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生きた ショウジョウバエ の翼の想像ディスクにおけるサイトーンメームによって媒介される細胞間接触を評価するためのGFP相補性ベースの二重発現システム

DOI:

10.3791/68411

⸱

August 22nd, 2025

 , 
1Institut de recherches cliniques de Montréal (IRCM), 2Programmes de biologie moléculaire, Université de Montréal, 3Département de Médecine, Université de Montréal

In This Article

Summary

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GFP再構成ベースのアプローチを使用して、生きたショウジョウバエの翼の想像上の円盤の隣接する上皮層の細胞間の接触を測定するためのプロトコルについて説明します。

Abstract

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胚組織の成長とパターン化は、組織自体内の細胞集団間で局所的に交換されるシグナルによって主に制御されます。サイトネームは、ショウジョウバエで最初に同定されたシグナル伝達糸状偽足の一種で、シグナル産生細胞とシグナル受信細胞の間の交換を接続して仲介します。発達中のショウジョウバエの翼の想像ディスクでは、サイトネームは、成体の翼を形成する椎間板固有(DP)上皮内の異なる細胞集団間、およびDP細胞と隣接する椎間板関連組織の細胞間のシグナル交換に関与しています。サイトネームは標的細胞とシナプスを形成し、親密な膜接触を形成します。

ここでは、生きた翼の椎間板におけるGFP再構成アプローチを用いて、DP細胞と、椎間板内腔によってDP細胞から分離されている隣接する足周囲膜(PerM)上皮の細胞との間のサイトーンを介した接触を定量化するためのプロトコルを提示する。GAL4-UASおよびLexA-LexAopシステムを使用して、それぞれがCD4の膜貫通ドメインに融合した分割GFP(spGFP1-10、spGFP11)の相補的なフラグメントが、椎間板内腔の両側で発現します。次に、共焦点顕微鏡による生翼ディスク調製中の再構成GFP蛍光のイメージングを使用して、再構成されたGFP蛍光を局在化および定量できる画像スタックを生成します。このシステムを使用すると、タンパク質コードまたはRNA干渉導入遺伝子をサイトーンム産生細胞または標的細胞のいずれかで共発現させて、DP-PerM細胞接触への影響を測定することができます。このシステムは、他の組織に容易に適応できるため、サイトーンムの形成や機能に重要な因子の同定が可能になります。

Introduction

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胚組織の発達は、組織内の離れた細胞に信号を送り、増殖(つまり、成長と分裂)または特定の運命を採用する決定を制御する「組織化センター」にある細胞によって制御されます1。この細胞の非自律シグナル伝達は、組織を介して濃度勾配を形成し、濃度依存性応答を誘発する中心細胞を組織化することによって生成されるリガンドによって媒介されます。多くの場合、これらのリガンドは、組織内のシグナル送受信細胞を接続するサイトネームと呼ばれる長いアクチンベースのシグナル伝達糸状偽足を介して送達またはピックアップされます2,3。ショウジョウバエの翼の想像ディスク4で最初に発見されたサイトーンメムは、哺乳類や他の脊椎動物でも同定されています5,6,7,8,9。細胞の非自律シグナル伝達におけるサイトーンムの役割をよりよく理解することは、細胞がどのようにコミュニケーション....

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Protocol

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nubbin-GAL4ドライバーは、DPの翼袋領域で特異的にCD4-spGFP1-10を発現するために使用されます(図1A)。PerM-LexAドライバー21は、PerMにおいてCD4-spGFP11を特異的に発現させるために使用されます(図1A)。これら2つの発現系は互いに独立しており、DPおよびPerMにおける異なる導入遺伝子の同時かつ特異的な発現を可能にします(図1B、C)。

基本的な遺伝スキームには、ハエを交配して遺伝子型 nub-GAL4 / UAS-CD4-spGFP1-10の幼虫を生成することが含まれます。PerM-LexA/LexAop-CD4-spGFP11。陰性対照として、 LexAop-CD4-spGFP11 導入遺伝子を除外します。他の導入遺伝子(例えば、タンパク質コード、二本鎖RNA)は、DP層( UAS 配列の制御下)またはPerM( LexAオペレーターの制御下)で必要に応じて発現できます。

これは、中断できないライブイメージングプロトコルです。....

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Results

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DP細胞とPerM細胞間の接触を測定するためのGRASP手順の有用性をテストするために、4つの異なる遺伝子型の翼ディスクを調べました:GFPチャネルの自家蛍光のバックグラウンドレベルのみを表示する野生型陰性対照ディスク(遺伝子型: w1118)。DP層でCD4-spGFP1-10を発現するが、GFP1-10単独で生成される蛍光のレベルを示すCD4-spGFP11導入遺伝子を欠いています(GFP1-10は蛍光を発しないはずなので、無視できると予想していました26)。CD4-spGFP1-10およびCD4-spGFP11がそれぞれDPおよびPerMで発現するディスク(図3A)は、DP-PerM接触の「正常な」レベルを明らかにします。CD4-spGFP1-10 および CD4-spGFP11 に加えて、 UAS 制御下の DP 細胞で Ser/Thr プロテインキナーゼ Slik も発現するディスク。DP細胞におけるSlik発現はPerM細胞の非自律増殖を促進する

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Discussion

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サイトーンムはリガンドの分布において重要な役割を果たし、発達中の組織の成長と組織化を制御します。シグナル交換は、サイトーンムチップがターゲットと密接な膜接触を行う場所で行われます。このプロトコルでは、GRASP技術を使用して、翼板の上皮層間のサイトーンム媒介接触を分析するための簡単な方法について説明します。

ここで紹介する技術には、少なくとも4つのコンポーネント(GAL4ドライバー、LexAドライバー、および UAS および LexAop 制御下での相補的なspGFPフラグメントのCD4融合をコードする2つの導入遺伝子)が必要です。選択したドライバーを使用して、CD4-spGFPタンパク質のいずれかの発現に関連する識別可能な効果または致死性は検出されませんでした。したがって、4つのコンポーネントすべてを安定して含むユニバーサルドライバストックを構築することができます。このストックは、追加の UAS および LexAop 導入遺伝子の任意の組み合.......

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Disclosures

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著者には宣言すべき競合する利益はありません。

Acknowledgements

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この研究は、DH への CIHR 助成金 (PJT-162109) によって支援されています。MJ は、Institut de Recherches Cliniques de Montréal Foundation およびモントリオール大学の分子生物学プログラムから博士課程の奨学金を保持しています。著者らは、IRCM 顕微鏡およびイメージング プラットフォームの支援を大いに評価しています。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ディスカバリーV12解剖顕微鏡ツァイス解剖顕微鏡
デュモン #55 鉗子、生物学のヒントファインサイエンスツール11255-20解剖鉗子
EP-Slik (slik20358)BDSCのPanneton et al. 2015 スリックを発現するためのフライひずみ
フィジーシンデリン、J. et al. (2012) 画像解析ソフトウェア
ヘクスト 33342 サーモフィッシャーサイエンティフィックH3570 ライブイメージング核染色 
LexAop-CD4-spGFP11 BDSCの93018ハエひずみ
LSM 700共焦点顕微鏡 ツァイス共焦点顕微鏡
nub-GAL4ブルーミントンショウジョウバエストックセンター(BDSC)86108ハエひずみ
PerM-LexAランボー、ジョセフ他、2025ハエひずみ
PYREX 9-くぼみガラススポットプレート販売コーニングライフサイエンス7220-85幼虫の採取・洗浄用
シュナイダーショウジョウバエの培地サーモフィッシャーサイエンティフィック21720024ライブイメージング媒体
SecureSealイメージングスペーサー、8ウェル、厚さ0.12mm グレース・バイオ・ラボ654008スペーサー
SYLGARD 184 シリコンエラストマーキットシルガード3097358-1004解剖プレート製作用
UAS-CD4-spGFP1-10 BDSCの93017ハエひずみ
ゼンブラックツァイス取得ソフトウェア

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ng, J. K., Tamura, K., Buscher, D., Izpisua-Belmonte, J. C. Molecular and cellular basis of pattern formation during vertebrate limb development. Curr Top Dev Biol. 41, 37-66 (1999).
  2. Kornberg, T. B. Cytonemes and the dispersion of morphogens. Wiley Interdiscip....

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Cytoneme Mediated ContactDrosophila Wing DiscGFP ComplementationLive ImagingConfocal MicroscopySplit GFP SystemCell Cell ContactPeripodial MembraneTissue Growth SignalingProtein Expression

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