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方法論記事

生きた ショウジョウバエ の翼の想像ディスクにおけるサイトーンメームによって媒介される細胞間接触を評価するためのGFP相補性ベースの二重発現システム

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DOI:

10.3791/68411

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2025年8月22日

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1Institut de recherches cliniques de Montréal (IRCM), 2Programmes de biologie moléculaire, Université de Montréal, 3Département de Médecine, Université de Montréal

この記事について

サマリー

GFP再構成ベースのアプローチを使用して、生きたショウジョウバエの翼の想像上の円盤の隣接する上皮層の細胞間の接触を測定するためのプロトコルについて説明します。

要約

胚組織の成長とパターン化は、組織自体内の細胞集団間で局所的に交換されるシグナルによって主に制御されます。サイトネームは、ショウジョウバエで最初に同定されたシグナル伝達糸状偽足の一種で、シグナル産生細胞とシグナル受信細胞の間の交換を接続して仲介します。発達中のショウジョウバエの翼の想像ディスクでは、サイトネームは、成体の翼を形成する椎間板固有(DP)上皮内の異なる細胞集団間、およびDP細胞と隣接する椎間板関連組織の細胞間のシグナル交換に関与しています。サイトネームは標的細胞とシナプスを形成し、親密な膜接触を形成します。

ここでは、生きた翼の椎間板におけるGFP再構成アプローチを用いて、DP細胞と、椎間板内腔によってDP細胞から分離されている隣接する足周囲膜(PerM)上皮の細胞との間のサイトーンを介した接触を定量化するためのプロトコルを提示する。GAL4-UASおよびLexA-LexAopシステムを使用して、それぞれがCD4の膜貫通ドメインに融合した分割GFP(spGFP1-10、spGFP11)の相補的なフラグメントが、椎間板内腔の両側で発現します。次に、共焦点顕微鏡による生翼ディスク調製中の再構成GFP蛍光のイメージングを使用して、再構成されたGFP蛍光を局在化および定量できる画像スタックを生成します。このシステムを使用すると、タンパク質コードまたはRNA干渉導入遺伝子をサイトーンム産生細胞または標的細胞のいずれかで共発現させて、DP-PerM細胞接触への影響を測定することができます。このシステムは、他の組織に容易に適応できるため、サイトーンムの形成や機能に重要な因子の同定が可能になります。

概要

胚組織の発達は、組織内の離れた細胞に信号を送り、増殖(つまり、成長と分裂)または特定の運命を採用する決定を制御する「組織化センター」にある細胞によって制御されます1。この細胞の非自律シグナル伝達は、組織を介して濃度勾配を形成し、濃度依存性応答を誘発する中心細胞を組織化することによって生成されるリガンドによって媒介されます。多くの場合、これらのリガンドは、組織内のシグナル送受信細胞を接続するサイトネームと呼ばれる長いアクチンベースのシグナル伝達糸状偽足を介して送達またはピックアップされます2,3。ショウジョウバエの翼の想像ディスク4で最初に発見されたサイトーンメムは、哺乳類や他の脊椎動物でも同定されています5,6,7,8,9。細胞の非自律シグナル伝達におけるサイトーンムの役割をよりよく理解することは、細胞がどのようにコミュニケーションして組織に組織化されるか、およびこれらのコミュニケーションラインが発達奇形や癌などのさまざまな病理学的状態でどのように変化するかを解読するために重要です。

サイトネムは、ソース細胞からリガンドを標的細胞に送達するために、または標的細胞からそのソースに近いリガンドを受け取るために伸びることができます2,3。サイトーンは標的と密接に接触し、そこでシナプス様構造を形成すると考えられており、そこでリガンド移動が発生する可能性があります3,10,11。この接触は、ソースサイトーンとターゲットのサイトーンの先端の間、またはサイトーンと細胞体の間で発生する可能性があります3。広く特徴付けられていませんが、接着分子または受容体-リガンド相互作用による細胞接着は、場合によっては、下流のシグナル伝達イベント12,13,14の適切な活性化に必要であり、これはサイトーン生物学の重要な側面となっています。

いくつかの研究では、「シナプスパートナーをまたぐGFP再構成」(GRASP)技術をサイトーンム接触の分析に適用しています。この方法は、複雑な神経系のシナプスパートナーを同定し、マッピングするために開発されました15。これは、異なる細胞集団における膜貫通ドメイン(CD4など)の細胞外領域にそれぞれ融合した分割GFPの2つの相補的なフラグメント(spGFP1-10およびspGFP11)の発現に基づいています。これら2つの集団の細胞の原形質膜が直接接触すると、spGFPの相補的なドメインが近接し、GFP蛍光の再構成につながります。このアプローチは ショウジョウバエ で、翼ディスク内の細胞間、およびウィングディスクと他の密接に並んだ組織との間のサイトーンム接触の存在を特定するために使用されています12、16、17、18、19、20、21。

この論文では、ショウジョウバエの翼の想像上の円盤、椎間板固有(DP)および足周囲膜(PerM)の形態学的に異なる2つの上皮層間の接触の特徴付けへのGRASPの適用について説明します。これらの上皮層は中央内腔を囲む嚢を形成し、偽層状円柱状DP細胞が片側に位置し、扁平上皮PerM細胞がもう片側に位置し、どちらも頂端膜が内腔に向かって内側を向いています(図1A)。2つの層22、23、24、25の間に経内腔シグナル伝達の証拠がいくつかあり、最近、DP21の頂端サイトーンムによって媒介されるPerM細胞の増殖を制御するためのDPからのシグナル伝達を文書化しました。このプロトコルでは、GAL4/UASおよびLexA/LexAop導入遺伝子発現系を使用して、DP細胞およびPerM細胞の膜上でCD4に融合したspGFPの相補的なフラグメントを発現させます。再構成されたGFP蛍光を使用して、2つの細胞集団間の膜接触を読み取ります。

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プロトコル

nubbin-GAL4ドライバーは、DPの翼袋領域で特異的にCD4-spGFP1-10を発現するために使用されます(図1A)。PerM-LexAドライバー21は、PerMにおいてCD4-spGFP11を特異的に発現させるために使用されます(図1A)。これら2つの発現系は互いに独立しており、DPおよびPerMにおける異なる導入遺伝子の同時かつ特異的な発現を可能にします(図1B、C)。

基本的な遺伝スキームには、ハエを交配して遺伝子型 nub-GAL4 / UAS-CD4-spGFP1-10の幼虫を生成することが含まれます。PerM-LexA/LexAop-CD4-spGFP11。陰性対照として、 LexAop-CD4-spGFP11 導入遺伝子を除外します。他の導入遺伝子(例えば、タンパク質コード、二本鎖RNA)は、DP層( UAS 配列の制御下)またはPerM( LexAオペレーターの制御下)で必要に応じて発現できます。

これは、中断できないライブイメージングプロトコルです。材料の準備は~10分と推定されます。解剖は、イメージング前に一度に 20 分以上実行しないでください。イメージングには~30分かかり、~1時間以上続くことはありません。複数の条件または多数のサンプルの場合、最良の結果を得るために手順を複数のラウンドで実行する必要があります。

1. 材料の準備

  1. 解剖に先立って、ピンセット、9ウェルガラスくぼみスポットプレート(または幼虫の収集と洗浄に適したその他の容器)、および70%エタノールで解剖に使用される再利用可能なシルガード(シリコン)コーティングされたペトリ皿をきれいにします。
  2. 70%エタノール洗浄を行い、乾燥したスライドに イメージングスペーサー を貼り付けて、顕微鏡スライドを調製します。はさみで8ウェルストリップから個々のウェルを切り取り、半分に切ります(図2A)。各半分の片側から保護バッキングを取り外し、スペーサーをスライドに貼り付け、ディスクが配置される中央に保護されたスペースを作成するために少し間隔をあけて貼り付けます(図2B)。
    注:私たちの経験では、スライドに移される媒体の正確な量がそれほど重要ではないため、これによりサンプルの取り付けが簡素化されます。少量の余剰量は、カバースリップ時に隙間から流出します。比較的短い時間(通常~1時間)しか撮影しなかったため、中程度の乾燥では問題はありませんでした。
  3. ライブイメージング培地(凍結10 mLアリコートで保存されたサプリメントなしのシュナイダーショ ウジョウバエ 培地)を解凍し、アイスバケツに簡単にアクセスできるようにします。
  4. 2 mLの微量遠心チューブで、1.5 mLの培地を20 μLの200 μg/mLのHoechst 33342(最終濃度2.7 μg/mL)と混合します。チューブを氷の上に置いてください。
    注:この特定の形態のヘヒスト色素は、膜透過性が高いため使用されます。注意: Hoechst 33342 を取り扱うときは、手袋を使用する必要があります。工具は使用後に洗浄する必要があります。

2. 翼椎間板の解剖とスライドの準備

  1. 遺伝的交配と25°Cでの飼育に続いて、チューブからさまよう3齢の幼虫を摘み取り、9ウェルガラスのくぼみスポットプレート内の冷たいライブイメージング培地で洗浄します。
    注:サイトーンムは非常に壊れやすいです。次の手順では、椎間板と解剖ツールが直接接触しないように、椎間板の周囲の組織を操作するように注意する必要があります。いくつかの椎間板に損傷を与えることは避けられず、これはイメージングステップ中にのみ顕著になる可能性があるため、一度に3〜4匹の幼虫を準備します。
  2. 解剖顕微鏡下で、幼虫をシリコンでコーティングされたペトリ皿上のライブイメージング培地の滴に移し、2つの解剖鉗子を使用して解剖を開始します。これを行うには、まず、体長の約3分の1(前部から)で1対の鉗子で幼虫をつまんで、頭と体の前部を安定させます。2番目の鉗子を使用して、最初の鉗子のすぐ後ろで体をつまみます。次に、幼虫の後部を引き離して、前部の「半分」を分離します。
  3. 切断端の両側に1対のピンセットで固定し、もう一方のピンセットで頭を押し込み(靴下を裏返すように)、想像上の椎間板、気管、唾液腺、脂肪体、腸などの内部構造を露出させて、前半分を反転させます。
  4. 唾液腺、脂肪体、腸を慎重に取り除き、翼の円盤の上に横たわって保護する気管の外側幹を乱さないように注意します。
  5. 鉗子を使用して、翼ディスクが取り付けられた洗浄された前半分を、準備されたスライドのスペーサーの間に配置されたHoechstを含むクリーンなライブイメージング培地の滴に慎重に移します(図2C)。解剖鉗子の片方の刃または解剖針ホルダーに取り付けられた細いタングステンワイヤーを使用して、椎間板に接続する気管の細い枝から翼ディスクをそっと鈍く解剖することにより、翼ディスクを残りの組織から分離します。残りの枝肉は捨てます。
  6. 解剖鉗子またはタングステンワイヤー解剖針の片方の刃を使用して、ディスクの向きを変えます。平らな涙滴のような形状のため、翼ディスクはDPまたはPerMのいずれかを上に向けて落下します。このプロトコルでは、すべてのディスクをPerM側を上にして向きを変えます。
  7. 必要に応じて培地を追加または除去することにより、ウェルを完全に満たすように培地の容量を調整し、イメージングスペーサーのレベルよりわずかに上にします。各イメージングスペーサーの半分の上側から保護バッキングを取り外し、カバーガラスをサンプルの上に慎重に下げます。カバーガラスがイメージングスペーサーに接触する場所(解剖鉗子の丸みを帯びた端など)をそっと押して、カバーガラスがスペーサーに付着していることを確認します。
    注:気泡を閉じ込めないように、中程度のレベルはスペーサーの高さよりわずかに上にする必要がありますが、カバーガラスを下げたときに大きな流れを発生させるほど高くしないでください。

3. イメージング

  1. 40x/1.30 NA油浸レンズと顕微鏡ソフトウェアを備えた共焦点顕微鏡(GFPは波長488 nmのアルゴンイオンレーザー、Hoechstは波長350 nmのUVレーザー)を使用して、室温でサンプルを画像化します。PerMの最高レベル(ヘクスト蛍光が減少する場所)のすぐ上からDPの基底側まで、通常スタックあたり100枚以上の画像に及ぶ1μmのステップサイズの画像スタックを取得します。繰り返し画像スタックを取得して、タイムラプスムービーを生成します。
    注:スライドを~1〜2時間以内で画像化します。
  2. 顕微鏡ソフトウェアの設定では、 8ビットコーディング、 ライン平均 化 2、 検出器ゲイン (一般的に 650 〜 750)、および信号のブリードスルーを減らすために分離されたチャネルトラックを使用して画像を取得します。すべての条件で同じレーザーと検出器の設定を使用し、事前に各条件でテストを実行することで事前に決定します。
    注:40倍の倍率では、画像の解像度は5.0386ピクセル/μm(ピクセルサイズ:0.1985 x 0.1985 μm2)です。私たちのセットアップでは、最適な共焦点顕微鏡設定には、可能な限り多くの信号をキャプチャすると同時に、飽和をほとんどまたはまったく得られない、可能な限り最高のレーザー強度(組織に損傷を与えることなく)が含まれていました。また、検出器のオフセットと取得速度(必要な場合)を下げることで達成される、ネガティブコントロールで評価された可能な限り低いノイズ。通常、レーザー出力は 5% 未満で、最大スキャン ヘッド速度は [Zen ソフトウェア設定では '9') を使用します。通常、1つの画像スタックの取得には~1分45秒かかり、タイムラプス分析のために画像は2〜3分ごとに撮影されます。

4. 画像解析

  1. ImageJソフトウェアパッケージの 最大強度投影 機能を使用したプロジェクトスタック(画像をクリック |スタック |Zプロジェクトで、メニューで 最大強度 を選択します)。
  2. MIP画像で、 ポリゴン選択を使用して、翼ディスクの折り畳みパターン(Hoechstチャネルを使用)に基づいて翼袋の面積を決定します。GFPチャンネルで同じ選択を Clear Outside機能 で使用します( Edit |[外側をクリア]) を使用して、すべての外側ピクセル値を 0 に設定します。
  3. MIP 画像では、Hoechst チャネルを使用して GFP 画像をクリーンアップし、特に、関連するピクセル値を 0 に設定して、両方のチャネルに表示される人工スポットを削除します ( [ポリゴン選択]、[編集 ] | [クリア] の順にクリックします)。
  4. クリーニングされたMIP画像で、 ヒストグラム 関数を使用します( [分析] |ヒストグラム |List)を使用して、すべてのピクセル値のリストを取得し、スプレッドシートのテーブルにコピーします。
  5. ネガティブコントロールのバックグラウンドシグナルの分析に基づいて しきい値 を設定します(その後、他のサンプルで検証されました。
  6. 次の式を使用して、GFP陽性表面の割合を計算します。
    %GFP 陽性表面 = figure-protocol-1 × 100
  7. 各値を参照条件の平均 (1 に設定されている) で割って、最後にデータを正規化します。
    注: 有効なピクセル = 値が 1 ≥ピクセルで、値が 0 に設定された削除されたピクセルは事実上無視されます。ピクセル値 0 は自然に発生しません。
  8. 再構成されたGFPシグナルがディスク内のどこに局在するかを決定するには、画像スタックのXZリスライスを使用して、ディスク上皮の根尖基底軸を調べます。フィジーで補間なしで再スライスを実行し、双線形補間を伴う スケール 関数を使用して Z 軸の画像の高さを増やし、視認性を向上させます。

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結果

DP細胞とPerM細胞間の接触を測定するためのGRASP手順の有用性をテストするために、4つの異なる遺伝子型の翼ディスクを調べました:GFPチャネルの自家蛍光のバックグラウンドレベルのみを表示する野生型陰性対照ディスク(遺伝子型: w1118)。DP層でCD4-spGFP1-10を発現するが、GFP1-10単独で生成される蛍光のレベルを示すCD4-spGFP11導入遺伝子を欠いています(GFP1-10は蛍光を発しないはずなので、無視できると予想していました26)。CD4-spGFP1-10およびCD4-spGFP11がそれぞれDPおよびPerMで発現するディスク(図3A)は、DP-PerM接触の「正常な」レベルを明らかにします。CD4-spGFP1-10 および CD4-spGFP11 に加えて、 UAS 制御下の DP 細胞で Ser/Thr プロテインキナーゼ Slik も発現するディスク。DP細胞におけるSlik発現はPerM細胞の非自律増殖を促進する

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ディスカッション

サイトーンムはリガンドの分布において重要な役割を果たし、発達中の組織の成長と組織化を制御します。シグナル交換は、サイトーンムチップがターゲットと密接な膜接触を行う場所で行われます。このプロトコルでは、GRASP技術を使用して、翼板の上皮層間のサイトーンム媒介接触を分析するための簡単な方法について説明します。

ここで紹介する技術には、少なくとも4つのコンポーネント(GAL4ドライバー、LexAドライバー、および UAS および LexAop 制御下での相補的なspGFPフラグメントのCD4融合をコードする2つの導入遺伝子)が必要です。選択したドライバーを使用して、CD4-spGFPタンパク質のいずれかの発現に関連する識別可能な効果または致死性は検出されませんでした。したがって、4つのコンポーネントすべてを安定して含むユニバーサルドライバストックを構築することができます。このストックは、追加の UAS および LexAop 導入遺伝子の任意の組み合...

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開示事項

著者には宣言すべき競合する利益はありません。

謝辞

この研究は、DH への CIHR 助成金 (PJT-162109) によって支援されています。MJ は、Institut de Recherches Cliniques de Montréal Foundation およびモントリオール大学の分子生物学プログラムから博士課程の奨学金を保持しています。著者らは、IRCM 顕微鏡およびイメージング プラットフォームの支援を大いに評価しています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ディスカバリーV12解剖顕微鏡ツァイス解剖顕微鏡
デュモン #55 鉗子、生物学のヒントファインサイエンスツール11255-20解剖鉗子
EP-Slik (slik20358)BDSCのPanneton et al. 2015 スリックを発現するためのフライひずみ
フィジーシンデリン、J. et al. (2012) 画像解析ソフトウェア
ヘクスト 33342 サーモフィッシャーサイエンティフィックH3570 ライブイメージング核染色 
LexAop-CD4-spGFP11 BDSCの93018ハエひずみ
LSM 700共焦点顕微鏡 ツァイス共焦点顕微鏡
nub-GAL4ブルーミントンショウジョウバエストックセンター(BDSC)86108ハエひずみ
PerM-LexAランボー、ジョセフ他、2025ハエひずみ
PYREX 9-くぼみガラススポットプレート販売コーニングライフサイエンス7220-85幼虫の採取・洗浄用
シュナイダーショウジョウバエの培地サーモフィッシャーサイエンティフィック21720024ライブイメージング媒体
SecureSealイメージングスペーサー、8ウェル、厚さ0.12mm グレース・バイオ・ラボ654008スペーサー
SYLGARD 184 シリコンエラストマーキットシルガード3097358-1004解剖プレート製作用
UAS-CD4-spGFP1-10 BDSCの93017ハエひずみ
ゼンブラックツァイス取得ソフトウェア

参考文献

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