自動共焦点開口付き。チャンネル 1 (FITC) では、488 nm レーザーを 25% 出力、500 - 548 nm 放射、HV 525 V、ゲイン 1x、オフセット 5% で使用します。チャンネル2(Alexa Fluor 594)では、594 nmレーザーを25%の出力で使用し、610 - 670 nmの放射、HV 500 V、ゲイン1x、オフセット5%で使用します。チャネル 3 (DAPI) では、405 nm レーザーを 25% の出力で使用し、430 から 470 nm の放射、HV 490 V、ゲイン 1x、オフセット 5% を使用します。

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結果

SARS-CoV-2のライフサイクルの出口と組み立てのステップは、感染と複製のステップ17,18よりも研究されていません。SC2-VLP法が開発される前は、これらのプロセスは生きたSARS-CoV-2を使用してのみ調査することができ、研究はBSL-3研究所に限定されていました13。図1に示すSC2-VLPワークフローは、実験プロトコルの概要を示し、SARS-CoV-2ライフサイクルのこれらのステップに関与するプロセスを示しています。このアプローチでは、SARS-CoV-2の構造タンパク質(M、E、S、N)とRNAパッケージングシグナル(T20)をコードするプラスミドをHEK-293T細胞に同時トランスフェクトします。T20シグナルに融合したルシフェラーゼレポーターにより、放出されたSC2-VLPを高感度に検出でき、図1に示すように、SARS-CoV-2受容...

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ディスカッション

BSL-3研究室の制約を受けずに、細胞培養システムにおけるSARS-CoV-2のライフサイクルをモデル化するシンプルで効果的な方法は、抗SARS-CoV-2研究にとって極めて重要な進歩です。SC2-VLP法はこのニーズを満たし、堅牢でアクセス可能なプラットフォームを提供します。この研究では、SC2-VLP法の詳細なプロトコルを提供し、SC2-VLPを作製するための重要な実験ステップを概説します。さらに、SARS-CoV-2生物学の理解を深め、抗ウイルス戦略の開発を促進するためのその汎用性と潜在的なアプリケーションを強調します。

従来のSARS-CoV-2 VLPおよびレンチウイルスシュードタイピング法は、抗SARS-CoV-2研究で広く使用されています8,25。従来のVLP法では、SARS-CoV-2の構造タンパク質M、N、E、Sが共発現してウイルス粒子を作製します

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開示事項

著者には、開示すべき利益相反はありません。

謝辞

この研究は、北京中医薬大学(BUCM)(90011451310011)のスタートアップファンドプログラムの支援を受けました。BUCMのMa博士研究室の全てのメンバーに、実験に関する貴重な議論と支援をいただいたことに感謝いたします。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ウシ血清アルブミン (BSA)細胞シグナル伝達技術9998S
共焦点レーザー走査顕微鏡オリンパスFV3000
DMEMコーニング10-013-CV
ウシ胎児血清 (FBS)サーモフィッシャーA5670402
ヤギ抗マウス IgG H&L (Alexa Fluor 488) 抗体InvitrogenA11001希釈比: IF 1:1000
ヤギ抗ウサギ IgG H&L (Alexa Fluor 594) 抗体Abcamab150080希釈比: IF 1:1000
HEK-293T 細胞株National Infrastructure of Cell Line Resource (NICR)NICR-293T-001高いトランスフェクション効率と最適な SC2-VLP 産生を確保するには、HEK-293T 細胞を低い継代数 (≤P10)。
Hoechst 33342InvitrogenH1399作業濃度: 2.5 &g/mL
ルシフェラーゼ レポーター アッセイ システムPromegaE1500
Luc-T20Addgene177941
マウス モノクローナル抗 GAPDHProteintech60004-1-Ig希釈比: WB 1:20,000
マウス モノクローナル抗 S RBDアブクローナルA23771希釈比: IF 1:200
OptiMEMThermofisher31985070トランスフェクション用無血清培地
PEG3350Sigma-AldrichP3635
PEG8000Sigma-AldrichP2139
ペニシリン-ストレプトマイシンThermofisher15140122
ポリエチレンイミン (PEI)Thermofisher43896.01
Promega 受動溶解バッファーPromegaE1941
ウサギポリクローナル抗ACE2Proteintech21115-1-AP希釈比:WB 1:1000
サギポリクローナル抗ERGIC53Proteintech13364-1-AP釈比:IF 1:200
サギポリクローナル抗GM130Proteintech11308-1-AP釈比:IF 1:200
サギポリクローナル抗SAbcamab272504釈比:WB 1:1000
ウサギポリクローナル抗Sec61&β;Proteintech15087-1-AP希釈比:IF 1:200
ウサギポリクローナル抗TMPRSS2Abcamab109131釈比:WB 1:1000
SARS-CoV-2 M-IRES-EプラスミドAddgene177938
SARS-CoV-2 NプラスミドAddgene177959
SARS-CoV-2 Nucleoprotein Rabbit mAbAbclonalA21042釈比:WB 1:4000
SARS-CoV-2 S プラスミドAddgene177960
二次抗体、HRP、ヤギ抗マウス IgG (H+L)Invitrogen31460希釈比: WB 1:5000
二次抗体、HRP、ヤギ抗ウサギ IgG (H+L)Invitrogen31430希釈比: WB 1:5000
SpectraMax i3x プレートリーダー 分子デバイスSpectraMax i3x
ウ希ウ希ウ希希希

参考文献

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