シロイヌナズナロゼットを用いた葉表面とアポプラスドRNAの単離と解析の段階的ガイド

サマリー

シロイヌナズナ植物の葉の表面とアポプラストから細胞外RNAを単離するためのシンプルでありながら再現性の高い方法について説明します。

要約

植物の葉の表面と葉内の細胞間空間(アポプラスト)は、植物と相互作用する微生物との間の分子交換の重要な界面として機能します。以前の研究では、シロイヌナズナのロゼットのアポプラストに多様なRNA種が存在することを実証しました。最近では、シロイヌナズナ植物も葉の表面にRNAを活発に分泌していることが明らかになりました。これを調査するために、同じシロイヌナズナ植物から葉表面洗浄液(LSW)とアポプラスド洗浄液(AWF)の両方を収集する再現性の高い方法を開発しました。さらに、葉表面綿棒(LSS)を用いた非侵襲的な技術を研究し、滅菌した綿の先端を無菌の棒で葉の表面を優しく拭くことでRNAを採取しました。微生物汚染のリスクを最小限に抑えるために、細胞外RNA(exRNA)を単離する前に、LSW、AWF、およびLSS画分をろ過しました。精製したexRNAを変性RNAゲル電気泳動で分析したところ、LSW、LSS、AWF RNAサンプルに多様な長粒RNA種と小RNA種が観察されました。exRNAサンプルと実験条件の間のさらなる定量化と比較分析は、自由にアクセスできるソフトウェアImageJを使用して実行されました。このプロトコルは、植物の葉から少量のexRNAを単離および分析するための効率的で費用対効果の高いアプローチを提供します。これらの RNA 調製物は、シーケンシングやその他の分子分析を通じてさらに特徴付けることができ、植物と微生物の相互作用における exRNA の動的役割についての洞察を提供します。

概要

葉には細菌、真菌、卵菌、原生生物などのさまざまな微生物がコロニーを形成しており、生物的および非生物的ストレス要因から植物を保護し、最終的に植物の成長と発達を促進します 1,2,3,4。植物の葉には、相互作用する微生物をホストするための2つの主要なコンパートメントがあります:着生(葉の表面)と内生(アポプラスト)²。葉の表面は疎水性キューティクル層で保護されており、水分の損失を防ぎ、ワックスやクチンなどの成分が含まれています。葉の上部 (近軸) 表面には、毛状突起と呼ばれる特殊な毛のような表皮細胞が含まれていることが多く、これらは紫外線から保護し、温度を調節し、草食動物に対する抑止力として機能します。対照的に、アポプラストは光合成のためのガスと水の交換を促進し、微生物のコロニー形成を助長する湿気の多い環境を提供します⁵。これらの違いにもかかわらず、両方の葉の区画は特定の微生物を支持しており、着生微生物ネットワークは内生微生物ネットワークと比較して多様性の点でより複雑^です5。これらの微生物群集の構成が各細胞外コンパートメントでどのように調節されているかは、まだよくわかっていません。微生物群集構造は、宿主植物から分泌される細胞外RNA(exRNA)によって部分的に決定される可能性があると推測しています。

私たちの最近の研究では、アポプラストまたは細胞^溶解物のRNAとは異なる多様なRNA種が葉の表面に存在することを報告しました6。植物のexRNAに関するほとんどの研究は、マイクロRNA(miRNA)や低分子干渉RNA(siRNA)などの小さな非コードRNAに焦点を当ててきましたが、特にRNA干渉メカニズムを欠く種において、配列の相補性とは無関係に細胞プロセスを調節できる可能性のあるrRNAおよびtRNA由来フラグメントなどの他のRNA種にはあまり注目されていません^7,8。9.

ここで説明する方法は、シロイヌナズナ植物の同じセットを使用して、葉表面洗浄液(LSW)とアポプラスド洗浄液(AWF)の両方からRNAを順次単離することを可能にします。さらに、スプレーされた葉の表面を滅菌綿棒でそっとスワブすることによりRNAの収集を可能にする、葉表面綿棒(LSS)を含む非侵襲的な直交技術^{について説明します6。}微生物汚染のリスクを最小限に抑えるために、細胞外RNAを単離する前にLSW画分とAWF画分の両方をろ過します。exRNAサンプルの量とサイズの分布を評価するために、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動と、自由にアクセスできるソフトウェアImageJを使用した画像解析を組み合わせたプロトコルについて説明します。このプロトコルは、少量のexRNAを単離および分析するための効率的で費用対効果の高いアプローチを提供します。これらの RNA 調製物は、シーケンスと分子分析を通じてさらに特徴付けることができ、植物と微生物の相互作用における細胞外 RNA の動的役割についての洞察を提供します。

以下に説明するプロトコルは、植物細胞外小胞¹⁰からRNAを単離するための前述のプロトコルとは異なります。現在のプロトコルでは、超遠心分離ステップを必要とせず、細胞外小胞だけでなく、全細胞外洗浄液からRNAを単離できます。最も重要なことは、葉の表面からRNAを単離するための2つの直交方法を提供することです。私たちの知る限り、葉の表面からのRNAの単離は、最近の出版物⁶の前に説明されていません。

プロトコル

1. 緩衝液の調製と滅菌

1. 20 mM 2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)、pH 6.0、2 mM CaCl₂、および0.01 M NaClを含む小胞分離バッファー(VIB)を1 Lの蒸留水中に調製します。
   注:葉アポプラストのイオン濃度を模倣するために、VIB中のNaCl濃度を0.1 Mから0.01 Mにわずかに調整しました。
2. VIBを121°Cで20分間オートクレーブし、液体サイクルします。または、0.45 μmの真空フィルターを使用してVIBをフィルター滅菌します。
   注:このステップは、微生物汚染が植物の誘発につながり、結果のばらつきにつながる可能性があるため、バッファーが無菌であることを確認するためのものです。このバッファーは、短期保存の場合は室温(滅菌後に蓋を開けずに)で保存でき、長期保存の場合は4°Cで保存できます。

2. 植物の材料と生育条件

1. シ ロイヌナズナ Col-0野生型(WT)種子を、標準的な鉢植えミックスを含む4インチの丸いプラスチック鉢に播種します。播種後、種子を生物学的殺菌剤(600 mg / L)に浸し、透明なプラスチックドームで覆い、暗所で4°Cで3日間保持して、同期発芽を誘導します。
2. 種子の入ったポットを、植物レベルで150 μmol・m⁻²・s⁻¹ の光合成光子束密度(3,500および5,000 Kスペクトルの50:50混合、32ワット蛍光灯)。
3. 約10日後、個々の苗木をポッティングミックスを含む36セルトレイインサートに移し、透明なプラスチックドームで1〜2週間覆います。
   注:典型的な実験では、遺伝子型/処理ごとに~12〜24の健康な植物が必要です。生後6〜7週間の植物は、細胞汚染のリスクが最も少なく、最適な量のLSWおよびAWF RNAを生成することが注目されています。
4. 使用する鉢植えミックスに応じて、干ばつや洪水ストレスを避けるために、10〜15日ごとに植物に水をやります。

3. 葉表面RNAの収集

1. 遠心分離ベースの方法(葉表面洗浄;LSW)
   1. 複製ごとに、6〜7週間齢のシロイヌナズナ植物を使用します。
   2. LSWの単離を開始する前に、Silwet-L77(以下、湿潤剤と呼びます)を最終濃度0.001%(100 mLのVIBに1 μL)の滅菌VIBに加えます。
      注:Silwet-L77は湿潤剤であり、表面張力を低下させ、緩衝液が葉の表面をコーティングできるようにします。
   3. 100 mLのVIBを500 mLのスプレーボトルに移します。
   4. シロイヌナズナのロゼットは、細かいはさみを使って根から慎重に切り離します。
   5. 柔らかいブラシを使用して葉柄から余分な土を取り除きます。
   6. ロゼットを平らなトレイに置き、遠軸面を上に向けて置きます。
   7. スプレーボトルの5つのポンプを使用して、VIB +湿潤剤を遠軸面にスプレーします。
   8. ロゼットを慎重に裏返し、近軸面にVIB +湿潤剤を5回スプレーします。
   9. LSWを回収するには、スプレーされたロゼットを、250 mL遠心分離機ボトル内に置かれた底部に穴のある無針60 mLシリンジ(シリンジごとに最大2つの6週間齢のロゼットが収まります)に慎重に配置します。シリンジをパラフィルムで首に巻き付け、シリンジの先端をボトルの底の上に吊り下げます(参考のために 図1 を参照)。
      注:穴のある60 mLシリンジの調製の詳細については、以前に公開されたプロトコル¹¹を参照してください。
   10. ロードされたボトルを100 g で4°C(JA-14ローター)で10分間遠心分離します。
   11. LSWを0.22μmのシリンジフィルターでろ過し、氷上に置かれた50mL遠心分離チューブに濾液を回収します。
       注:通常、12本の植物は、このプロトコルを使用して最後に約30 mLのLSWを生成します。ただし、これは各ステップで実行されるスプレー数に基づく推定値にすぎません。この量は、通常、噴霧されたバッファーの一部が取り扱い中に失われるため、噴霧量よりも少なくなります。
2. 葉表面綿棒(LSS)法
   1. 前のセクションで説明したように、剥がしたロゼットにVIB +湿潤剤をスプレーします(手順3.1.1-3.1.7)。
   2. LSSを回収するには、滅菌された綿の先端スティックを使用して近軸および遠軸表面を綿棒で拭き、浸した先端を15 mL遠心分離チューブの内壁に押し付けて液体を絞り出します。
      注:近軸および遠軸LSSサンプルは、実験セットアップと期待される結果に基づいて別々のチューブに収集できます。
   3. LSSサンプルを0.22 μmシリンジフィルターを通して、氷上に置かれた15 mL遠心分離チューブにろ過します。
      注:綿棒で採取した植物の数に応じて、実験ごとにさまざまな量のLSSを収集できます。

図1:葉の表面洗浄およびアポプラスト洗浄液の分離に使用されるツール。 (A)LSWとAWFを収集するために、2つの シロイヌナズナ ロゼット全体を60 mLシリンジに入れ、8つの追加の穴を加熱された鉗子でシリンジの端に溶かして、洗浄液が流れるチャネルを作成します。(B)次に、この無針注射器は、図のように首の領域でパラフィルムで包まれます。(C)このステップにより、シリンジをボトルの底に触れることなく250 mLの遠心分離機ボトルに収めることができます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

4. アポプラス性洗浄液(AWF)の回収

1. LSWまたはLSSの分離に使用したのと同じ植物セットをビーカーに入れ、蒸留水で2回優しくすすいでください。
2. 次のように、VIBでロゼットを20秒間真空浸透させます。
   注:真空浸透のプロセスは、以前に公開されたプロトコル¹¹で十分に説明されているが、現在のプロトコルを明確にするためにここに再現されている。
   1. ロゼットを300〜500mLのVIBを入れたフレンチプレスコーヒーメーカーに慎重に置きます。フレンチプレスに蓋を置き、植物が完全に水没するまでプランジャーをゆっくりと下げます。
   2. 植物と緩衝液の入ったフレンチプレスを真空チャンバーに入れます。真空ポンプを使用して20秒間真空をかけます。バッファーはちょうど沸騰し始めるはずです。
   3. 真空を解放し、フレンチプレスを真空チャンバーから取り出し、蓋を外して、VIBを別の500 mLプラスチックビーカーに注ぎます。フレンチプレスからロゼットを取り除きます。
      注:VIBは、1つの遺伝子型に対して同じ日に複数回再利用できますが、真空浸潤に使用すると、VIBを別の日に使用するために保管しないでください。
   4. ペーパータオルで葉を軽く振ってからブラッシングして、植物から余分なVIBを取り除きます。
3. あぶらとり紙で優しく吸い取り、葉の表面から余分な緩衝液を取り除きます。
4. アポプラスト洗浄液(AWF)を回収するには、LSW収集用に説明されているように、250 mL遠心分離機ボトル内に置かれた60 mLの無針注射器内にロゼットを置き、600 × g で4°Cで30分間、ゆっくりと加速しながら遠心分離します。
5. プールされたAWFを0.22 μmのシリンジフィルターでろ過し、氷の上に置かれた15 mLの遠心分離管に濾液を回収します。
   注:通常、12本の植物は、このプロトコルを使用して最後に約6 mLのAWFを生成します。ろ過されたLSW、AWF、およびLSSは、すぐに使用することも、さらに使用するまで-80°Cで保管することもできます。
6. AWF単離後の各複製に使用された植物の新鮮重量(FW)を記録します。次に、この測定値を使用して、各サンプル中のRNAの量を正規化します(図2)。

図2:プロトコルと葉表面綿棒法の概略図。 (A)シロイヌナズナロゼットを使用した葉表面洗浄液およびアポプラスド洗浄液の単離のための段階的プロトコルの概略図。(B)葉表面RNAを単離するための葉表面スワブ(LSS)法の概略図。図は、Borniego et al., 2025 の図 S1 および図 S4 から採用されました⁶. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

5. RNAの沈殿

1. 必要な量のAWF、LSW、またはLSSを0.1容量の3M酢酸ナトリウム(pH 5.2)および1.0容量の低温イソプロパノールを15 mL遠心分離チューブで混合してRNAを沈殿させます。
2. グリコーゲン(20 mg/mLストック)を最終濃度20 μg/mLまで添加します。
   注:RNAを沈殿させるために使用される遠心分離管を13,000 × gの高速で遠心分離できることを確認してください。このステップでチューブが破損すると、RNAサンプルが失われる可能性があります。
3. 混合物を-20°Cで最低1時間または一晩インキュベートします。
4. チューブを13,000 × g で4°C(JA-25.50ローター)で30分間遠心分離します。
5. ペレットを氷冷の70%EtOHで2回洗浄し、10分以内に自然乾燥させます。
6. ペレットを100 μLの超純度DNase/RNaseフリー水またはVIBに再懸濁し、RNAを1.5 mL遠心分離管に移します。
   注:このステップの後、沈殿したRNAは-80°Cで最大2週間保存できます。

6. TRIzolベースのRNA単離

1. 各チューブに1 mLのTRIzol試薬を加え、ローテーターで振とうして混合します。
   注意: TRIzolを取り扱う場合は、ドラフト内で使用し、手袋と保護眼鏡を着用してください。
2. チューブを卓上回転子の上に置き、室温(RT)で10分間置きます。
3. 各チューブに200 μLのクロロホルムを加え、続いて短く、しかし激しいボルテックスステップを行います。
   注意: クロロホルムを取り扱う場合は、ヒュームフードで使用し、手袋を着用し、保護眼鏡を着用してください。
4. チューブをRTで約3分間放置し、13,000 × g で4°Cで15分間遠心分離します。
5. 水相を標識された1.5 mL遠心分離管に移し、10 μgのRNaseフリーグリコーゲンと1容量の冷イソプロパノールを加えます。
   注意: 発生したバイオハザード廃棄物(フェノール廃棄物など)については、機関のガイドラインに従って、指定された廃棄物容器に有機溶剤を収集してください。
6. チューブを-20°Cで1時間以内にインキュベートします。
   注:このステップでRNAを1時間以上沈殿させると、RNA単離の効率が低下し、RNAの濃度が非常に低くなります。
7. RNAをペレット化するには、チューブを13,000 × g で4°Cで20分間遠心分離します。
8. RNAペレットを氷冷の70%EtOHを使用して2回洗浄し、自然乾燥させてから、10〜20 μLの超純度DNase/RNaseフリー水に再懸濁します。
9. 再懸濁したRNAを-20°Cまたは-80°Cで保存し、それぞれ短期または長期保存します。

7. フェノールまたはグアニジン汚染の除去

1. RNAサンプルからフェノールまたはグアニジンの汚染を除去するには、96%EtOHと酢酸アンモニウムで1回または2回の連続沈殿を行います。
2. 10 μLのRNAサンプルに1 μgのグリコーゲンを加え、0.5 容量の7.5 M酢酸アンモニウムと混合してから、2.5 容量の96-100%EtOHを添加します。
   注:このステップでは、EtOHの最終濃度は全体積で70〜75%である必要があります。
3. 混合物を-80°Cで30分間インキュベートし、13,000 × g で4°Cで20分間遠心分離します。
4. RNAペレットを70%EtOHで2回洗浄し、10 μLの超純度DNase/RNaseフリー水に再懸濁します。

8. 定量と比較のためのRNAゲル電気泳動

1. 40%アクリルアミド/ビス溶液、37.5:1を使用して、10%または15%ポリアクリルアミドと7M尿素を1xトリスホウ酸EDTA(TBE、pH 8.4)に含むミニゲル(7.2 cm x 8.6 cm x 0.75 mm)を調製します。あるいは、市販の変性ミニゲル(15%TBE-尿素ゲル)を使用してRNAサンプルを実行することもできます。
2. RNAサンプル(1:1)を2x変性ローディングバッファー(95%ホルムアミド、10 mM EDTA、0.02%SDS、0.02%ブロモフェノールブルー、および0.01%キシレンシアノール)と混合し、65°Cで5分間変性し、すぐに氷の上に置きます。
3. RNAサンプルを0.5x TBEランニングバッファーで220 VのRTで約1時間15分間分離します。
4. サイズ標準品には、低範囲ssRNAと14-30 ntのssRNAラダーマーカーを1:1で混合します。
5. ゲルを0.5x TBEの1x SYBR金核酸ゲル染色で10分間染色し、蒸留水で2回洗浄し、イメージングシステムを使用して画像化します(図3)。
6. 各レーンで分離されたRNAを定量するには、ImageJドキュメントの小見出し「ゲル分析」で概説されているゲル分析法を使用します https://imagej.net/ij/docs/menus/analyze.html
7. CLサンプルとexRNAサンプルのバンディングパターンを比較するために毎回100 ng/μLのCL RNAをロードするため、CL RNAに対するexRNAサンプルの濃度を推定します(図4)。

図3:植物の葉を多様なRNAでコーティングしています。 葉細胞ライセート(CL)から100 ngのRNAと、AWFおよびLSWから単離した2 μLのRNAを15%変性ポリアクリルアミドゲル上で分離し、SYBR Gold核酸染色で染色して、RNAバンディングパターンを視覚化して比較しました。RNAサイズ標準は、左端のレーンに示されています。ImageJゲル分析を使用して得られたデンシトメトリー測定値は、各レーンの下部に示され、全葉細胞ライセートレーン中のRNAに対するRNAの量を示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:LSW RNAの繰り返し抽出。 LSWは、最初にSilwet L-77を含まないVIBまたはさまざまな濃度のSilwet L-77(0.001%または0.01%)を使用して単離されました。同じシロイヌナズナ植物のセットを使用してLSWを繰り返し単離すると、VIB + Silwet L-77(0.001%)を使用してLSW RNAを濃縮できます。L1、L2、およびL3は、同じ植物セットに散布した後、3回連続した遠心分離を通じて収集されたLSWを使用して単離されたRNAサンプルを示します。湿潤剤の濃度を0.001%から0.01%に上げても、LSW RNAの単離は強化されませんでした。ImageJゲル分析を使用して得られたデンシトメトリー測定値は、各レーンの下部に表示されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

9. マイクロタイタープレートベースの方法を使用してRNAを定量するための代替方法

1. 超純RNase/DNaseフリー水中のCL RNAを使用して標準RNA溶液を調製します。サンプルの予想濃度に基づいて、標準の適切な濃度範囲を決定します。次のRNA濃度を使用します:0、6.75、12.5、25、50、100、200 ng/μL、2回の技術的複製を可能にするのに十分な量の各標準試料を調製します。
2. 1.5x SYBR Gold 核酸ゲル染色を 500 mM Tris HCl pH = 8 で調製します。
   注:SYBRゴールドはpHに依存し、pH = 7.0〜8.0の間で最適な染色感度を持っています。
3. マイクロプレートのセットアップ:
   1. 各ウェルに99 μLのdH₂Oを加えます。
   2. 各ウェルに1 μLのRNAを加えます。RNAサンプルとRNA標準試料の両方に1 μLを使用します。
   3. 各ウェルに50 μLの1.5x SYBR金を加えます。
4. マイクロプレートリーダーのパラメータを次のように設定します。
   シェイク - 線形または軌道: 0:03 (MM:SS)
   読み取り - 励起波長が496 nm、発光波長が540 nmに設定された蛍光エンドポイント。
5. 標準の値を使用してキャリブレーションラインを作成します。キャリブレーションラインの式を使用して、サンプル中のRNA濃度を計算します。
   注:代替色素を使用して、TRIzol単離サンプル中のRNAを定量できます。Ribo488 RNA定量試薬でも同様の結果が得られました。この染料の詳細なマニュアルは会社から提供されています。簡単に言えば、200 mM Tris pH = 8を使用して色素を1000倍(1〜1000)希釈します。次に、測定を行うには、99 μLのオートクレーブ滅菌dH₂Oを各ウェルに+ 1 μLのRNA(サンプルまたは標準)+ 100 μLのRibo488希釈液を加え、5分間インキュベートし、480 nmの励起と520 nmの発光を使用してプレートリーダーを使用して蛍光を定量します。2つのRNA色素を使用して得られた標準曲線を 図5に示します。

図5:マイクロタイタープレートベースのRNA定量法を使用して得られた標準曲線。 SYBR Gold(左)とRibo488(右)の2つの異なるRNA色素は、サンプルごとに2回の技術的反復で一貫した結果をもたらします。どちらの方法もRNA定量を行うために使用できます。ただし、RNAを定量する必要があるたびに標準曲線を取得する必要があります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

結果

シロイヌナズナ植物から葉表面洗浄(LSW)およびアポプラスト洗浄画分(AWF)を単離するための上記の段階的プロトコルの概略図を 図2Aに示します。この方法では、1回の繰り返しごとにわずか3〜6本の植物からLSWとAWFの両方を抽出することができ、両方の画分から一貫して同量のRNAが得られます。細胞溶解物中のRNA濃度を測定するために、NanoDrop分光光度法を利用しています。ただし、LSW、LSS、およびAWFに由来するRNAサンプルについては、SYBR金染色ポリアクリルアミドゲルの濃度計量定量に依存しています。この定量ステップは、細胞外画分に未知の汚染物質(多糖類の可能性が高い)を含み、吸光度ベースのRNA定量法を共精製して干渉し、RNA濃度の過大評価につながる可能性があるため、必要です。この限界を克服するために、今後の研究では非フェノールベースのRNA精製法を利用する予定です。

変性RNAゲル分析により、LSWおよびAWFには、長いRNAと小さなRNAの両方を含む、広範囲のRNA種が存在することが明らかになりました(図3)。特に、葉の表面とアポプラス画分の両方から同等のRNA量が正常に単離され、RNA量は植物の新鮮な重量(FW)ごとに正規化されました。驚くべきことに、LSWおよびAWF画分のRNAサイズプロファイルは、互いに、また全細胞溶解物(CL)RNAのプロファイルとは大きく異なっていました。これらの違いは、exRNA画分が細胞RNAで汚染されていないことを示唆しています。3つの画分の中で、アポプラスRNA(AWF)はサイズ分布において最大の多様性を示し、アポプラスRNAが葉表面RNAよりも分解されていることを示唆しています。

シロイヌナズナの葉の表面にRNAが存在することをさらに調べるために、綿棒を使用しました。この方法により、近軸(上部)および遠軸(下部)の葉の表面からRNAを別々に順次収集する^{ことができました6。}これらの分析により、両方の葉の表面に同程度の量のRNAが含まれていることが明らかになりました。さらに、遠心分離を必要とせずに葉の表面から緩衝液を吸収するだけでRNAを収集できることは、RNAが遠心分離中に気孔から抽出されるのではなく、実際に葉の表面にあるという結論をさらに裏付けています。

豊富な量の葉表面RNAを抽出できた主な調整の1つは、湿潤剤の添加でした。VIBに湿潤剤(0.001%という非常に低濃度)を添加すると、ほぼ2倍のRNAが回収されました。Silwet L-77の有無にかかわらず得られたRNAの濃度のこの違いは、湿潤剤の使用により葉表面でのRNAの溶解が改善されることを示しています。しかし、湿潤剤の濃度を0.001%から0.01%に上げても、LSW RNAの単離は強化されませんでした(図4)。特に、同じ葉からLSW RNAの単離を繰り返すと、追加のRNA(最初の洗浄から得られる回収率の約63%)が得られ、これは葉が継続的にRNAを表面に分泌し、葉の処理に必要な約30分以内にそのほぼ3分の2が置換されることを示唆しています。植物材料が限られているときに総LSW RNA収量を増やすために、同じ葉を複数回連続して洗浄することが可能です。ただし、洗浄液の緑色から評価すると、取り扱いにより葉の素材に累積的な損傷が生じる可能性があるため、3回以上の洗浄はお勧めしません。これらの実験では、RNAゲルベースのデンシトメトリー分析を使用してRNA濃度を推定しました。ただし、上記のマイクロタイタープレートベースのRNA定量法は、一度に複数のサンプルを評価する場合にRNAの正確な定量に使用できます(図5)。

ディスカッション

このプロトコルでは、健康なシロイヌナズナのロゼットから葉表面洗浄液(LSW)、葉表面綿棒(LSS)、およびアポプラスド洗浄液(AWF)を分離し、その後RNA抽出を行う方法について詳しく説明します。重要なステップには、実験を行う前の VIB の調製と滅菌、制御された条件下での植物の育成、および Silwet-L77 を使用して VIB による葉の表面の適切なコーティングを確保することが含まれます。これらの手順は、葉の新鮮な重量によって正規化されたLSWとAWFの両方から同量のRNAを生成するはずです。これらの細胞外画分からRNAを回収するには、特に沈殿ステップ後のRNAペレットに関して、慎重な取り扱いが必要です。

上記のプロトコルはシロイヌナズナの葉に最適化されていますが、わずかな変更を加えるだけで他の植物種にも使用することに成功しています。葉表面からのRNA抽出は、2つの主要な調整を実施することによって最適化できます:1つ目はLSW単離を複数回実施すること、2つ目は湿潤剤の濃度を上げることです。イネ^12,13のように、葉の表面が非常に疎水性である植物種は、より高い濃度の湿潤剤を必要とする場合があります。

さらに、綿先の綿棒を使用して葉の表面RNAを収集する非侵襲的な方法について説明しました。この葉表面RNA単離法では、採取チューブを氷バケツに入れます。葉の表面のRNAが分泌され、室温で蓄積されることを考えると、採取中でも安定していると想定されます。また、LSWとLSS RNAのバンディングパターンを比較したところ、分解面では大きな違いは見られません。

上記のプロトコルでは、TRIzol 試薬を使用して、LSW、LSS、または AWF のいずれかから RNA を精製します。この試薬は、タンパク質を除去するためにフェノールを使用しています。しかし、TRIzolベースの精製では、LSWや^AWF6に多く含まれるペクチンなどの多糖類は除去されないことがわかりました。このような共精製分子は、分光光度法または蛍光測定法を使用したRNA定量に問題を引き起こす可能性があります。したがって、私たちは RNA ゲルベースのデンシトメトリー分析に依存して exRNA 濃度を評価します。現在、多糖類からRNAをより適切に分離できるカラムベースの精製法を研究しています。ただし、シリカ膜は~200ヌクレオチドを超えるRNA分子に結合するように最適化されているため、これらの方法は低分子RNAの回収を制限することがよくあります。低分子RNAは、結合中に膜を通過したり、洗浄ステップで失われたりする可能性があります。したがって、これまでのところ、低分子RNAを含むすべてのRNAサイズのより包括的な回収のためにTRIzolベースの方法のみに依存していますが、慎重な取り扱いと相分離が必要です。

さらに、RNAゲル解析を実施する場合、主に大量のrRNAおよびtRNAと比較して存在量が低いため、AWFおよびLSW RNAと比較して、全細胞RNAサンプルで80 nt未満のフラグメントは見られません。AWFおよびLSWに小さなバンドが存在するのは、植物の細胞外コンパートメントでのRNAの分泌後に自然に発生する豊富なrRNAおよびtRNAの分解によるものであり、シーケンシングおよびノーザンブロ^{ット分析によって}確認されたように、植物の収集および取り扱い中に導入されたアーティファクトではありません6。

当社の葉表面洗浄分離法は、幅広い研究用途に大きな可能性を秘めた多用途ツールです。これにより、植物と微生物の間の相互作用を理解する上で中心となる可能性のある RNA、タンパク質、その他の代謝産物などの生体分子を葉の表面から分離できるはずです。AWFおよびLSWに存在する微生物の同定が必要な場合は、0.22 μmフィルターによるろ過を排除することで実現できます。

植物は、細菌、真菌、ウイルスなどの幅広い微生物と相互作用し、その表面に複雑な群集を形成します¹。これらの微生物群集は、植物の成長、耐病性、栄養素の獲得に大きな影響を与える可能性があります^2,3,4。この方法を使用して葉表面洗浄液を単離および分析することにより、研究者は微生物代謝産物である exRNA を単離し、葉の表面に存在する微生物群集を特定し、これらの群集が分子レベルでどのように制御されているかを調査できます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
14-30 nt ssRNAラダーマーカー	タカラ	3416
1.5 mLマイクロ遠心チューブ	VWRの	20170-038
10 mL無針シリンジ	BDの	303347
15 mL ファルコンチューブ	VWRの	89039-668
15% ミニプロテアン TBE-尿素ゲル、10 ウェル/12 ウェル、30 &L / 20 & マイクロ;L	バイオラッド	4566053 / 4566055
36セルトレイインサート	トゥルーリーフマーケット
40%アクリルアミドおよびビスアクリルアミド溶液、37.5:1	バイオラッド	1610148
4インチの丸い鍋	トゥルーリーフマーケット
50 mL ファルコンチューブ	VWRの	89039-656
50 mL無針シリンジ	BDの	309653
96ウェルプレート黒底	グレニエ	655090
アクロディスク 0.22 &Mシリンジフィルター	バケツ	4192
アクロディスク 0.45 &Mシリンジフィルター	バケツ	4454
過硫酸アンモニウム(APS)	シグマ・アルドリッチ	A3678
塩化カルシウム	シグマ・アルドリッチ	C1016
クロロホルム(RNaseフリー)	マクロンファインケミカルズ	MK444110
透明なプラスチックドーム	ハマート・インターナショナル	11 3348	プラスチック製のドームを使用して、植物を覆い、湿度を維持できます
綿先スティック医療グレード	ユーリン	S-21102
エタノール(Rnaseフリー)	デコンラボラトリーズ株式会社	2716GEAの
フレンチプレスコーヒーメーカー、24液量オンス	スノーピーク	CS-111
穴のない栽培トレイ 10 x 20	トゥルーリーフマーケット
アイスバケツ	Schuett-Biotech、Spongex	3-680 052
イソプロパノール	サーモサイエンティフィック	149320050
JA-14 固定角ローター	ベックマン・コールター;モデル:JA-14	339247
キムワイプ	KCWW、キンバリークラーク	34120
ローレンジssRNAラダー	NEB	N0364S
MESハイドレート	シグマ・アルドリッチ	M8250
マイクロプレートリーダー	バイオテック	シナジーH1
ミラクルグロ	ミラクルグロ	24-8-16	万能植物性食品です。植物の育てに使用される土壌源に応じて、用途を調整できます。
ナルジーンセンチフジボトル 250 mL (キャップなし)	ナルジーン	3120
ペーパータオル
パラフィルム Mラボフィルム	パラフィルム	S-25929
プラスチックビーカー(500mL)	ユーリン	S-21658
RNaseフリーグリコーゲン(20 mg/mL)	サーモサイエンティフィック	R0561
RootShield Plus WP 生物学的殺菌剤	バイオワークス	68539-9
鋏
シルウェット L-77	フィトテックラボ	S7777	どのブランドのSilwet L-77も使用できます。ただし、シルウェットは一定期間にわたってその有効性を失います。年に一度交換するのが理想的です。
塩化ナトリウム	シグマ・アルドリッチ	S7653
ソフトナイロンヘアペイントブラシ	私達。アート用品	第6位
スプレーボトル	ユーリン	S-7272	どのスプレーボトルでも使用できますが、スプレー設定はシャワーにする必要があります。
Sungro プロフェッショナル グローイング ミックス	ソンロ
Sungro Propagation Mix	ソンロ
SYBR ゴールド核酸ゲル染色剤 (DMSO 中 10,000 倍濃縮液)	サーモサイエンティフィック	S11494
テメド	サーモサイエンティフィック	17919
TRIzol試薬	インビトロゲン	15596026
超純度Dnase/Rnaseフリー水	インビトロゲン	10977015
尿素	シグマ・アルドリッチ	U5378
真空チャンバー、0.20立方フィート	SP Scienceware - ベルアート製品 - H-B Instrument	F42031-0000
真空ポンプ、3.5 CFM	理想的な真空製品	P101532
体重計	エスカリ	WBB480535	これは単なる例です。どんな体重計でも使用できます。