方法論記事

生体外 心臓および神経組織におけるライアノジン受容体2集合体の1分子解析

DOI：

10.3791/68408

⸱

2025年7月15日

 , 
1Department of Chemistry, University of Kentucky

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究では、天然の受容体組織を保持する小胞ベースの単一分子イメージング法を示し、正確な化学量論の定量化と、受容体の組み立て、機能、および疾患の研究における広範なアプリケーションを可能にします。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

受容体の集合を理解することは、生理学的プロセスにおけるその機能と制御の根底にあるメカニズムを解明するために重要です。従来の in vitro 1分子研究では、異種発現系からタンパク質を単離することに頼っていますが、細胞表面タンパク質の組織化と組み立てに関与する in vivo の生理学的複雑さを捉えることができないことがよくあります。このプロトコルでは、全反射蛍光顕微鏡(TIRFM)を使用して、ナノスケールの小胞内にカプセル化されたGFPタグ付きリアノジン受容体2(RyR2)分子を研究します。動物から迅速に抽出された臓器から生成されるこれらの小胞は、抽出時の受容体の集合状態のスナップショットを効果的に提供し、動物の生理環境の変化に応じたサブユニットの化学量論と受容体組織の詳細な分析を可能にします。このアプローチでは、TIRFMと段階的な光退色分析を利用して、受容体化学量論の読み出しを提供します。単一分子レベルでのイメージング受容体は、生きた動物に集合した受容体集団内の不均一性の検出を容易にし、疾患状態に関連する集合変化のモニタリングを可能にします。その結果、この方法は、受容体集合体の分布とそれらの生理学的環境の変化との相関関係を決定するための強力なツールを提供します。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

膜受容体は、人体全体の生理学的プロセスにおいて重要な役割を果たしています1。主な機能は、細胞内シグナル伝達イベントを開始するための細胞外刺激の伝達を通じて細胞間のコミュニケーションを仲介することです。シグナル伝達における基本的な役割のため、既存の治療薬の約70%が膜受容体を標的としています2。それらはしばしば、複数の化学量論3,4を持つヘテロメア形態に組み立てられた複数のサブユニットで構成されるオリゴマー構造です。受容体がどのように機能的な複合体に組織化されるかを理解することは、健康と疾患における受容体の役割を解明するために重要です5,6。免疫沈降法やウェスタンブロッティングなどの従来の生化学的手法では、アンサンブル測定を平均化することで、受容体亜集団の不均一性が不明瞭になります7。対照的に、単一分子技術では、個々の受容体を直接観察することができ、受容体集団内の不均一性の定量化が可能になる8,9,10。単一分子技術は、膜受容体の集合、化学量論、およびオリゴマー化を定量化するための標準となっています11,12。このアプローチは、単離されたタンパク質または細胞培養条件を使用して、多くの生理学的に関連する膜受容体に広く適用されています。単一分子研究は、主にin vitro発現系に依存しており、細胞環境からタンパク質を単離することができます。しかし、生体内の複雑さは、これらのタイプの異種発現システムに完全には反映されていません。

これらの制限を克服するために、私たちは、心臓および神経組織に直接由来するナノベシクル内で膜受容体を捕捉することにより、生理学的に適切な状態で膜受容体を分離および画像化するアプローチを開発しました。この方法は、小胞形成時の受容体の集合状態を効果的に保持し、さまざまな生理学的環境における受容体の応答の重要な指標である受容体サブユニットの化学量論を直接可視化することを可能にします。このアプローチにより、生きた動物内の複雑な生物学的環境で発生する膜受容体の化学量論的集合体を、異種発現や再構成を必要とせずに調べることができます。全反射蛍光顕微鏡(TIRFM)を用いることで、小胞に内包された受容体の1分子分解能イメージングを実現し、光退色微量を抽出してサブユニットの組成を決定します。

TIRFMは、ガラス表面から~150 nm以内の蛍光色素を選択的に励起し、溶液中の分子からのバックグラウンド蛍光を低減するため、単一分子膜タンパク質イメージングに適しています3,10。この閉じ込めにより、S/N比が大幅に向上し、個々の膜受容体複合体の正確な検出が可能になります。蛍光タグ付き受容体の段階的な光退色を解析することにより、サブユニットの化学量論を直接決定し、受容体集団内の潜在的な不均一性を評価することができる12。これは、大きな細胞内Ca²⁺放出チャネルであるライアノジン受容体2(RyR2)に特に関連しており、ホモ四量体としてのみ集合する心臓の興奮収縮結合や、その集合が確立されていない脳のシナプス機能に重要な役割を果たします1,13,14.神経組織に複数のRyRアイソフォームが存在することを考えると、RyR2が脳内で純粋にホモマー四量体複合体を形成し、心臓と同様に4つの同一のサブユニットからなるのか、それともRyR1またはRyR3とのヘテロメア集合がin vivoで起こるのかは不明のままです15,16,17,18。

この方法は、心臓と脳の特定の領域から小胞を分離することにより、RyR2組織における潜在的な組織特異的な違いの調査を可能にします。私たちは、RyR2がホモテトラマーしか形成できない心臓組織の特性を利用して、ex vivoの単一分子サブユニット化学量論に統計的に堅牢な基礎を提供し、既知のテトラマー集合体は、他の臓器の未知の集合体を調べるための制御として機能します。生理学的相互作用を維持しながら、受容体を本来の状態で画像化する能力は、さまざまな臓器やさまざまな生理学的条件下での受容体の組み立てを研究するための堅牢なフレームワークを提供します。このプロトコルは、GFPタグ付きRyR2の小胞単離、固定化、および単一分子イメージングのワークフローを記述し、受容体化学量論の正確な特性評価を可能にします。この技術は、心臓および神経組織におけるRyR2組織の理解を前進させるだけでなく、さまざまな生理学的および病理学的状況における受容体の組み立ておよび調節を研究するためのより広範なアプリケーションを提供します19,20,21。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. サンプル調製

  1. 経心灌流と臓器摘出
    1. 呼吸が止まるまでCO₂を使用してマウスに麻酔をかけます。
    2. マウスを仰臥位に置き、手足を固定します。
    3. 腹部に沿って正中線を切開し、胸郭に向かって横方向に伸びて胸腔を露出させます。
    4. 左心室に針を慎重に挿入し、右心房を横断して灌流液を排出します。
    5. 小胞の準備には、循環器系から血液がなくなるまで、冷たい1x PBSで灌流します。
    6. 凍結切片の場合、PBS灌流後、4%パラホルムアルデヒド(PFA)による灌流を続けて組織を固定します。
    7. ハートを丁寧に取り出し、すぐに氷の上に置きます。
    8. 細いハサミを使って、頭皮の正中線に沿って慎重に切り、皮膚をはがして頭蓋骨を露出させます。
    9. 大孔近くの頭蓋骨の基部を切開します。
    10. 細い鉗子を使用して、縦方向の裂傷に沿って頭蓋骨を慎重にこじ開け、骨片を取り除いて脳を露出させます。
    11. 湾曲した鉗子を使用して脳をそっと持ち上げ、脳神経を切断して完全に無傷で抽出します。
    12. 凍結切片に使用する場合は、脳を4%PFAに4°Cで24時間後固定します。
    13. 小胞の準備に使用する場合は、すぐに脳を固定せずに氷の上に置いて、さらなる処理を行います。
  2. クライオセクショニング
    1. 4% PFAから脳または心臓を取り出し、ブロットして乾かします。
    2. クライオモールド内のOCTコンパウンドに臓器全体を埋め込みます。
    3. 完全に固まるまで型を-80°Cの冷凍庫に入れて、埋め込まれた組織を凍結します。
    4. 切片を作る前に、クライオスタットチャンバーと試料ヘッドを-20°Cに平衡化します。
    5. 凍結したOCTブロックを-80°Cのフリーザーからクライオスタットチャンバーに移し、10分間平衡化させます。
    6. 試料チャックを70%エタノールで洗浄し、乾燥させ、接着剤としてOCTを薄く塗布します。
    7. 凍結したOCTブロックをチャックに固定し、正しい向きを確保します。
    8. チャックをクライオスタット試料ホルダーに挿入し、ブレードの位置を調整します。
    9. 組織表面が露出するまで余分なOCTを切り取ります。
    10. 組織を10μmの厚さで切片化し、切片をスライドガラスに集めます。
    11. 切片を室温で1時間風乾した後、封入剤を切片に塗布し、カバースリップを敷いてサンプルを密封します。
    12. イメージングのためにスライドを4°Cで保存する前に、封入剤をセットしてください。
  3. 小胞の準備
    1. 心臓小胞の準備
      1. 経心灌流後の心臓を1x PBSで抽出し、氷の上に置きます。
      2. 滅菌メスを使用して、心臓の底から約30mgの心室筋を解剖します。
      3. 小胞の完全性を維持するために、4-5 mLの10 mM NaHCO₃と5 mM NaN₃を含む遠心分離チューブに組織を移します。
      4. ホモジナイザーを使用して、完全に溶解するまで組織をホモジナイズします。
      5. ホモジネートを10,000 × g で20分間遠心分離し、大きな破片を取り除き、上清を回収します。
      6. 37,000 × g で65分間超遠心分離を行い、上清を廃棄し、ペレットを0.6 M KClの20 mMトリスマレイン酸緩衝液(pH 6.8)の3-4 mLに再懸濁します。
      7. 37,000 × g で超遠心分離をさらに65分間繰り返し、可溶化アクトミオシンを除去します。
      8. 最終ペレットを 50 mM KCl を加えた 20 mM トリスマレイン酸緩衝液 (pH 6.8) 0.5 mL に再懸濁して心胞溶液を採取し、-80 °C で保存します。
    2. 脳小胞の準備
      1. 経心灌流後の脳を1x PBSで抽出し、氷の上に置きます。
      2. 1 mmマウス脳冠状マトリックスを使用して、脳を1 mmの切片にスライスします。
      3. 嗅球から3番目と4番目のセクションを特定し、慎重に分析します:1)両方の半球から最も外側の皮質層。2)セクションの中央領域に位置する海馬。
      4. 後端から、小脳の基部に横方向の切り込みを入れて小脳を分離します。
      5. 5匹のマウスから同じ脳領域をプールして、適切な小胞収量を確保します。
      6. 2 mLの冷ホモジナイザー(0.32 Mスクロース、10 mM HEPES、2 mM EDTA、プロテアーゼ阻害剤、pH 7.4)にDounceホモジナイザーを使用して、組織を直ちにホモジナイズします。
      7. 追加のホモジナイズバッファー3 mLを加え、200 × g で15分間遠心分離して、大きな組織片を除去します。
      8. 上清を回収し、1,000 × g で4°Cで15分間遠心分離し、核分画を除去します。
      9. さらに、上清を10,000 × g で4°Cで20分間遠心分離し、ミトコンドリアを除去します。
      10. 得られた上清を100,000 × g で4°Cで2時間超遠心分離し、小胞をペレット化します。
      11. 最終小胞ペレットを1x PBSに再懸濁して脳小胞溶液を取得し、-80°Cで保存します。
  4. ナノ粒子追跡分析(NTA)によるナノベシクルの特性評価
    1. 製造元の指示に従って検出セルを組み立てます。
    2. 機器の電源を入れ、互換性のあるソフトウェアを起動します。
    3. 1 mLシリンジに脱イオン(DI)水を入れ、バックグラウンドから汚染物質がなくなるまでシステムチューブを手動で洗い流します。
    4. ナノベシクルサンプルを1x PBSで希釈して調製します。
    5. 希釈したナノベシクルサンプルを~1 mLを清潔な1 mLシリンジに入れ、気泡が発生しないようにします。
    6. サンプルを検出セルに手動で注入し、小胞がはっきりと見えるまで焦点を調整します。
    7. シリンジをシリンジポンプに固定し、ハードウェアパネルで 流量 を 200μL / s に設定します。
    8. SOPパネルで、測定時間を60秒、サイクル数を5に設定し、温度制御が有効で25°Cに設定されていることを確認します。Save SOP をクリックし、ファイルに適切な名前を付けて、設定を新しいSOPとして保存します(例:"nanovesicle_standard.sop")。
    9. [キャプチャ] パネルで、 カメラ レベル 13 と 初期検出しきい値 3 を選択して、機器の設定を構成します。
    10. Run をクリックして、以前に保存したSOPを選択します。ソフトウェアは、設定に従って自動的に測定を実行します。
    11. 完了したら、[ 分析] をクリックして各ビデオを処理します。検出しきい値を調整して、すべての粒子がはっきりと見えるようにし、バッチ分析が完了したら [終了 ]をクリックします。結果をエクスポートするには、[ データのエクスポート] |All Measurements、および後で使用するためにCSVファイルとして保存します。
    12. 実験終了後、残留小胞がなくなるまで、システムを ~2 mL の脱イオン水で洗い流します。
    13. チューブから空気を注入して残っている液体を取り除き、次回の使用に備えてシステムが乾燥していることを確認します。

2. イメージング

  1. 組織凍結切片の共焦点イメージング
    1. レーザー走査型共焦点顕微鏡の電源を入れ、リンクされたソフトウェアを開きます。
    2. 適切な対物レンズ(20倍エアまたは60倍オイル)を選択し、準備したクライオ切片スライドを顕微鏡ステージにロードします。
    3. 488 nmレーザーラインと535/70 nm発光フィルターを使用して、GFP励起のレーザー設定を構成します。
    4. ピンホールサイズ(28.9μm)、レーザー強度(17%)、検出器ゲイン(15.3)などのイメージングパラメータを最適化し、光退色を最小限に抑えながらS/N比を向上させます。
    5. 必要に応じて、上部と下部の焦点面を設定し、適切な ステップサイズ(0.275 μm)を定義してZスタックを取得します。
    6. 大面積の画像を取得するときに、15%の画像オーバーラップで自動画像スティッチングを有効にします。
    7. 画像の解像度を調整し、必要に応じてフレーム平均を適用してバックグラウンドノイズを低減します。
    8. 画像をキャプチャし、さらに分析するために「.nd2」形式で保存します。
  2. 全反射蛍光(TIRF)イメージング
    1. 膜用生体適合性アンカー(BAM)法による小胞固定化22
      1. 35 mmガラス底ディッシュを5 M NaOHで45°Cで1時間超音波処理し、続いて3回のDI水リンスで十分に洗浄します。
      2. ディッシュを0.1 M HClでさらに1時間、45°Cで超音波処理した後、さらに3回の脱イオン水すすぎを行います。
      3. 洗浄したガラス表面をエタノール中の2%3-アミノプロピルトリエトキシシラン(APTES)で室温で30分間処理し、アミン官能基を導入します。
      4. ディウム水とエタノールで皿を3回すすぎ、余分なAPTESを取り除き、乾燥させます。
      5. 100 μM Oleyl-O(CH₂CH₂)nCO-CH₂CH₂-COO-NHS(Sunbright OE-020CS)と1x PBSで10分間インキュベートします。
      6. PBSで皿を洗い、未反応の試薬を取り除きます。
      7. 所望の濃度で小胞を導入し、15分間インキュベートして小胞が結合できるようにします。
      8. PBSで皿をやさしくすすいで、固定された小胞が付着したままになっていることを確認しながら、結合していない小胞を取り除きます。
    2. TIRFイメージングのセットアップと取得
      1. 倒立蛍光顕微鏡488nmレーザー光源とEMCCDカメラの電源を入れます。
      2. MetamorphおよびCellSensソフトウェアを起動して、イメージング制御を初期化します。
      3. 60倍油浸対物レンズ(1.49 NA APO)をメタノールで洗浄し、ほこりや残留油分を取り除きます。
      4. 対物レンズに屈折率(RI)マッチング液浸油を少量滴下します。
      5. 準備した小胞皿を顕微鏡ステージに置き、最適な位置合わせのために中央に配置されていることを確認します。
      6. 落射蛍光モードでは、励起ビームを対物レンズの後部開口部の中央に配置することで、レーザービームの焦点を調整します。
      7. ステッピングモーターを使用して、臨界角に達するまでレーザーの入射角を調整し、ガラス表面での全反射を確保します。
      8. Z軸を走査して焦点面を特定し、1)ガラス底面に対応する最初の焦点面。2)小胞固定面に対応する第2の焦点面。
      9. 小胞にピントが合ったら、CellSensでオートフォーカスを適用して、この平面に対物レンズの位置を固定し、イメージング中のドリフトを防ぎます。
      10. レーザーを一時的にオフにし、顕微鏡ステージを励起光にまださらされていない新しい視野に移動します。
      11. レーザーをオンにしながら記録を開始すると、事前の露出なしで光退色プロセス全体を確実にキャプチャできます。
      12. 次のパラメータで画像を取得します: 露光時間:フレームあたり100ミリ秒、取得モード:視野あたり900連続フレーム、ゲイン設定:1,400。
      13. 複数のビューフィールドに対してこのプロセスを繰り返して、十分なデータ収集を確保します。
      14. 画像スタックをTIFF形式で保存して、さらに処理します。

3. 画像処理とデータ解析

  1. 共焦点画像処理
    1. 取得した共焦点画像を連携ソフトウェアで開きます。
    2. ルックアップ テーブル (LUT) の設定を調整して、明るさとコントラストを最適化します。
    3. すべての画像に同じLUT調整を均一に適用して、視覚的な一貫性を維持します。
  2. TIRFビデオ処理と蛍光強度分析
    1. 視覚化のためのビデオ処理
      1. 取得したTIRF画像スタック(TIFF形式)をImageJで開いて可視化します。
      2. 輝度とコントラストを調整して信号の明瞭度を高め、蛍光小胞を背景と簡単に区別できるようにします。
      3. 調整された画像をエクスポートして、プレゼンテーションやさらなる定性分析を行います。
    2. 光退色ステップ解析
      1. 時間トレースの抽出
        1. "getTimeTraces.m" という名前の MATLAB スクリプト ( 補足ファイル 1 を参照) を開き、実行します。グラフィカル ユーザー インターフェイス (GUI) で、[ ムービーのロード ] をクリックし、TIRF イメージング .tiff ファイルを選択して、小胞ムービー スタックをインポートします。
        2. Find Peaks(ピーク検索)をクリックすると、1分子の蛍光シグナルが自動的に同定されます。信号領域は、プレビューウィンドウで円でマークされます。
        3. 「 データの入力」をクリックします。これにより、各スポットの時間強度トレースが.xlsxファイルにエクスポートされ、下流の解析が可能になります。
      2. 手動ステップカウント
        1. 「simpleGraph.m」スクリプト( 補足ファイル1を参照)を実行してGUIを起動し、[ データファイルのロード ]をクリックして、手順3.2.2.1.3で生成した.xlsxファイルを選択します。
        2. 左パネルに表示されている各タイムトレースの漂白ステップを点検します。次の基準を満たすトレースのみが分析に受け入れられることを確認してください:1)時間トレースには、少なくとも1つの異なる漂白ステップが含まれています。2)1ステップの持続時間は少なくとも1秒です。 3)ステップレベル間の強度差は、漂白後の強度の標準偏差の少なくとも3倍です。
        3. 右側で[ Step # ]フィールドを見つけ、[+]または[-]ボタンを使用して、各トレースの光退色ステップ数を入力します。
        4. 各エントリが完了したら、[ 次へ ] をクリックして次のトレースに移動します。すべてのトレースが処理されると、ソフトウェアは各トレースのステップ数を記録する.txtファイルを自動的に生成して保存します。
      3. 歩数の概要
        1. 「CombinedFiles.m」スクリプト( 補足ファイル1を参照)を実行してGUIを開きます。
        2. サマリー出力の目的の名前をテキストボックスに入力します。
        3. 「複数のsimpleGraph結果を1つのファイルに結合」をクリックします。ファイルブラウザで、手順3.2.2.2.3で生成された1つ以上の必要な.txtファイルを選択します。このスクリプトは、すべてのステップ数データを自動的にコンパイルし、1ステップ、2ステップの頻度を要約した結合.xlsxファイルを生成します,...トレース。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この方法の適用性を確認するために、まず、心臓および神経組織の凍結切片の共焦点イメージングにより、GFP-RyR2の発現と局在を確認しました(図1)。心筋組織における蛍光シグナルは、心筋細胞におけるRyR2の予想局在と一致する横縞模様を示したが、脳の特定の領域、すなわち皮質、海馬、小脳では高い強度を示し、領域特異的な発現を示した。

最適化された調製プロトコル(図2A)を使用してこれらの組織から小胞を生成した後、ナノ粒子追跡分析(NTA)を使用してサンプル間で一貫したサイズ分布を確認し、心臓由来の小胞と脳由来の小胞間の比較可能性を確保しました(図2B)。固定化小胞のTIRF顕微鏡イメージングでは、バックグラウンド蛍光が最小限に抑えられ、均一で十分に分散した小胞集団が示され、BAM...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究では、GFPタグ付きRyR2をモデルシステムとして使用して、膜受容体のex vivoカプセル化および単一分子イメージングのための詳細で再現性のあるプロトコルを確立します。このプロトコールは、天然組織から直接受容体複合体の化学量論的分析を可能にし、膜タンパク質の生理学的状況を維持することにより、現在の方法を大幅に進歩させます。従来のin vitro発現システムと比較して、このアプローチは過剰発現や界面活性剤の可溶化によってもたらされるアーチファクトを最小限に抑え、受容体の集合体5,8に関するより生物学的に関連性のある洞察を可能にします。

この方法の重要性は、光退色ステップを使用して単一分子レベルで受容体化学量論を検出できることで強調されており、これにより不均一な集団の分離と微妙な構造変異の検出が可能になります。これまでの単一分子研究は、細胞培養または精製タンパク質に依存してい...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は、宣言する利益相反を持っていません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UKY Light顕微鏡コアとBioelectronics and Nanomedicine Centerの施設の使用に感謝します。この作業の支援は、NIH(GM138837およびGM138882)によって提供されました。 図2 (https://BioRender.com/s69w811)と図3 (https://BioRender.com/y54b47)はBioRenderで作成されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
35 mm ディッシュ |No. 1.5 カバースリップ |14 mm ガラス径MattekP35G-1.5-14-C
Andwin Scientific Tissue-Tek クライオモールド金型/アダプターFisher ScientificNC9542860
APTESMillipore Sigma440140-100ML(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン
Bio-Gen PRO200 ラボ用ホモジナイザーPro Scientific1204B59
cellSENSOlympus Scientific Solutionsn/a
EMCCD カメラAndorn/aiXon Ultra 897
エタノール無水≥分子生物学のための100%(v / v)USP(200プルーフ)VWR71006-012
ライカCM1860カ/aクライオスタット
MetaMorphアドバンストレキュラーデバイスn/a
Nanosight NS300(Nanosight NTAソフトウェア付き)Malvern Panalyticaln/a
Nikon AXR倒立共焦点顕微鏡Nikonn/a
オリンパス IX83 電動オートフォーカス倒立蛍光顕微鏡オリンパスn/aTIRFM
パラホルムアルデヒド 4% PBS ですぐに使用できる固定試薬VWR76221-378
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 20x、超高純度グレードVWR97062-950
水酸化ナトリウム、ビーズ、試薬グレードVWR97064-526
SUNBRIGHT OE-020CS +NOFAmerica Corporationn/aOleyl-O(CH2CH2)nCO-CH2CH2-COO-NHS
Tissue-Tek OCT コンパウンドSakuraM71484
VectaMount AQ 水性封入媒体クターラボラトリーH-5501-60
ライnモベ

参考文献

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