このプロトコルは、マイコバクテリアから高品質なDNAを抽出するためのCTAB法を説明し、硬く菌酸豊富な細胞壁による課題を克服します。このプロセスには、酵素による消化、CTABによる細胞溶解、有機抽出およびエタノール沈殿によるDNA精製が含まれます。この方法は分子研究に適したDNAを生成し、マイコバクテリア研究にも信頼性があります。
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この記事について
サマリー
要約
効率的かつ信頼性の高いDNA抽出は分子生物学の基本的なステップであり、PCR、シーケンス、ゲノム解析などの後継応用に高品質な遺伝物質を提供します。しかし、脂質と菌酸に富む独特の細胞壁組成を持つマイコバクテリアは、効率的なDNA分離に大きな課題をもたらしています。セチルトリメチルアンモニウム臭化物(CTAB)法は、高純度のDNAをマイコバクテリア種から効率的に抽出できるため広く用いられています。これは、速増殖株と遅い株の両方を含むものです。この技術は、リソザイムとプロテナーゼKを用いて細菌細胞を酵素的に破壊し、その後CTABを用いて細胞成分を溶解し、選択的に結合して多糖類やタンパク質と複合体を形成します。DNAの精製と濃縮は有機溶媒抽出とエタノール沈殿によって達成されます。当社のデータによると、CTABプロトコルは高品質かつ最小限の汚染で高品質かつ最小限のDNAをゲル電気泳動およびナノドロップ解析で証明し、200 - 1000 ng/μLのDNAを生成します。異なる菌種から抽出されたDNAは高純度で、さまざまな分子研究に適しています。本研究はCTAB法の手順を明らかにし、マイコバクテリアDNA抽出に伴う特有の課題を克服する上でその有用性を強調しています。
概要
高品質なDNAの抽出は分子生物学の基本的なステップであり、PCRや全ゲノムシーケンス、その他のゲノム研究などの後継応用に不可欠です。 Mycobacterium tuberculosis(M.tuberculosis)のような病原性種と、Mycobacterium smegmatis(M. smegmatis)のような非病原性環境種の両方を含む属では、DNA抽出はその厚く脂質豊富かつ疎水性の細胞壁のために難しい場合があります.この頑丈な細胞壁は、細胞を破壊しゲノムDNAを効果的に放出するために専門的な溶解法を用いる必要があります。
セチルトリメチルアンモニウム臭化物(CTAB)法は、さまざまな菌種から高品質なDNAを分離するのに信頼性が証明されています4,5。CTABはカチオン界面活性剤で、多糖類やその他の細胞成分に結合し、抽出過程での除去を容易にします6.難しいサンプルであっても、CTABベースのプロトコルは、酵素溶解、熱処理、有機溶媒抽出と組み合わせることで、完全な純DNAの効率的な分離を保証します7,8。CTAB法は、特に全ゲノムシーケンス、メタゲノミクス、分子診断に関わる研究において、マイコバクテリア種からの効率的なDNA抽出において重要な役割を果たしており、純粋で高品質なDNA入力材料が求められます 9,10。ビーズビーディングや市販キットなど他のDNA抽出技術と比較して、ここで紹介するCTABプロトコルはDNAの完全性を保持する明確な利点を持ち、これはロングリードシーケンスやエピジェネティックな応用において不可欠な要素です。以前の研究では、CTABによる機械的破壊法に比べてDNA収量が低いと報告されていますが、DNAの剪断を最小限に抑えDNA完全性を維持する能力も強調されています11,12。純度と収量の制限に対処するため、現行プロトコルは培養時間を短縮し、多様なサンプルタイプ間での一貫性を向上させて最適化されています。この改良は、Oppermanらの発見によって裏付けられており、CTAB抽出されたマイコバクテリウム・アビウム培養DNAが、16S rRNAシーケンシングやラインプローブアッセイなどの後継応用に十分な濃度と品質を持つことが示され、CTABプロトコルを多機能かつ拡張性の高いマイコバクテリア研究のツールとして適用することをさらに支持しました。特に高度な分子解析に完全なゲノムDNAを必要とする研究においてです13.さらに、次世代シーケンシング(NGS)では一般的に100〜1000 ngの高品質ゲノムDNAが必要であり、PacBioシーケンシングのようなロングリードシーケンスでは高品質DNA15の4≥μgが必要となるため、大量の高品質かつ完全なDNAが必要な場合、CTABは有効な方法として機能します。
分解しにくい微生物から効率的で一貫性があり効果的なDNA抽出手法を確立することは、特に株同定や疫学研究において、実験室間での再現性と信頼性を確保するために必要です 5,7。このプロトコルは、CTAB法を用いてマイコバクテリアから全ゲノムDNAを抽出するための詳細を提供します。現在のプロトコルは、研究者が分子生物学のワークフローにおいて一貫性かつ信頼性の高い結果を得られるようにし、特徴的なマイコバクテリア細胞壁の落とし穴を克服することを目指しています。
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プロトコル
代表的な結果は、ステレンボッシュ大学のREC: BES倫理委員会(BES-2024-22504)の承認を得て作成されました。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。
1. マイコバクテリア培養懸濁液の調製
注意:検査対象の種によっては、この工程はバイオセーフティレベル2(BSL-2)またはバイオセーフティレベル3(BSL-3)の実験室で実施しなければなりません。培養の培養期間や条件も、マイコバクテリア種の成長速度や生理的特徴の違いにより成長要件に依存します。
- ミドルブルック7H9液体培地またはMGIT培地で5mLまたは8mLの細菌培養液をOADCを補足して準備し、必要な期間37°Cで培養して細菌の増殖を促します。成長の遅いマイコバクテリアは10〜14日、成長の早いマイコバクテリアは約2〜5日かかります。
注意:ミコバクテリア細胞の懸濁液は、初期培養が固体寒天プレート(例:Middlebrook 7H10 agar)であれば、無菌二重蒸留水に複数のコロニーをこすり取ることで調製できます。 - 液体培養液を15mLのチューブに注ぎます。
- 培養皿を80°Cで1時間熱殺菌します。
- 結 核菌 やBSL-3を必要とする他の病原性種の場合、熱殺菌培養をBSL-2検査室に移します。
2. 細胞壁の消化とDNA抽出
注:培養液が熱不活化されると、以下の手順はバイオセーフティレベル2(BSL-2)の実験室で安全に実施可能です。長リードシーケンスや高分子量DNAを必要とする代替用途の抽出が目的であれば、ワイドボアピペットチップを使用し、ボルテックスステップではボルテージを反転またはピペット混合に置き換えてください。
- 15mLチューブを室温(RT)で3220 x g で15〜30分間遠心分離します。透明な上清液は捨て(すべてのメディアを取り除いてください)。
- 培養ペレットを300μLのTris-EDTA(TE)バッファーで徹底的に再懸濁します。
- 再懸濁したペレットを2mLのチューブに移します。
- リソザイム100μL(10 mg/mL)を加え、ピペットで上下に5回混ぜ、均一な分散を確保するためにチューブを優しく叩きます。
- 混合液を37°Cの回転式インキュベーターで一晩(~16時間)培養します。培養時間が短くなると溶解効率が低下し、DNA収率が低下する可能性があります。
- 翌日、5μLのプロテナーゼK(10 mg/mL)と70 μLの10% SDSの混合物を準備します。例えば、サンプルが5つある場合は、10%SDSを350μL、プロテナーゼKを25μL準備します。泡の形成を防ぐためにチューブを逆さにして混合します。
- 各サンプルに75μLの混合物を加えます。
- タッピングで混合し、65°Cで10分間インキュベーターまたは加熱ブロックで培養し、逆転で間欠的に混合します。
- 5 M NaCl 100 μL を加えます。
- 65°Cで予熱したCTAB/NaCl溶液100μLを加えます。
注意:ピペッティングの精度を確保する前に、RT時の粘度を考慮してCTAB/NaCl溶液を65°Cまで加熱してください。 - 溶液が乳白色になるまで軽く叩いて混ざります。
- 65°Cで10分間インキュベーターまたは加熱ブロックで培養し、反回転による断続的な混合を行います。
- 各試料に同量(~ 675 μL)のクロロホルム/イソアミルアルコール溶液(24:1)を加え、タップで混ぜます。
注意:この工程はフムフード内で行ってください。クロロホルムは吸入すると有毒であり、注意した取り扱いが必要です。 - サンプルを12000 x g の温度で室温で10分間遠心分離します。
- 水相(上部)相を550〜600μL慎重に無菌1.5mLチューブに吸引し、適切にラベルを付けます。
注意:他の層を乱さないように注意してください。もし何らかの層が誤って破損した場合は、再度遠心分離機でチューブを動かしてください。
3. DNA沈殿と洗脱
- 同じ量(550〜600μL)の氷で冷たいイソプロパノールを加え、チューブを逆さまにして混ぜます。
注:DNA濃度が高い場合、混合時に白色沈殿が発生することがあります。 - チューブは-20°Cで30分から1時間孵化します。
注:培養期間が長くなるとDNA沈殿が増加しますが、 塩分の共沈殿を引き起こすこともあります。したがって、DNA濃度が低いと予想される場合は、一晩の培養が可能です。 - 室温で最大速度(~21130 x g)で30分間遠心分離し、不溶性DNAをペレット状にします。
注意:1.5インチのチューブの前面が遠心分離機ローター内で内側に向いていることを確認してください。この段階でDNAはチューブの底部と後部に沈殿します。これは、次の工程で見えないかもしれないペレットを乱さないために重要です。DNA濃度が高い場合、白色の沈殿物やペレットが見えることがあります。ペレットが存在しないことは抽出失敗を示しません。残りのステップを進めてください。 - DNAペレットを乱さず、素早くデキャントしつつ、ペレット自体が乱れない状態を保ちながら、チューブの前面から上清液を吸引してください。
注意:開始培養が小さくDNA濃度が低いと予想される場合は、上清液を吸引する方が良いです。 - 氷のように冷たい75%エタノール1000μLを加えます。
- チューブを何度か逆さまにして混ぜます。
- 遠心分離機は12000g×30分間(ステップ3と同じ向きで)続けます。
- ペレットを乱さずにすべてのエタノールを吸引またはデカントしてください。
注意:高い塩分共沈殿が予想される場合は、ステップ5から8を繰り返すことがあります。 - チューブはRTで一晩または少なくとも30分間自然乾燥させてください。
- 各チューブに25〜50μLのTEバッファー(pH8)を加えてDNAを再懸濁させます。
注:DNAは、下流の適用でEDTAに敏感であれば、Tris(10 mM、pH 8)バッファーやヌクレアーゼフリー水に再懸濁可能です。 - DNAペレットを4°Cで一晩再懸濁させます。
- 品質管理評価を行う前に、4°Cで2〜3日間保存してください。
- 長期保存は-80°Cで保管してください。
4. DNA定量および品質管理
注:DNA品質管理は一般的にマイクロボリューム分光光度計とゲル電気泳動を用いて行われます。蛍光ベースの定量システムも用いられます。
- 分光光度計法
- DNA濃度を測定し、製造元の指示に従って品質を判断してください。
注:DNAサンプルは理想的には1.7から2.0の260/280比率です。DNAの純度は通常1.8とみなされます。この範囲を下回る値は、残留タンパク質、グアニジン、または280 nm付近で強く吸収する他の試薬による汚染を示しています。2.0〜2.2の260/230比率が理想的です。比率が予想より低い場合は、EDTA、フェノール、炭水化物など230nmで吸収される汚染物質の存在を示す可能性があります。サンプルの吸収グラフも確認してください。
- DNA濃度を測定し、製造元の指示に従って品質を判断してください。
- 電気泳動
- DNAの完全性を評価し、断片化または分解が起きたかどうかを判断するためにアガロースゲル電気泳動19 を実施します。
- UVゲル記録システムでDNAを可視化するには、SYBRセーフ染料を含む1.0%アガロースゲルを使用します。ゲルを80Vで45分間動かします。
注:目的は、DNAはしごの最高バンドの上に明確で明確な高分子量帯を持つことです。毎回新しい1×TAEバッファーを使ってください。
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結果
このCTAB法を用いたDNA抽出プロトコル(図1)は、 結核菌、 膿瘍菌 、 ケロネア菌など様々な菌種に対して評価されました。DNAを抽出し、サンプル間で抽出されたDNAの収率、純度、完全性を比較しました。
DNA濃度は菌種ごとに異なり、場合によっては190〜600 ng/μLから>1000 ng/μLの範囲で、CTABが高収量DNAを抽出していることを示しています。260/280および260/230の比率はそれぞれ1.9-2.0および1.8-2.2の範囲で、高純度DNAを示しています(表1)。分光光度計は260 nmに単一の吸収ピークを示しました(図2B)。このデータは、CTABプロトコルがさまざまなミコバクテリア種から高収量かつ高純度のDNAを効果的に抽出できることを示しています。分離されたDNAの完全性を...
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ディスカッション
代表的な結果は、CTAB法がマイコバクテリア種からDNAを抽出し、これらの生物からDNA抽出に伴う課題に対処する上で有用であることを示しています。マイコバクテリアはその複雑で脂質豊富な細胞壁でよく知られています2.現在の結果は、この技術が成功するいくつかの重要な側面を強調しており、PCRやシーケンシング、その他のゲノム研究などの後継応用に適した高濃度かつ高品質な完全なDNAを提供できると考えています。
CTAB-DNA抽出プロトコルは、多数のマイコバクテリア種から高品質で完全なゲノムDNAを安全に取得する効果的かつ信頼性の高い方法であることが証明されています 4,10。プロトコルのいくつかの重要なステップは、高品質かつ大量のDNA抽出に影響を与えます。マイコバクテリアの細胞壁は、マイコ酸や疎水性成分の層によって特徴づけられており、DNAの放出に大きな課...
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開示事項
著者には開示すべき利益相反はありません。
謝辞
著者らは、このプロトコルの開発と最適化への貢献、そして本研究を通じてかけがえのない支援をいただいた結核ゲノムチームのナビラ・イスマイル、メラニー・グロベラー、エミリン・コスタ、ロブ・M・ウォーレンに心から感謝の意を表します。この研究と関係者は、南アフリカ医療研究評議会(SAMRC)、国立研究財団(NRF)、ステレンボッシュ大学(SU)からの助成金と資金援助を受けました。資金提供者は研究設計、データ収集、分析、原稿作成には関与していません。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1 mLピペットチップ | どのサプライヤーでも | ||
| 10 & micro;Lピペットチップ | どのサプライヤーでも | ||
| 10%ナトリウムドデシル硫酸ナトリウム(SDS) | メルク(シグマ・オルドリッチ) | 71736-100 ML | |
| 15 mLポリプロピレン管 | どのサプライヤーでも | ||
| 2mlチューブと1.5mlチューブ | どのサプライヤーでも | ||
| 200 & マイクロ;L ピペットの先端 | どのサプライヤーでも | ||
| 分子B&2-プロプラノール、バイオ試薬 | メルク(シグマ・オルドリッチ) | I9516-1L | -20度にストアし、C |
| 37°Cインキュベーター | どのサプライヤーでも | ||
| 5 M NaCl | メルク(シグマ・オルドリッチ) | S6546 - 100 ML | |
| 65°Cインキュベーター | どのサプライヤーでも | ||
| アガロースジェル | メルク(シグマ・オルドリッチ) | ||
| Bio-Rad UVゲル文書システム、 | バイオラッド | ||
| 遠心分離機(15ml管用、50ml用)およびマイクロフュージ(2ml管用) | どのサプライヤーでも | ||
| クロロホルム分析用エンパルタ&レジック;ACS | メルク(シグマ・オルドリッチ) | 1070242500 | |
| クロロホルム/イソアミルアルコール(24:1) | フームフードでクロロホルム384mlとイソアミルアルコール16mlを混ぜます | ||
| CTAB/NaCl溶液 | メルク(シグマ・オルドリッチ) | 52370-100 G | 4.1 g NaClを80mlの蒸留水に溶かします。かき混ぜながら10gのCTABを加えます。65度の加熱溶液;Cインキュベーター。蒸留水で100mlに体積を調整してください。室温で最大6ヶ月保存してください。 |
| DNA 1 Kb ラダー | サーモフィッシャー・サイエンティフィック | ||
| エチルアルコール、純度、200プルーフ、MOL&; | メルク(シグマ・オルドリッチ) | E7023-500ML | アブソリュートエタノール75mlと蒸留水25mlを混ぜます |
| リソザイム(10 mg/ml) | メルク(シグマ・オルドリッチ) | 10837059001 | 蒸留水で10 mg/mlに再構成します |
| ミドルブルック7H9メディア | メルク(シグマ・オルドリッチ) | M0178 | 液体メディアの準備に関してはメーカーのガイドラインに従ってください |
| ミドルブルックOADC濃縮6×100 ML F | BD | 212240 | |
| マイコバクテリア成長指示管(MGIT)培地 | BD | 245122 | |
| ナノドロップシステム | サーモフィッシャー・サイエンティフィック | ||
| P10ピペット | どのサプライヤーでも | ||
| P1000ピペット | どのサプライヤーでも | ||
| P200ピペット | どのサプライヤーでも | ||
| プロテイナーゼK、リコム、PCR grd 2x250mg | メルク(シグマ・オルドリッチ) | 3115801001 | 凍結乾燥プロテイナーゼKを蒸留水で10 mg/mlに再構成します。アリコートを2mlチューブで-20度で凍結します。C |
| SYBRセーフ | サーモフィッシャー・サイエンティフィック | ||
| Tris/EDTA(TE)バッファーpH 8.0 | メルク(シグマ・オルドリッチ) | 8890-OPか382499997 | |
| 渦 | どのサプライヤーでも |
参考文献
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