このプロトコルは、3Dプリントされたヒドロゲル腫瘍スライスにおけるマントル細胞リンパ腫の生成、培養、および分析の詳細な説明を提供します。
この記事について
サマリー
要約
マントル細胞リンパ腫 (MCL) は、まれで攻撃的な B 細胞腫瘍であり、頻繁に再発し、従来の化学療法に対する反応は限られています。MCL研究における大きな課題は、2D懸濁培養で培養すると細胞が自発的にアポトーシスを起こす傾向があるため、初代MCL細胞を ex vivoで培養することです。3D モデルは固形腫瘍の in vivo 状況をよりよく再現することが知られていますが、リンパ腫におけるその応用はまだ十分に調査されていません。リンパ節内の MCL の in vivo 条件を再現する 3D モデルを開発すると、MCL の生存率が向上し、MCL と腫瘍の微小環境クロストークの研究が容易になり、 in vivo 薬物反応を模倣できます。ここでは、最適化された培養方法とともに、ヒドロゲル腫瘍スライスの形をした MCL の 3D プリント モデルが確立されました。MCL細胞株または初代MCL細胞を使用して標準化されたプロセスが開発され、細胞をアルギン酸塩、I型コラーゲン、および基底膜マトリックスを含むヒドロゲルにゼラチン支持浴にバイオプリンティングすることによって浸漬されます。得られたMCLヒドロゲル腫瘍スライスは、培養期間を通じて安定性を維持するために、フィルターサポート上で培養されます。薬物治療をシステムに適用できます。ヒドロゲル腫瘍スライス内の単一細胞の応答は、4色のライブ3D蛍光イメージングによって追跡できます。初代MCL細胞は、ヒドロゲル腫瘍スライスで培養した場合に安定した生存率を示しました。このプロトコルは、ヒドロゲル腫瘍スライス中のMCL細胞の生成、培養、および分析の詳細な説明を提供します。腫瘍微小環境を厳密に模倣し、気液界面培養を利用することにより、提示されたモデルは、従来の 2D 培養と比較して生理学的関連性を高めます。これは、MCL の生物学的研究と治療研究の両方を前進させる大きな可能性をもたらします。
概要
マントル細胞リンパ腫 (MCL) は、リンパ節1 のマントル ゾーンに由来するまれで進行性の B 細胞非ホジキンリンパ腫です。マントルゾーンは、B細胞卵胞の胚中心を取り囲む小さなリンパ球の輪で構成されています。通常、MCL は積極的な臨床経過を示し、最初の化学療法後に頻繁に再発します。疾患形成1 の理解が深まり、免疫化学療法2、ブルトン型チロシンキナーゼ阻害剤3、抗体薬物複合体4 などの新しい治療法の開発により、MCL 患者の治療選択肢は奏効率の向上と無増悪生存期間の延長につながりました。しかし、薬剤耐性と再発により、この病気は依然として不治の病になります5.部分的には、これはその不均一性と、腫瘍発生および薬剤耐性に対する腫瘍微小環境の影響の結果です6。MCLの研究における課題は、細胞がex vivoで自発的なアポトーシスを受けるため、懸濁培養7で初代MCL細胞を培養することの難しさです4,5。これは、前臨床モデルで MCL をより適切にモデル化するための代替アプローチの必要性を浮き彫りにしています。
In vivo では、腫瘍は、腫瘍細胞、免疫細胞、間質細胞などのさまざまな細胞成分と、細胞外マトリックス (ECM) などの非細胞成分で構成される 3 次元 (3D) 構造です。コラーゲンやラミニンなどの高分子で構成されるECMは、親水性の高い弾性繊維の複雑な繊維状の網を形成し、ゲル状の環境を作り出します2,8,9,10。ex vivo で腫瘍のこれらの in vivo 条件をより適切に再現するために、さまざまな 3D モデルが開発されています。近年、これらのモデルは、主に固形腫瘍に焦点を当て、がんの薬理学と生物学を研究するために重要になっています11。
今日まで、血液がん細胞は懸濁液とリンパ節、骨髄、または二次リンパ組織などの間質環境の両方で増殖する能力を持っているため、この分野はリンパ腫では十分に調査されていません12。In vivoでは、MCL細胞はリンパ節のマントルゾーンから血液または骨髄に播種しますが、主に由来するリンパ節内で増殖します13,14。リンパ節内では、MCL細胞はT細胞、マクロファージ、および間葉系間質細胞に囲まれており、これらはすべてMCL細胞の生存または薬物反応を制御することが示されています14,15,16,17,18。さらに、MCL腫瘍微小環境のクロストーク、ならびに多孔性と機械的特性は、薬物反応と耐性に影響を与える可能性のある重要な要因です6,14。したがって、原発性 MCL を研究するには、ネイティブ微小環境をシミュレートする標準化され再現性のある MCL の 3D 腫瘍モデルが必要です。これまでに、初代MCL細胞のスフェロイドやオルガノイドなどの主に細胞ベースのモデルが確立されています6,19。これらは、初代 MCL 細胞の生存率と長期培養を高めることに成功しています。ただし、これらのモデルでは細胞外マトリックスが過小評価されています。これに関連して、高度な 3D バイオプリンティングは有望なアプローチを提供します。この技術は、生細胞とヒドロゲルを直接組み立てることにより、生理学的に適切なヒドロゲルベースの3Dリンパ節モデルの生成を可能にします。
ここでは、最適化された培養方法とともに、ヒドロゲル腫瘍スライスの形でMCLの3Dバイオプリントモデルが確立されました。細胞は、浮遊ハイドロゲル(FRESH)バイオプリンティング20の自由形状可逆包埋により、コラーゲンI型、アルギン酸塩、およびマトリゲルベースのヒドロゲルスライスに包埋される。ヒドロゲル腫瘍スライスはフィルターサポート上で培養され、これにより MCL 細胞はリンパ節の in vivo 状態を厳密に再現する設定で増殖できます。
このプロトコルは、ヒドロゲル腫瘍スライス中のMCL細胞の生成、培養、および分析の詳細な説明を提供します。4色のライブ3D蛍光イメージングを利用することで、ヒドロゲル腫瘍スライス内の単一細胞の生存率または薬物応答を追跡できます。初代MCL細胞は、ヒドロゲル腫瘍スライスで培養した場合、生存率の改善を示しました。このモデルは、MCL の生物学と治療反応を研究するためのツールを提供し、微小環境の影響と MCL 患者の変動性を理解するための道を開きます。
プロトコル
初代 MCL 細胞を用いた研究は、地元の倫理委員会によって承認されなければなりません。この研究では、エーバーハルト・カールス大学医学部とテュービンゲン大学病院の倫理委員会が、患者および健康なドナーサンプルの収集と精密検査を承認し(プロジェクト番号159/2011BO2)、ヘルシンキ宣言に従って患者から書面によるインフォームドコンセントが得られました。ここで使用した初代MCL細胞は、MCL患者のリンパ節全体から単離されたため、MCL細胞だけでなく、免疫細胞や線維芽細胞などの他の細胞も含まれていました。
1.サポートバス用のゼラチンスラリーの調製
注:ゼラチンスラリーは、3Dバイオプリンティングプロセス中にサポートバスとして機能します。バイオインクの架橋を誘導し、3D構造の形成を可能にします。ゼラチンスラリーの調製は、細胞培養フード内の無菌状態で行う必要があります。
- 6.75 gゼラチン粉末を1.5 mLの1 M HEPES、15 mLの110 mM CaCl2、および133.5 mLの滅菌H2Oに溶解して、10 mM HEPESおよび11 mM CaCl2中の4.5%(w / v)ゼラチン溶液を、蓋付きの滅菌メイソンジャーに調製します。メイソンジャーが高性能ミキサーでの混合に適していることを確認してください。
- 溶液を37°Cで4時間、または溶液を攪拌しても塗抹標本が観察されなくなるまでインキュベートし、ゼラチンが完全に溶解したことを示します。ゼラチンを4°Cで一晩または少なくとも12時間冷却します。
- 10 mM HEPESと14.4 mM CaCl2からなる滅菌洗浄バッファーを調製します。洗浄バッファーを4°Cに予冷します。
- 固化した4.5%ゼラチンを滅菌スプーンを使用していくつかの部分に砕きます。
- 4.5% ゼラチンの入ったメイソン ジャーに予冷した洗浄バッファーを完全に充填し、ゼラチン スラリーを調製するプロセス全体を通じてバッファーが冷たく保たれるようにします。
- ゼラチン含有メイソンジャーを-20°Cで45〜60分間凍結し、ゼラチン懸濁液が0°Cに達するまで凍結しますが、まだ氷の結晶を形成し始めていません。温度計を使用して温度を監視します。
- ミキサーの蓋とブレードをメイソンジャーに取り付けてから、メイソンジャーをミキサーに取り付けます。パルス設定を使用してゼラチン懸濁液を120秒間ブレンドします。
注意: 別のタイプのブレンダーを使用する場合は、ブレンダーの設定を調整する必要がある場合があります。 - ブレンド懸濁液を予冷した50 mLチューブに移します。3,800 x g で 4°C で 2 分間遠心分離します。 懸濁液が下部の固体ゼラチンスラリーと上部の液体洗浄バッファーに分離されていることを確認します。
- 氷上で次の手順を実行します。ゼラチンスラリーを洗浄します。最上部の液体層を吸引し、洗浄バッファーの上に見える気泡を取り除こうとします。20 mLの新鮮な4°C洗浄バッファーをチューブに加えます。チューブをボルテックスして、ゼラチンスラリーを洗浄バッファーと混合します。
- 遠心分離と洗浄プロセスを少なくとも3回、または洗浄バッファーの上部に気泡が見えなくなるまで繰り返します。最終洗浄後、吸引によって残留洗浄バッファーを除去します。ゼラチンスラリーは4°Cで数週間保存できます。
2. 細胞含有バイオインクの調製
- 印刷の1〜2日前に滅菌5%アルギン酸溶液を調製します。50 mLチューブ内の20 mLの滅菌PBSに1 gのアルギン酸を加えます。乾燥したアルギン酸粉末の残留物を防ぐために、PBSを少しずつ添加し、添加の間にボルテックスします。溶液を37°Cのウォーターバスで数時間、または室温のチューブローラーで一晩インキュベートします。アルギン酸塩が完全に溶解したら、必要になるまで溶液を4°Cで保存します。
- MCL細胞株を使用する場合は、T75フラスコで懸濁液で細胞を培養します。印刷当日に、1.4 x 107 細胞が1 mLのバイオインクの調製に利用可能であることを確認し、9〜10個のヒドロゲル腫瘍スライスが得られます。
- 初代MCL細胞を扱う場合、バイオプリンティングの前に細胞を懸濁培養で培養する必要はありません。バイオプリンティングの直前に凍結保存された初代MCL細胞を解凍します。初代MCL細胞を培地の入った50mLチューブに移します。残りの凍結培地を除去するには、直ちにチューブを340 x g で5分間遠心分離し、次に上清を除去します。細胞ペレットを20 mLの新鮮な培地に再懸濁して細胞計数を行います。
- 印刷当日に、目的の細胞に適合したバイオインクを準備します。Jeko-1細胞の場合、0.5%(w / v)アルギン酸塩、20%(v / v)I型コラーゲン、1x RPMI、および2 mM HEPESで構成されるバイオインクを調製します。100 μLの5%アルギン酸塩、200 μLのI型コラーゲン、100 μLの10x RPMI、200 μLの10 mM HEPES、および350 μLのPBSを1 mLのバイオインクに混合します。セルはステップ2.6で追加されます。
- 初代MCL細胞の場合、0.5%(w / v)アルギン酸塩、20%(v / v)I型コラーゲン、1x RPMI、および0.5 mM HEPESで構成されるバイオインクを調製します。100 μLの5%アルギン酸塩、200 μLのI型コラーゲン、100 μLの10x RPMI、50 μLの10 mM HEPES、および500 μLの基底膜マトリックスを1 mLのバイオインクに混合します。セルはステップ2.6で追加されます。MCL細胞株を使用する場合は、細胞懸濁液を培養フラスコから50 mLチューブに移します。
- 細胞を0.4%トリパンブルーと1:1の比率で混合します。セルカウンターまたはノイバウアーチャンバーを使用して、生細胞(未染色)をカウントします。1 mLのバイオインク(1.4x107 細胞に相当)の細胞懸濁液の量を計算します。計算された容量を新しい50 mLチューブに移します。340 x g で5分間遠心分離し、上清を除去します。調製したバイオインクに細胞ペレットを再懸濁して、最終的な細胞を充填したバイオインクを生成します。
注:細胞ペレットの体積は50 μL培地であると推定されました。ステップ2.4で調製したバイオインクと合わせて、1mLのバイオインクが得られます。
3. 浴槽内バイオプリンティング
注:可能であれば、細胞培養フードの下などの無菌環境で3Dプリントプロセスを実施してください。使用した3Dプリンターは、Hinton et al.20で説明されているように、シリンジポンプエクステンダーを追加することにより、FRESH印刷用に変更されました。
- バイオプリンターの電源を入れ、3Dプリンターソフトウェアに接続します。ハイドロゲル腫瘍スライスの設計図を含む.stlファイルを開きます。最大5枚のスライスを同時に印刷できます。各ヒドロゲル腫瘍スライスの直径が8 mm、高さが1.5 mmであることを確認します。塗りつぶし密度を 85% に設定します。プリンターヘッドをホームにします。
注: STL ファイルは Fusion 360 で設計されており、 補足コーディング ファイル 1 にあります。3Dプリントには、ソフトウェアCuraバージョン15.04.5が使用されました。 - 事前に準備したゼラチンスラリーを直径35 mmのペトリ皿に半分になるまで移します。ゼラチンスラリーにエアギャップが残らないようにしてください。使い捨ての精密ワイプを使用してスラリーから余分な水分を引き出し、ペースト状で十分な力が加えられるまで形状を保持するゼラチンサポートバスを生成します。
- 細胞を含んだバイオインクを2.5 mLのガラスシリンジに移し、0.8 mmの鈍いノズルに接続します。シリンジを反転させ、余分な空気と気泡を慎重に排出します。シリンジの準備ができたら、バイオプリンターに挿入します。3Dプリンターソフトウェアを使用して、ノズルから排出され始めるまでバイオインクを押し出します。ノズルの目詰まりを防ぐために、使い捨ての科学精密ワイプを使用して、排出されたバイオインク滴を拭き取ります。
- ゼラチンサポートバスをシリンジノズルの真下に置きます。ノズルがゼラチンスラリーの内側、サポートバスの底から2mm上に配置されるまで、プリンターヘッドを下げます。
- 3Dプリンターソフトウェアを介して印刷プロセスを開始します。
- 印刷プロセスが完了したら、目詰まりを防ぐためにノズルから余分なゼラチンスラリーを取り除きます。ハイドロゲル腫瘍スライスを含むサポートバスを取り出し、蓋をして無菌性を維持します。
- 印刷されたヒドロゲル腫瘍スライスを含むサポートバスを37°Cでインキュベートし、ゼラチンを溶かします。このステップにより、印刷されたヒドロゲル腫瘍スライスがサポートバスから解放されます。
- 洗浄バッファーと細胞培養培地を37°Cに予熱します。 ゼラチンが溶けている間に、ハイドロゲル腫瘍スライスを洗浄するための6ウェルプレートを準備します。2つのウェルに10 mM HEPES、14.4 mM CaCl2洗浄バッファー(ゼラチンスラリーの洗浄に使用されたのと同じバッファー)、および2つのウェルを細胞培養培地で満たします。
- ゼラチンが溶けたら、滅菌スパチュラを使用してヒドロゲル腫瘍スライスを洗浄バッファーに移します。スライスをそれぞれ1分間洗浄し、最初に2つの洗浄バッファー含有ウェルで洗浄し、次に2つの培地含有ウェルで洗浄します。細胞を含んだヒドロゲル腫瘍スライスは、培養の準備が整いました。
- 残りのバイオインクは、印刷プロセスを繰り返すために保管してください。
4. ヒドロゲル腫瘍スライスの培養と治療
- ヒドロゲルスライスを培養するには、6ウェルプレート内に配置されたフィルターサポート(0.4μmの孔径)に移します。1つのフィルターサポートで最大5つのヒドロゲルスライスを培養します。フィルターサポートの下に1.5 mLの細胞培養培地を追加します。ヒドロゲル腫瘍スライスの上に培地を一滴加えて、乾燥を防ぎます。
- ヒドロゲル腫瘍スライスの薬物治療のために、細胞培養培地に所望の量の薬物を加える。ここで、ヒドロゲル腫瘍スライスを0.33μM〜27μMドキソルビシンで48時間または72時間処理しました。常に対照として処理せずに一連のスライスを培養します。
- ヒドロゲル腫瘍スライスを含む6ウェルプレートを、37°Cおよび5%CO2の細胞培養インキュベーターに所望の培養期間置きます。
5. トリパンブルー排除アッセイによる細胞の生存率解析
- 培養または処理後の細胞生存率を評価するには、ヒドロゲル腫瘍スライスを溶解します。ハイドロゲル腫瘍スライスを1.5mLチューブに移します。30 mM EDTA、55 mMクエン酸ナトリウム、および150 mM塩化ナトリウム(pH 6.8)を含む溶解バッファーのスライスあたり500 μLを加えます。ハイドロゲルが完全に溶解するまで上下にピペットで移動します。
- 溶液を340 x g で5分間遠心分離します。上清を吸引します。溶解したヒドロゲルスライスあたり500 μLの培地に細胞を再懸濁します。
- 細胞懸濁液を0.4%トリパンブルーと1:1の比率で混合します。生細胞(染色されていない)と死細胞(染色)をセルカウンターまたはノイバウアーチャンバーでカウントします。さらに分析するために、生細胞と死細胞の数を記録します。
6. 4色ライブ3D蛍光イメージング
注:ここで使用されている4色染色により、生細胞(TMRM陽性)、アポトーシス細胞(蛍光性カスパーゼ-3基質陽性)、および死細胞(PicoGreen陽性)21,22,23の間の区別が可能になります。核はDRAQ5で検出されます。ただし、このプロトコルは、選択したバイオマーカー、細胞構造、または細胞型を検出するために、他の光安定性の特定の蛍光色素に調整できます。染色する前に、顕微鏡が染色に使用される蛍光色素の波長を検出できることを確認してください。
- ヒドロゲル腫瘍スライスの4色染色では、TMRM、DRAQ5、および蛍光性カスパーゼ-3基質を1 mLの細胞培養培地にそれぞれ最終濃度0.5 μM、5 μM、および2 μMで添加して染色溶液を調製します。
- 滅菌スパチュラを使用して、ヒドロゲル腫瘍スライスをチャンバー付きガラスカバーガラスに移します。調製した染色液をハイドロゲルスライスの上に完全に覆われるまで加えます。サンプルを暗所で37°Cで20分間インキュベートします。
- 最初のインキュベーション後、ハイドロゲル腫瘍スライスを覆う染色液を収集し、0.7 μL/mL PicoGreenを加えます。染色液をヒドロゲルスライスにピペットで戻し、暗所で37°Cでさらに10分間インキュベートします。
- インキュベーション後、ハイドロゲルスライスを湿らせておくのに十分な染色液を残しながら、余分な培地を慎重に取り除きます。
- 共焦点顕微鏡を使用してスライスをすぐに分析します。光毒性や光退色を防ぐには、レーザー強度と励起時間を低減して、印加される光子線量を最小限に抑えます。上記の染色の励起/発光スペクトルを 表1に示します。
- ヒドロゲル中の細胞の細胞分布の概要を取得するには、Z切片をキャプチャします。イメージング中に z 切片が撮影された場合は、適切なソフトウェアを使用してヒドロゲル腫瘍スライスの 3D 再構成を生成します。これらの再構成により、ヒドロゲル腫瘍スライス内の細胞の空間分布と細胞状態の徹底的な分析が可能になります。
- 補足ファイル1および補足ファイル2に記載されている指示とスクリプトに従って、細胞のセグメンテーションと再構成を実行します。
結果
MCL細胞を含むヒドロゲル腫瘍スライスは、上記のプロトコルで生成されました。ヒドロゲル腫瘍スライスを3Dプリンティングして培養するためのワークフローのステップを図1Aに示します。使用された3Dプリンターは、Hinton et al.20(図1B)に記載されているように、シリンジポンプエクステンダーを追加することにより、FRESH印刷用に変更されました。最大5つのスライスを一度に印刷し(図1C)、1つのフィルターサポート(図1D)で培養しました。ヒドロゲル腫瘍スライスに栄養素を供給するために、フィルターサポートの下に培地を追加しました。各ヒドロゲル腫瘍スライスの上に培地を一滴加えて、乾燥を防ぎました。1つのフィルターサポートで培養された5つのヒドロゲル腫瘍スライスの概要を、ヒドロゲルスライスのクローズアップ画像とともに図1Eに示します。3日間の培養期間中、ヒドロゲル腫瘍スライスは安定しており、その構造を維持しました(図2A)。印刷直後、ヒドロゲル腫瘍スライスに気泡が存在しましたが、培養中に消えました(図2A)。
懸濁培養(2D)で培養したJeko-1細胞と比較して、ハイドロゲル腫瘍スライス(3D)で培養したMCL細胞株Jeko-1の生存率をトリパンブルー排除アッセイによって評価しました(図2B)。3日間の培養後、細胞の80%が生存していたのに対し、印刷前のJeko-1細胞の初期生存率は88%でした。2Dで培養したJeko-1細胞は、88%の初期生存率を維持しました。2Dと3Dで培養したJeko-1細胞の間に有意差はありませんでした。Jeko-1細胞がヒドロゲルスライスで増殖するかどうかを評価するために、ヒドロゲルスライスあたりのJeko-1細胞の平均細胞数を決定しました(図2C)。5x105 Jeko-1細胞は、印刷直後(d0)に各スライスに含まれていましたが、培養3日後、この数はほぼ2倍の9.3x105 細胞になりました。
ハイドロゲルスライスで培養したJeko-1細胞の分布と状態は、印刷直後または培養3日後に4色のライブ蛍光イメージング(図2D)によって評価されました。印刷後、Jeko-1ハイドロゲルスライスの3D再構成は、細胞の均一な分布を示しました。細胞の大部分は、ミトコンドリア膜電位のマーカーであるTMRMに対して陽性でした22。少数の細胞は、アポトーシス誘導のマーカーであるカスパーゼ-3活性23、および死細胞マーカーPicoGreen21に対して陽性でした。培養3日後、細胞クラスターの形成とともに細胞数の増加が観察されました。ほとんどの細胞はTMRM陽性のままでしたが、Caspase-3活性またはPicoGreenが陽性に染色された細胞はごくわずかでした(図2C)。
ハイドロゲルスライス中のMCL細胞が化学療法に反応するかどうかを分析するために、懸濁培養(2D)またはハイドロゲルスライス(3D)のいずれかで培養されたJeko-1細胞を、MCL患者の標準治療の一部である化学療法薬ドキソルビシンで処理しました24。ヒドロゲルスライスの全体的な構造は、ドキソルビシン処理中も維持されました(図3A)。ヒドロゲルスライスで培養したJeko-1細胞の生存率は、ドキソルビシン処理に応答して用量依存的に低下しました。Jeko-1細胞におけるドキソルビシンのIC50は、2D懸濁培養(IC50=2.0μM; 図3B)。4色のライブ蛍光イメージングでは、ドキソルビシン処理に応答してヒドロゲルスライスで培養されたJeko-1細胞においてTMRMの減少とPicoGreenシグナルの増加が示され、治療による生存率の低下が確認されました。4色のライブ蛍光イメージングから得られた画像を3D再構成し、DRAQ5核シグナルに基づいてセグメント化し、補足ファイル1に記載されているPythonスクリプトを使用して分析しました。例示的なセグメンテーションマスクを補足図1に示します。DRAQ5シグナルから同定された細胞数を使用して、総細胞数を決定しました。TMRM、PicoGreen、およびCaspase-3活性が陽性の細胞数を使用して、それぞれ生存細胞、死細胞、またはアポトーシス細胞の割合を特定しました。9 μMドキソルビシンの有無にかかわらず、ヒドロゲルスライス中で3日間培養したJeko-1細胞の4色生蛍光染色の定量は、トリパンブルー排除アッセイと同等の生存率を示しました(表2)。
確立されたMCL細胞株に加えて、3つの異なるMCL患者の初代MCL細胞を2D懸濁培養または3Dヒドロゲルスライスのいずれかで培養しました(図4、補足図2)。病理学者によって検証されたように、3 つの MCL (患者 1-3) はすべて、Ki67 指数が 20%-50% の古典的/一般的な形態でした。初代MCL細胞には、MCL患者のリンパ節から単離されたすべての細胞型が含まれていたため、MCL細胞だけでなく、他の種類の免疫細胞または間質細胞も含まれていました。一次 MCL ヒドロゲル スライスの生存率は、トリパン ブルー排除アッセイによって評価されました。培養4日後、ヒドロゲルスライス中の初代MCL細胞は、印刷前のベースライン生存率71.0%と比較して、43.6%(3日目に45.7%)の生存率を維持しました(図4A)。これは、懸濁液(2D)で培養された細胞と比較して生存率が向上したことを表しており、4日間の培養後の生存率は19.6%(3日目は28.4%)でした。この生存率は、ほとんどの細胞がTMRM陽性で生存可能である一方、亜集団はカスパーゼ-3活性とPicoGreenが陽性であり、それぞれアポトーシスと細胞死を示した4色のライブ蛍光イメージングによって視覚化されました(図4B)。図4Bの定量データを表2に示します。さらに2人のMCL患者からの初代細胞は、それぞれの2D懸濁培養と比較して、ヒドロゲルスライス(3D)で培養した場合に細胞の生存率が増加したことを示しました(補足図1)。
図1:ヒドロゲル腫瘍スライスの 3Dプリンティングのワークフロー。(A)ヒドロゲル腫瘍スライスにおける細胞の3Dプリンティングと培養のワークフロー。(B)ゼラチンサポートバスでのヒドロゲルスライスの3Dバイオプリンティングに使用されるプリンターセットアップ。(C) 3Dプリンターソフトウェアで設計図を印刷する。一度に最大5つのハイドロゲルスライスを印刷しました。(D)ヒドロゲルスライス培養の概略図。ヒドロゲルスライスを6ウェルプレートのフィルターサポート上で培養しました。水分を維持するために、各ヒドロゲルスライスの上に培地を一滴加えました。1つのフィルターサポートで最大5つのヒドロゲルスライスを培養できます。(E)オーバービュー画像またはクローズアップ画像で示すように、フィルターサポート上で培養された3Dプリントされたヒドロゲルスライス。スケールバーは、示されているように5mm、1mm、または200μmを表します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:3Dプリントされたヒドロゲルスライス での マントル細胞リンパ腫(MCL)細胞株の培養。(A)印刷後(d0)または培養3日後(d3)にMCL細胞株Jeko-1を含む代表的なヒドロゲルスライスのクローズアップ。スケールバーは1mmを表します。(B)トリパンブルー排除アッセイによって評価された、懸濁液(2D)またはヒドロゲルスライス(3D)で2日間培養されたJeko-1細胞の生存率。3つの独立したバイオプリンティング実験の平均±SDが示されています。(C)印刷直後(d0)または最大3日間の培養後(d1-d3)に各ヒドロゲルスライスに含まれるJeko-1細胞数。3つの独立したバイオプリンティング実験の平均±SDが示されています。統計的に有意な差は観察されませんでした (n.s.、p > 0.05、マンホイットニー検定)。(D) 印刷日 (d0) または培養 3 日後 (d3) の Jeko-1 ヒドロゲル スライスの 3 次元再構成。このモデルは、4色のライブ3D蛍光イメージングのzスタックから生成されました。生細胞は赤(TMRM)、アポトーシス細胞は黄色(Caspase-3酵素活性)、死細胞は緑(PicoGreen)、核は青(DRAQ5)で示されています。スケールバーは50μmを表します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ヒドロゲルスライスにおけるマントル細胞リンパ腫(MCL)細胞株の薬物治療。(A)3 μMドキソルビシンで3日間処理したMCL細胞株Jeko-1を含む代表的なヒドロゲルスライスのクローズアップ(d3)。スケールバーは1mmを表します。(B)懸濁液(2D)またはヒドロゲルスライス(3D)で培養したJeko-1細胞を、化学療法剤ドキソルビシンの濃度を上げて2日間処理しました。細胞の生存率は、トリパンブルー排除アッセイによって評価されました。4つの独立したバイオプリンティング実験の平均±SDが示されています。(C)9μMドキソルビシン(Doxo)で3日間処理したJeko-1ヒドロゲルスライスの3次元再構成(d3)。このモデルは、4色のライブ3D蛍光イメージングのzスタックから生成されました。生細胞は赤(TMRM)、アポトーシス細胞は黄色(Caspase-3酵素活性)、死細胞は緑(PicoGreen)、核は青(DRAQ5)で示されています。スケールバーは50μmを表します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:3Dプリントされたヒドロゲルスライスでの初代MCL細胞の培養。 (A)トリパンブルー排除アッセイによって評価される、懸濁液(2D)またはヒドロゲルスライス(3D)で最大4日間培養された初代MCL細胞の生存率。1つの実験の平均実行率が示されています。(B)ハイドロゲルスライス(3D)で3日間培養した初代MCL細胞の3次元再構成。Zスタックは、4色のライブ染色で染色されたヒドロゲルスライスから生成され、共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)を使用して分析されました。生細胞は赤(TMRM)、アポトーシス細胞は黄色(Caspase-3酵素活性)、死細胞は緑(PicoGreen)、核は青(DRAQ5)で示されています。スケールバーは50μmを表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 汚す | TMRMの | ドラキュ5 | NucView405 Caspase-3 基質 | ピコグリーン |
| 励起/発光 | 548 nm/574 nm | 647 nm/681 nm | 429 nm/469 nm | 488 nm/520 nm |
表1:4色のライブ3D蛍光イメージングに使用される染色剤の励起/発光の最大値。
| 見本 | セルの割合 | ||
| TMRM(生細胞) | PicoGreen(死んだ細胞) | カスパーゼ-3(アポトーシス細胞) | |
| Jeko-1 Ctrl | 83 | 23.6 | 18.3 |
| Jeko-1 ドキソ 9 μM | 27.6 | 81.3 | 86.6 |
| 原発性 MCL 患者 1 | 75.2 | 31.1 | 33.1 |
表2:培養されたヒドロゲル腫瘍スライスの4色ライブ染色の3D再構成の定量化。 ヒドロゲル腫瘍スライスを 3 日間培養し、9 μM ドキソルビシンまたは初代 MCL 細胞による処理の有無にかかわらず培養した Jeko-1 細胞のいずれかを含みました (患者 1)。
補足図1: 4色ライブ染色の3D再構成からの細胞同定。 (A)4色のライブ染色と(B)Pythonイメージング解析パイプラインを使用して生成されたこのチャネル上のセグメント化された画像から得られたDRAQ5で標識された共焦点画像の3D再構成。スケールバーは200μmを表します。この図をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足 Figure 2: ヒドロゲル腫瘍スライスにおける患者 2 および 3 の初代 MCL 細胞の培養 。 (A) 患者 2 または (B) 患者 3 の初代 MCL 細胞の生存率を懸濁液 (2D) またはヒドロゲル スライス (3D) で最大 4 日間培養した トリパンブルー排除アッセイによって評価される。1つの実験の平均実行率が示されています。 この図をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1: 4色ライブ染色から得られた3D再構成の分析手順。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル2:4色のライブ染色から得られた3D再構成を解析するためのPythonスクリプト。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足コーディング File 1: Stl. ヒドロゲル腫瘍スライスの設計図を含むファイル。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
ディスカッション
このプロトコルに記載されているヒドロゲル腫瘍スライスは、リンパ節構造を模倣するMCLモデルを提供し、バイオプリンティングによって生成された3D腫瘍微小環境におけるMCL細胞の生存と薬物反応の研究を可能にします。
最も広く使用されているバイオプリンティング方法は、バイオインクがディスペンシングシステムから排出される押出に基づいています。たとえば、インクジェット印刷では、バイオインクは蒸着後に急速に架橋され、3D構造が形成されます25。ただし、このアプローチには、特に使用される材料の粘度と層を積み重ねる能力の点で制限があります。対照的に、このプロトコルで使用されるFRESHバイオプリンティングなどの埋め込みシリンジベースの押出3Dバイオプリンティングは、ゲルインゲルアプローチを適用します。これにより、コラーゲンのような低粘度のバイオインクを安定した構築物に印刷することができ、複雑な腫瘍微小環境を模倣することが可能になります20,26。バイオプリンティング用に特別に開発された 3D プリンターは高価になる可能性がありますが、ここで紹介する方法は、よりアクセスしやすいエントリー ポイントを提供します。比較的簡単な変更で標準的な押出プリンターに適合させることができます。これらの変更は、手頃な価格のフィラメントで3Dプリントすることができ、デザインは、たとえばHintonらによってオープンソースリソースとして入手できます20。ただし、FRESHバイオプリンティング用のヒドロゲルサポートバスの調製は温度に非常に敏感であり、スラリーの調製中に細心の注意が必要であることに注意することが重要です。
多くの場合、3Dプリントされた腫瘍モデルは、in vivo酸素勾配を欠く浮遊システム25、またはマイクロ流体チップ培養27で培養され、これらは高度な複雑さを捉えるが、スループットが低く、高いメンテナンスを必要とする。これらのハードルは、ここで説明するヒドロゲル腫瘍スライスで克服できます。気液界面上に最大5つのヒドロゲル腫瘍スライスを培養するセットアップは、固形腫瘍28の精密にカットされた腫瘍スライスの培養に由来する。このプロトコルで使用されるフィルター支持体の膜は、0.4μmの孔径を持つポリテトラフルオロエチレン(PFTE)膜で構成されており、栄養素交換を可能にするが、細胞の付着または細胞遊走を妨げる29。PTFE 膜上の培養物は、スライスの安定性を維持し、破裂や崩壊を防ぐためにスライスを物理的にサポートします。さらに、それらは空気と液体の界面を提供し、主に上の空気から酸素を供給し、フィルター30の下の媒体から栄養素を供給する。したがって、このシステムは、生体内で発生する可能性のある栄養供給、細胞増殖、および酸素化の時空間的変動を組み込んでいます25。フィルター支持体のヒドロゲル腫瘍スライスで培養した初代MCL細胞は、40日間40%以上の生存率を維持し、これは2D懸濁培養で観察された生存率よりも優れていました(図3A、補足図2)。原発性B細胞リンパ腫腫瘍のスフェロイドおよびオルガノイドで記載されているように、サイトカインの追加またはCD40L発現線維芽細胞との共培養によって生存率の延長が達成できるかどうかに対処する必要があります6,19,30または初代MCL細胞とCD40L発現線維芽細胞との共培養14.このようなアプローチをヒドロゲル腫瘍スライスに組み込むことは、初代MCL細胞の培養と天然微小環境との類似性を強化するために検討されるべきである。
リンパ節には、細胞外マトリックス線維のよく発達したネットワークが含まれています。そのパターンから、網状繊維として知られています。主に、これらの繊維は、コラーゲンおよび基底膜特異的成分31,32,33で構成されている。リンパ節の in vivo 状況に似たマトリックスを生成するために、ヒドロゲル腫瘍スライスの生成に使用されるバイオインクは、コラーゲン I 型と、4 つの主要な基底膜 ECM タンパク質であるラミニン、コラーゲン IV、エンタクチン、およびペルレカン34 で構成されるマトリゲルで構成されています。さらに、アルギン酸塩をバイオインクに添加してヒドロゲル腫瘍スライスを安定させ、長時間の培養とへらを使用したある血管から別の血管への輸送を可能にします。コラーゲンとアルギン酸を含むさまざまなヒドロゲルをテストしたところ、0.5% のアルギン酸と 20% のコラーゲンを含むバイオインクを使用した場合、安定した耐久性のあるヒドロゲル スライスと組み合わせて最高の細胞生存率が示されました (データは示していません)。成分に加えて、0.8 cm のヒドロゲル腫瘍スライス直径は、1 cm35 の平均リンパ節直径にさらに似ています。ヒドロゲル腫瘍スライスのライブ3Dイメージングは、さらに細胞の均一な分布を示しました(図2C)。
ここでは、ハイドロゲルスライスを薬物で処理する能力は、高齢のMCL患者サブグループに対する標準治療であるR-CHOP療法(リツキシマブ、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニゾン)の一部であるドキソルビシンによる治療によって示されました24。2D培養と比較して、治療効果に対する腫瘍微小環境の影響をヒドロゲル腫瘍スライスで研究できます。 図3に示すように、ヒドロゲルスライスで培養したJeko-1細胞は、2D培養細胞よりもドキソルビシン処理に対して耐性が強かった。これは、細胞外マトリックスが腫瘍の硬さ36、細胞間コミュニケーション37、および薬物送達38を調節することにより、薬物応答に影響を与え、薬剤耐性を頻繁に増強する可能性があるという観察結果と一致しています。さらに、フローサイトメトリー分析、および免疫組織化学的または多重免疫蛍光染色により、ヒドロゲル腫瘍スライス中の単一細胞の治療反応についてより深い洞察を得ることができます。
結論として、このプロトコルは、天然の三次元リンパ節構造を模倣する3Dリンパ節モデルを表すヒドロゲル腫瘍スライスの生成と培養を記述する。MCL細胞から他の原発性リンパ腫の適応症に応用を拡大する可能性を秘めています。
開示事項
この研究は、ロバート・ボッシュ財団とバーデン・ヴュルテンベルク州科学研究芸術省(3R-Network BW)の支援を受けました。
謝辞
Kerstin Willecke氏の優れた技術支援と、3D画像解析に関する貴重な支援をしてくれたYang Zhang氏に感謝します。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| &-slide 8ウェルガラス底 | イビディGmbH | 80827 | ハイドロゲルスライスのライブイメージングに使用されるガラス底スライド |
| 10 倍の PBS | カール・ロスGmbH + Co.KG | 9150.1 | バイオインク成分 |
| 10X RPMI-1640 ミディアム | シグマ・アルドリッチ | R1145 | バイオインク成分 |
| 2.5ml気密シリンジモデル1002 TLL | ハミルトン | 81420 | バイオプリンティング用シリンジ |
| 3D押出プリンタ、PrintrBot Simple | プリントロボット | バイオインクの印刷を可能にする自己修正 | |
| 6ウェルプレート | Th. Geyer GmbH &Co.KG | 7696790 | ハイドロゲルスライスの培養 |
| ボトルトップ真空ろ過システム、PESメンブレン、500 ml、0.22 &m細孔径、70 mm径メンブレン | コーニング株式会社 | 513-3355 | バッファーの無菌ろ過 |
| 塩化カルシウム脱水物 | カール・ロスGmbH + Co.KG | T885.2 | 洗浄バッファーとゼラチンスラリーの成分 |
| ラット由来のコラーゲンI | コーニング株式会社 | CLS354249 | バイオインク成分 |
| Cura バージョン 15.04.5 3D プリンティング用ソフトウェア | アルティメーカー | 3Dプリントに使用するソフトウェア | |
| ドラキュ5 | バイオステータス株式会社 | DR50050 | ハイドロゲルスライスのライブイメージング用染色 |
| エチレンジアミン四酢酸(EDTA)二ナトリウム塩二水和物 | シグマ・アルドリッチ | E5134 | アルギン酸溶解緩衝液の成分 |
| EVE自動セルカウンター | ナノエンテック株式会社 | 10027-452 | セルカウンター |
| Falcon Bacteriological Petri皿 蓋付き、直径35 mm | 隼 | 351008 | ゼラチンスラリーを充填し、バイオプリンティング用サポートバスを形成します |
| ファルコンチューブ、50mL | サルシュテットAG&サルシュテットAGCo.KG | 62.547.254 | |
| 子牛胎児血清 | シグマ・アルドリッチ | S0615 | 細胞培養培地サプリメント |
| ブタの皮からのゼラチン | シグマ・アルドリッチ | G1890 | ゼラチンスラリーの主成分 |
| HEPES、遊離酸、分子生物学グレード | メルクKGaA | CAS 7365-45-9 | 洗浄バッファーとゼラチンスラリーの成分 |
| Jeko-1 MCL細胞株 | ATCCの | CRL-3006 | MCL細胞株 |
| KIMTECH Science Precisionワイプ | キンバリー・クラーク・コーポレーション | 7551 | ゼラチンスラリーから余分な水分を吸い込み、3Dプリンターのノズルから液滴を除去するために使用されます |
| LAS X ソフトウェア バージョン 3.5.7.23225 | ライカ | 3D再構成に使用するソフトウェア | |
| ライカ TCS SP8 共焦点レーザー走査型顕微鏡 | ライカ | TCS SP8 | ライブイメージング用共焦点顕微鏡 |
| メイソンジャーレギュラーパイント16オンス | ボール株式会社 | G001 | ゼラチンスラリーを調製する瓶 |
| マトリゲル成長因子還元(GFR)基底膜マトリックス | コーニング株式会社 | 356231 | バイオインク成分 |
| ミリセル細胞培養インサート、0.4 & micro;M 細孔サイズ | メルクKGaA | ピクモルグ50 | ハイドロゲルスライスのフィルターサポート |
| NucView 405 Caspase-3 基質、1 mM PBS 1 個 | バイオティウム | 10405 | ハイドロゲルスライスのライブイメージング用染色 |
| Oster プロフェッショナルシリーズブレンダー | オスター | BPST02-B00 | ゼラチンスラリーを生成するブレンダー |
| ペニシリン/ストレプタマイシン | ギブコ | 15140163 | MCL細胞培地用サプリメント |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay-Kits und dsDNA-Reagenzien | インビトロゲン | P7589 | ハイドロゲルスライスのライブイメージング用染色 |
| ロティーナ 35 R | ヘティヒ | 24573 | 細胞の遠心分離 |
| ROTINA 38/38R遠心分離機 | ヘティヒ | Z720109 | ゼラチンスラリーの遠心分離 |
| RPMI-1640+グルタマックス | ギブコ | 61870036 | MCL細胞用培地のベース |
| アルギン酸ナトリウム | FMC協力 | GQ9109901 | バイオインク成分 |
| 塩化ナトリウム | メルクKGaA | 1.06404 | アルギン酸溶解緩衝液の成分 |
| クエン酸ナトリウム | カール・ロスGmbH + Co.KG | 3580.1 | アルギン酸溶解緩衝液の成分 |
| ステリカン鈍的適用カニューレ 21G 0.8x22 mm | B.ブラウン | 9180109 | 3Dプリント用ノズル |
| テトラメチルローダミン-メチルエステル-過塩素酸塩(TMRM) | シグマ・アルドリッチ | T5428 | ハイドロゲルスライスのライブイメージング用染色 |
| トリパンブルー、0.4% | シグマ・アルドリッチ | T8154 | 生存率分析のための染色 |
| 防水温度計 | VWRの | 620-2099 | ゼラチンスラリーの温度を監視する温度計 |
参考文献
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