生体外 心臓および神経組織におけるライアノジン受容体2集合体の1分子解析

サマリー

この研究では、天然の受容体組織を保持する小胞ベースの単一分子イメージング法を示し、正確な化学量論の定量化と、受容体の組み立て、機能、および疾患の研究における広範なアプリケーションを可能にします。

要約

受容体の集合を理解することは、生理学的プロセスにおけるその機能と制御の根底にあるメカニズムを解明するために重要です。従来の in vitro 1分子研究では、異種発現系からタンパク質を単離することに頼っていますが、細胞表面タンパク質の組織化と組み立てに関与する in vivo の生理学的複雑さを捉えることができないことがよくあります。このプロトコルでは、全反射蛍光顕微鏡(TIRFM)を使用して、ナノスケールの小胞内にカプセル化されたGFPタグ付きリアノジン受容体2(RyR2)分子を研究します。動物から迅速に抽出された臓器から生成されるこれらの小胞は、抽出時の受容体の集合状態のスナップショットを効果的に提供し、動物の生理環境の変化に応じたサブユニットの化学量論と受容体組織の詳細な分析を可能にします。このアプローチでは、TIRFMと段階的な光退色分析を利用して、受容体化学量論の読み出しを提供します。単一分子レベルでのイメージング受容体は、生きた動物に集合した受容体集団内の不均一性の検出を容易にし、疾患状態に関連する集合変化のモニタリングを可能にします。その結果、この方法は、受容体集合体の分布とそれらの生理学的環境の変化との相関関係を決定するための強力なツールを提供します。

概要

膜受容体は、人体全体の生理学的プロセスにおいて重要な役割を果たしています¹。主な機能は、細胞内シグナル伝達イベントを開始するための細胞外刺激の伝達を通じて細胞間のコミュニケーションを仲介することです。シグナル伝達における基本的な役割のため、既存の治療薬の約70%が膜受容体を標的としています²。それらはしばしば、複数の化学量論^3,4を持つヘテロメア形態に組み立てられた複数のサブユニットで構成されるオリゴマー構造です。受容体がどのように機能的な複合体に組織化されるかを理解することは、健康と疾患における受容体の役割を解明するために重要です^5,6。免疫沈降法やウェスタンブロッティングなどの従来の生化学的手法では、アンサンブル測定を平均化することで、受容体亜集団の不均一性が不明瞭になります⁷。対照的に、単一分子技術では、個々の受容体を直接観察することができ、受容体集団内の不均一性の定量化が可能になる^8,9,10

プロトコル

1. サンプル調製

1. 経心灌流と臓器摘出
   1. 呼吸が止まるまでCO₂を使用してマウスに麻酔をかけます。
   2. マウスを仰臥位に置き、手足を固定します。
   3. 腹部に沿って正中線を切開し、胸郭に向かって横方向に伸びて胸腔を露出させます。
   4. 左心室に針を慎重に挿入し、右心房を横断して灌流液を排出します。
   5. 小胞の準備には、循環器系から血液がなくなるまで、冷たい1x PBSで灌流します。
   6. 凍結切片の場合、PBS灌流後、4%パラホルムアルデヒド(PFA)による灌流を続けて組織を固定します。
   7. ハートを丁寧に取り出し、すぐに氷の上に置きます。
   8. 細いハサミを使って、頭皮の正中線に沿って慎重に切り、皮膚をはがして頭蓋骨を露出させます。
   9. 大孔近くの頭蓋骨の基部を切開します。
   10. 細い鉗子を使用して、縦方向の裂傷に沿って頭蓋骨を慎重にこじ開け、骨片を取り除いて脳を露出させます。
   11. 湾曲した鉗子を使用して脳をそっと持ち上げ、脳神経を切断して完全に無傷で抽出します。
   12. 凍結切片に使用する場合は、脳を4%PFAに4°Cで24時間後固定します。
   13. 小胞の準備に使用する場合は、すぐに脳を固定せずに氷の上に置いて、さらなる処理を....

結果

この方法の適用性を確認するために、まず、心臓および神経組織の凍結切片の共焦点イメージングにより、GFP-RyR2の発現と局在を確認しました(図1)。心筋組織における蛍光シグナルは、心筋細胞におけるRyR2の予想局在と一致する横縞模様を示したが、脳の特定の領域、すなわち皮質、海馬、小脳では高い強度を示し、領域特異的な発現を示した。

最適化された調製プロトコル(図2A)を使用してこれらの組織から小胞を生成した後、ナノ粒子追跡分析(NTA)を使用してサンプル間で一貫したサイズ分布を確認し、心臓由来の小胞と脳由来の小胞間の比較可能性を確保しました(図2B)。固定化小胞のTIRF顕微鏡イメージングでは、バックグラウンド蛍光が最小限に抑えられ、均一で十分に分散した小胞集団が示され、BAM.......

ディスカッション

この研究では、GFPタグ付きRyR2をモデルシステムとして使用して、膜受容体のex vivoカプセル化および単一分子イメージングのための詳細で再現性のあるプロトコルを確立します。このプロトコールは、天然組織から直接受容体複合体の化学量論的分析を可能にし、膜タンパク質の生理学的状況を維持することにより、現在の方法を大幅に進歩させます。従来のin vitro発現システムと比較して、このアプローチは過剰発現や界面活性剤の可溶化によってもたらされるアーチファクトを最小限に抑え、受容体の集合体^5,8に関するより生物学的に関連性のある洞察を可能にします。

この方法の重要性は、光退色ステップを使用して単一分子レベルで受容体化学量論を検出できることで強調されており、これにより不均一な集団の分離と微妙な構造変異の検出が可能になります。これまでの単一分子研究は、細胞培養または精製タンパク質に依存してい.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
35 mm ディッシュ |No. 1.5 カバースリップ |14 mm ガラス径	Mattek	P35G-1.5-14-C
Andwin Scientific Tissue-Tek クライオモールド金型/アダプター	Fisher Scientific	NC9542860
APTES	Millipore Sigma	440140-100ML(	3-アミノプロピル)トリエトキシシラン
Bio-Gen PRO200 ラボ用ホモジナイザー	Pro Scientific	1204B59
cellSENS	Olympus Scientific Solutions	n/a
EMCCD カメラ	Andor	n/a	iXon Ultra 897
エタノール無水≥分子生物学のための100%(v / v)USP(200プルーフ)	VWR	71006-012
ライカCM1860	カ	/a	クライオスタット
MetaMorphアドバンスト	レキュラーデバイス	n/a
Nanosight NS300(Nanosight NTAソフトウェア付き)	Malvern Panalyticaln	/a
Nikon AXR倒立共焦点顕微鏡	Nikon	n/a
オリンパス IX83 電動オートフォーカス倒立蛍光顕微鏡	オリンパス	n/a	TIRFM
パラホルムアルデヒド 4% PBS ですぐに使用できる固定試薬	VWR	76221-378
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 20x、超高純度グレード	VWR	97062-950
水酸化ナトリウム、ビーズ、試薬グレード	VWR	97064-526
SUNBRIGHT OE-020CS +	NOFAmerica Corporation	n/a	Oleyl-O(CH2CH2)nCO-CH2CH2-COO-NHS
Tissue-Tek OCT コンパウンド	Sakura	M71484
VectaMount AQ 水性封入媒体	クターラボラトリー	H-5501-60

ライnモベ