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方法論記事

縦断的予後評価のための外部回腸造設術による腸移植のラット移植拒絶モデル

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DOI:

10.3791/68412

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2025年6月10日

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1Department of Pediatric Surgery, Graduation School of Medicine, The University of Osaka, 2Department of Stem Cell Therapy Science, Graduate School of Medicine, The University of Osaka

この記事について

サマリー

このプロトコルは、移植片拒絶反応に対する薬物介入の経時的評価のための回腸造設術によるラットベースの腸移植モデルについて説明しています。

要約

今日まで、臓器移植は依然として臓器不全の主流治療です。さまざまな固形臓器の中で、腸移植後の患者の予後は、主に移植片拒絶反応のために不満足なままです。この課題には、外科的技術のさらなる改善、または新しい術後薬理学的介入の開発が必要です。この記事では、腸管移植片拒絶反応のラットモデルを提示し、そのような調査のプラットフォームとして機能します。Fischer 344(F344)株から単離された回腸の一部をLewis(LEW)ラットに同種移植し、続いて定義された用量とスケジュールでタクロリムスを投与しました。外部回腸造設術は、同種移植片の組織状態の非侵襲的な縦断的モニタリングを可能にするために構築されました。回腸造設画像を使用して三色線形回帰モデルを訓練し、0 から 10 のスケールで回腸造設状態を評価できる画像ベースの評価スキームを構築するために使用されました。評価では、移植後3週目から同種移植片の健康状態が悪化することが示されました。同種移植片の組織学的解析では、術後 (POD) 28 日以降、ヒト患者で観察されたものと同様に、慢性的な拒絶反応の兆候が確認され、非侵襲的回腸造瘻術の画像評価の結果が検証されました。ここで紹介する腸管同種移植モデルと関連する評価方法は、腸移植の治療法開発を促進することが期待されます。

概要

臓器不全とは、1つ以上の重要な臓器が最適に機能せず、健康を維持できない状態です。医療処置の遅れは、多くの場合、致命的であったり、感染症などの二次合併症と関連しています1。ほとんどの臓器では、機能不全の臓器の交換が、長期にわたる回復のための唯一の実行可能な選択肢です。体細胞2による幹細胞の再獲得の発見以来、これらの人工多能性幹細胞(iPSC)は完全な器官形成を可能にし、事実上無制限の置換器官の供給源を提供する可能性があると仮定されてきました。胚発生に関する知識とシグナル伝達の手がかりの慎重な制御を組み合わせることで、オルガノイドのスケールで複数の組織を作製することに成功しました。本格的な臓器作製については、最近、眼などの特定の臓器で大きな進歩が見られました3,4が、ほとんどの重要な臓器では、ヒトドナーからの同種移植が依然として主流のアプローチです。

内臓の中で、腸移植は引き続き不十分な予後結果を示しており、さらなる外科的改良または薬物介入が必要です5。新規介入がヒト被験者で直接検証されることはめったになく、腸移植の動物モデルで最初に評価されることが多い。本稿では、これらの潜在的な治療の進歩の評価プラットフォームとして機能するための、腸移植片拒絶反応のラットモデルについて詳しく説明しています。

ヒトで観察された微妙なヒト白血球抗原(HLA)のミスマッチを模倣するために、Fischer 344(F344)ラットから単離された性別一致(雄)回腸セグメントをLewis(LEW)ラットに移植し、続いて急性期に免疫抑制剤タクロリムスの最適用量を投与して慢性期移植片拒絶反応を誘導しました。このドナーとレシピエントのペアは、同じ主要な組織適合遺伝子群遺伝子座を共有していますが、マイナーな組織適合抗原が異なります6。この方法では、移植された粘膜の一部を回腸造瘻術として外部に形成し、移植の予後と拒絶状態の視覚的な経時的モニタリングを可能にしました。さらに、拒絶状態を定量化するための補完的な回腸ストーマ画像ベースの方法が提示され、移植された移植片の対応する組織学的変化によって検証されます。

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プロトコル

すべての動物処置は、大阪大学大学院医学系研究科動物実験委員会(参照番号04-018-003)で承認され、大阪大学のガイドラインに従って実施されました。レシピエントの雄Lewis(LEW)ラット(体重200-250g、7-9週齢)とドナー雄のFischer 344(F344)ラット(体重200-250g、10-12週齢)を用いた。手術前に腹部を剃り、70%エタノールで滅菌しました。本試験で使用した試薬および装置の詳細は、 資料表に記載されています。

1. ドナー手術

  1. 手術の12時間前にドナーラットを絶食します。
  2. ドナーラットを吸入イソフルランで麻酔します(施設で承認されたプロトコルに従います)。ラットをオペレーターに対して垂直に配置します。手順中に実体顕微鏡を5倍の倍率に設定します。結紮には5-0シルクを使用します。
    注:イソフルランの流量は1.5 L / minでした。イソフルランは、最初の腹部切開時に2.5%で送達され、手術中も1.5%に維持されました。.適切な麻酔は、つま先をつまむときにつま先反射がないことによって確認されました。必要に応じて、麻酔を確認した後の乾燥を防ぐために、獣医軟膏を目に塗ります。
  3. 8cmの正中線切開を行い、腹腔を開きます。上部切開部を剣状突起まで伸ばして、門脈 (PV) が明確に視覚化されるようにします。
  4. トレイツ靭帯を解剖し、小腸を時計回りに180度回転させて腸の回転を逆にします。
  5. 腸間膜血管ループを観察し、回腸から長さが約 10 cm のところにある、血管新生した移植部位を選択します (図 1A1)。
  6. 遠位腸間膜を解剖し、回腸遠位端の上腸間膜動脈 (SMA) と上腸間膜静脈 (SMV) を結紮します。SMA/SMVが近位結紮から切断されていることを確認してください。不適切な結紮は出血を引き起こし、移植片の灌流を損なう可能性があります。
  7. 胃と脾臓を頭蓋骨にずらしてPVをはっきりと露出させます。
  8. SMA/SMV の左側にある中結腸動脈/静脈と右結腸動脈/静脈を解剖し、結紮します。
  9. SMA / SMVの右側にある腸間膜を解剖し、空腸枝を結紮します。ねじれを防ぐために、SMVに近すぎるライゲーションは避けてください(図1A2)。
  10. 綿棒を使用してSMAベースを静かに分離し、SMAの上の大動脈とPVの間の腸間膜を結紮します。この領域には、上腸間膜リンパ節と多数のリンパ管が含まれています。
  11. 大動脈の右側にある右腎動脈を特定し、結紮します(図1A3)。
  12. ヘパリン化生理食塩水(200U / 2 mL)を陰茎静脈に注入します。
  13. 最終的なグラフトの長さを決定し、過剰な腸間膜枝を結紮します。移植片の近位端と遠位端の両方で直線動脈を結紮します。
  14. SMAの下の大動脈を結紮し、次にSMAの上の大動脈を結紮し、大動脈の円形パッチとともにSMA基部を切除します。肝門門で門脈を切断し、斜めに切断して大きな吻合部の開口部を作成します。
    1. 近位および遠位の血管ループと腸を切断に進みます。抽出したグラフトを冷たい生理食塩水(4°C)に入れます(図1A4)。
  15. 近位大動脈結紮術を切除して放血を誘発し、ドナーラットを安楽死させます(施設で承認されたプロトコルに従います)。

2. グラフト加工

  1. 上腸間膜動脈(SMA)と門脈(PV)を特定します。
  2. SMA を介して 15 mLの冷生理食塩水でグラフトを穏やかに灌流します(図1B1)。すべての血液が交換され、移植片の色が淡いまたは白に変わることを確認します。
  3. 腸移植片の内腔を洗い、糞便内容物を取り除きます。
  4. 移植片を移植まで新鮮な冷たい生理食塩水に浸しておきます。

3. レシピエント手術

  1. 吸入されたイソフルランでレシピエントラットに麻酔をかけます(施設で承認されたプロトコルに従います)。ラットをオペレーターに対して垂直に置きます。
    1. 実体顕微鏡は、一般的な手順では5×に、血管吻合では12.5×に設定します。結紮には5-0シルクを使用し、8-0を使用します血管吻合用の合成ポリプロピレン縫合糸。手術中の低体温症を防ぐために、ラットを加熱パッドの上に置きます。
      注:イソフルランの流量は1.5 L / minでした。イソフルランは、最初の腹部切開時に2.5%で送達され、手術中に1.5%に減少しました。.麻酔は、つま先をつまんだ後のつま先反射の欠如によって確認されました。必要に応じて、麻酔の確認後の乾燥を防ぐために、獣医用軟膏を目に塗布します。
  2. 手術前に、0.5 mg / kgタクロリムスを筋肉内に注射します。.正中線切開(~5cm)を行い、腹腔を開きます。
  3. 腸と結腸を頭蓋に動かし、Treitz靭帯を解剖します。腸と結腸を湿ったガーゼで包み、ラットの体に置きます。
  4. 下大静脈(IVC)と大動脈(図1B2)の腹膜を解剖します。右性腺動脈と静脈を特定し、結紮します。適切な尿管を見つけます。
  5. ラットを反時計回りに90°回転させて、頭がオペレーターの左側を向くようにします。湾曲したブルドッグ血管クランプを使用して、右腎静脈の上のIVCをクランプします。.
  6. IVCの壁をハサミで切開して楕円形の開口部を作ります。生理食塩水で洗い流し、IVCの尾側縁にステイ縫合糸を留置します(図1B3-1)。静脈吻合口が大きい (~1 cm) ことを確認し、吻合部で PV 壁を適切に伸ばします。
  7. 移植片をラットの左側に置き、PVとSMAをIVCと大動脈の近くに配置します。回腸遠位端を頭に向けます。グラフトを冷たく湿らせたガーゼで包み、氷を塗って低温を維持します。
  8. ステイ縫合針(8-0合成ポリプロピレン縫合糸)をPVの尾側縁に通します。蚊クランプを使用して縫合糸の張力を制御します。
  9. PVの頭蓋縁をIVCに縫合して結びます(PVからIVC)。PV後壁(IVCからPV)を吻合します(図1B3-2)。PVの右端でステー縫合糸を結びます。次に、PV前壁(PVからIVC)を吻合します。
    1. 吻合を完了する前に、移植片PVをクランプし、ヘパリン化生理食塩水を注入します。縫合糸を結び、IVCクランプを外します(図1B3-3)。
      注:初期出血は吻合時に発生する可能性がありますが、通常は自然に制御されます。
  10. 腸骨動脈分岐部の上の大動脈を湾曲したブルドッグクランプでクランプします。
  11. 大動脈壁を切開します。大動脈とSMA(~4-5mm)の頭蓋縁にステー縫合糸(8-0合成ポリプロピレン縫合糸)を留置します(図1B4-1)。蚊取りクランプでステー縫合糸を保持して張力をコントロールします。
  12. さらに8-0でパスSMAと大動脈の尾側縁を通る針。ラットの右側で結んで吻合を開始します(図1B4-2)。ステー縫合糸を結びます。
  13. ラットを180°回転させて、頭がオペレーターの右側を向くようにします。左側でSMAから大動脈への吻合を完了します。最終的な縫合の前に、グラフトPVをクランプし、ヘパリン化生理食塩水を注入します。縫合糸を結びます(図1B4-3)。
  14. 再灌流のために大動脈クランプとPVクランプをリリースします(図1B5)。初期出血が発生する場合がありますが、綿棒を使用して穏やかな圧力で制御できます。移植片の粘膜は数分以内にピンク色に変わります(図1B6)。
  15. ラットを90°回転させて、頭が反対側を向くようにします。右腹部に 8 mm の皮膚切開を 2 回行い、回腸移植片の近位端と遠位端を外側に押し出します。
    1. 5-0ポリジオキサノン(PDS)を使用して皮膚と移植片の漿膜を縫合します(図1B7)。正中線切開部を5-0 PDSで閉じて手術を完了します。
      注:術後のラットは、意識が完全に回復するまで注意深く監視する必要があります。.胸骨の横臥が達成されるまでケージに戻らないでください。

4. 術後管理

  1. 急性期に移植片を維持するために、術後日 (POD) 1-13、20、および 277 日に 0.5 mg/kg のタクロリムスを筋肉内に注射します。
    注:交互の脚に連続した注射を投与します。あるいは、タクロリムスを皮下投与することもできます。.
  2. メロキシカムを0.4 mg / kgでPOD 1-3に皮下注射します。.
    注:レシピエントラットは通常、POD 7まで体重を減らし、POD 14までに回復します。回腸造瘻術による体液喪失による脱水症状を軽減するために、生理食塩水の皮下注射を投与することがあります。予期せぬ死亡率は、POD 7 より前の症例の約 20% で発生します。その後、生存率と一般的な健康状態は通常安定しています。

5.腸移植片の健康状態の画像評価

  1. ImageJで回腸ストーマの画像を開きます。イメージを RGB スタックに変換するには 、[イメージ] > [タイプ] > [RGB スタック] を選択します。
    注: イメージがまだ RGB 形式でない場合は、 まず [イメージ >タイプ > RGB カラー] を使用して RGB カラーに変換します。
  2. 回腸ストーマの目に見える粘膜領域のみを含む関心領域 (ROI) を選択します。
  3. 選択したROI内の各チャネル(赤、緑、青)の強度を測定します。
  4. 次の式を使用して、グラフトのヘルススコアを計算します。
    スコア = figure-protocol-1
    注:最終スコアを次のように正規化します:スコア>10の場合は、10の値を割り当てます。スコア< 0 の場合は、値 0 を割り当てます。

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結果

主要な外科的チェックポイントの代表的な画像を 図1に示します。再灌流成功率はほぼ100%、術後生存率は80.0%(手術25回中20回)でした。手順が正しく実施され、指定された投与量とスケジュールでタクロリムスが投与された場合、外部回腸造設術は通常、手術後3週目から白っぽくなり、移植片拒絶の兆候を示しました(図2A、B)。対照的に、拒絶反応を引き起こさない同系移植片(LEW→LEW)は、長期間にわたって良好な健康状態を維持しました(図2B)。三色回帰モデルを使用した回腸造炻術の外観の縦断的モニタリング(トレーニングパフォーマンスと回帰出力の詳細は 補足ファイル1に記載されています)は、移植片の健康状態と拒絶状態に関する定量的な洞察を提供しました(図2A、C)。組織学的解析により、術後28日目と45日目に...

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ディスカッション

腸移植の短期的および長期的な転帰を改善するための外科的および薬理学的介入の改善の開発には動物実験が不可欠ですが、ラットの腸移植手術の技術を確立することは経験的に困難でした。ここでは、ヘテロトピー性腸移植の外科的手技について詳しく述べています。この方法では、ドナーとレシピエントの操作時間はそれぞれ約35分と90分でした。移植片の虚血性損傷と動物の生存に直接相関する温存虚血時間は約45分でした。温虚血時間は以前に報告されたものよりも長いにもかかわらず 8,9,10、この移植片拒絶モデルで POD 45 が達成されるまでの生存率は 80% を超え、生存には 60 分未満の温虚血時間が許容できるはずです。また、前報告8とは異なり、血管吻合中のレシピエントIVCと大動脈の同時クランプは関与していなかった。代わりに、IVCまたは大動脈は、湾曲したブル...

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開示事項

Ka.T.は、StemRIM Inc.の科学的な創設者であり、株主であり、StemRIM Inc.から研究資金提供を受けています。他のすべての著者は、競合する利益がないと宣言しています。

謝辞

大阪大学大学院医学系研究科医学教育研究センターは、同種移植片の共焦点顕微鏡イメージングに必要な機器を提供しました。この研究は、StemRIMからKa.T.までの研究資金によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
5-0シルク編み込み40cmブラック アルフレッサファーマ62-9965-34
5-0シルク編み込み40cmホワイト アルフレッサファーマ62-9964-99
8-0プロレン BV130-5 45cmエティコンEP8730H
Alexa Fluor 594 ヤギ抗マウス IgG(H+L)インビトロゲンA11005作業濃度:2ug / ml
Alexa Fluor 647 ヤギ抗ウサギ IgG(H+L)インビトロゲンA21245作業濃度:2ug / ml
Barraquer マイクロニードルホルダー、8mm CVD ジョー、6インチ
ブルドッグ血管クランプ 35mm夏目C-42-S-2
フィッシャー344(F344)  日本SLC(静岡県)ドナー、男性、生後10〜12週
ルイス(LEW)ラット 日本SLC(静岡県)レシピエント、男性、生後7〜9週間
マイクロハサミYDMのCC06C
顕微手術用縫合鉗子 - 湾曲、プラットフォーム、丸いハンドル:15 cm/6 in
Ms mAbからコラーゲンIへアブカムAB90395作業濃度:1000倍希釈
生理食塩水 500 mL大塚 3311401A8024
プラスチック製血管ダブルクランプマイクロサージェリートレーニング株式会社
プログラフ注射 5 mgアステラス製薬3999416A1028
Rb pAbからラミニンへアブカムAB11575作業濃度:2ug / ml
小動物用麻酔薬室町木会MK-A100
手術用顕微鏡 OPMI-1FRカールツァイスオプミ-1FR
縫合糸、5/0 18 PDS II CLR MONO P、VAエティコンZ493G型

参考文献

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