病変マウス網膜におけるミクログリアの動態およびシナプスとの相互作用のライブイメージングおよび特徴付け

Summary

本論文は、スピニングディスク共焦点顕微鏡を用いて網膜におけるミクリアの運動性とシナプス後点との接触を可視化・定量化する方法を示します。

Abstract

ミクログリアは中枢神経系(CNS)の常駐マクロファージで、組織の感染や損傷に反応します。炎症における役割に加え、ミクログリアはシナプス剪定を通じて回路の精細化において発達的な役割を果たします。しかし、神経炎症や神経変性におけるシナプス剪定のメカニズムは依然として不明です。本プロトコルでは、マウス網膜エクスプラントモデルを用いて、ミクログリアの動態を生 体外で研究します。ミクログリアの運動性とシナプス後タンパク質との相互作用を調べるために、AAV-PSD95-RFPでシナプスを標識し、スピニングディスク共焦点顕微鏡を用いてシナプス後タンパク質と共局する運動性ミクログリアのタイムラプス動画を記録します。その後、画像解析ソフトウェアを用いてミクログリアおよびPSD95の表面およびスポット再構築を作成します。これらの表面から、ミクログリアの置換の長さ、プロセス速度、シナプス後脈点との接触などのデータを抽出し、恒常性状態および神経損傷後のミクログリアの挙動を理解することができます。このプロトコルは、網膜神経変性疾患におけるシナプス剪定におけるミクログリアの役割を調べる際に有用です。

Introduction

回路機能と恒常性は、高度に制御されたシナプスの発火やさまざまな細胞型間の独自の相互作用に依存しています^。中枢神経系(CNS)の常駐マクロファージとして機能するミクログリアは、網膜内の非神経細胞集団であり、シナプス剪定に独自の役割を果たします。中枢神経系の発達中、ミクログリアは機能しないまたは弱いシナプスを剪定し、神経回路を精細化させます^。発達中の脳のミクログリアは環境を調査し、重要な時期には神経保護の役割に備えます。³.視覚系の発達において、ミクログリアは皮質ニューロンおよびインターニューロンの発生における重要な調節因子であり、シナプス再構築の重要な期間に形態学的変化を示す^4.同様に、発達中の網膜では、ミクログリアがアポトーシーズ細胞を除去し、新たなシナプス結合の場を作ることが確認されており、これらのクリアイベント中に恒常性マーカーP2Ry12のアップレギュレーションによって確認されています⁵。しかし、最近の研究では、ミクログリアが発達中の^視覚系の神経回路の精緻化に決定的な役割を果たすとは限らない可能性が示されており、ミクログリアが視覚回路の発達に果たす役割については議論があることが浮き彫りになっています。

損傷の文脈では、ミクログリアは形態を活性化状態に変化させ、神経変性の役割を果たすことがあります。例えば、アルツハイマー病モデルにおけるミクログリアは、アミロイドβプラー^ク7やSPHやPSD958などのシナプスマーカーの飲み込み増加を示し^ました。網膜神経変性において、多くの研究グループはシナプス物質が包み込まれたミクログリアを発見しましたが、9^{、10、11、12、13}の完全なシナプスの能動的な吸収の明確な証拠はありません。例えば、Heらは網膜色素変性症9のモデルにおいて、ミクログリアがシナプス物質の被包み数と体積の増加を発見^{しましたが、}完全なシナプスの食いが起きたのか、破片の除去が起きたのかは明確ではありません。さらに、「安静時対活性化時」や「M1対M2」といった従来のミクログリア分類は、現代の知見を踏まえると過度に単純化されており、ますます不正確になっています。ミクログリアは離散的なカテゴリーではなく、状態の勾配で存在^します。したがって、Paolicelliらは、旧来の二項分類から、より微妙で厳密に定義されたミクログリア状態の命名法への転換を求め、ミクログリアの形態と活性をよりよく理解し定義することを提案しました^。したがって、生体外および生体内でのミクログリア機能を評価する戦略は、発生および疾患の文脈におけるミクログリアの状態と活性の識別能力を高めるでしょう。

ミクログリア機能をエクスビブおよびインビブで研究する戦略は存在しますが、エクスビブライブイメージングにはいくつかの利点があります。まず、角膜の明瞭さや白内障の発達は網膜画像診断を妨げず、微細な突起やシナプス脈点の明確な可視化を可能にします。さらに、in vivo画像はセットアップにより多くの技術的なスキルを必要とするため、生体外準備はより高いスループットのセットアップとなり、1回の実験でより多くの動物を画像化できます。生体内イメージングが理論上の利点をもたらす可能性があるにもかかわらず、縦^{方向画像のために}ミクログリア突起の運動性を捉えるには高レーザー出力(100^〜230μW)^{が必要です。}しかし、低レーザー出力と十分なイメージング媒体を用いたミクログリアの体外イメージングは、適切な準備を用いて生体内イメージングと同等の画像品質を提供できますが、組織はもはやその場に置かれていません。

私たちは、一時的な眼圧(IOP)上昇¹⁰後にミクログリアの数、複雑さ、プロセスの動きが増加することを示しました。固定組織では、このミクログリオシスがシナプスタンパク質との共局所化を増加させます¹⁰。これまでの研究では、マウスレーザー誘発眼高血圧モデル(LIOH)および他の神経変性モデル10,16,17,18,19,20において、網膜神経節細胞(RGC)の早期シナプス喪失と樹状突起変性が示されています。しかし、これらがシナプスの剪定に能動的な役割を果たしているのか、それとも分解されたシナプスを含む細胞残骸の除去に受動的な役割を果たすのかはまだ分かっていません。シナプス分解は神経変性の初期の特徴であるため、ミクログリアの動態とシナプス分解における役割の理解は極めて重要です ^8,10。ここでは、ライブイメージングを用いて、ミクログリアの動態とRGCs樹状突起上の興奮性シナプス後密度タンパク質-95(PSD95)との相互作用を理解します。

Protocol

動物はカリフォルニア大学サンフランシスコ校に収容され、12時間の光と12時間の暗い光サイクルで、水と標準的な食事は 自由に与えられました(特に指定がない限り)。すべての処置はカリフォルニア大学サンフランシスコ校の施設動物ケア・利用委員会によって承認されました。このプロトコルで使用される材料および機器については、材料表を参照してください。硝子体内注射から画像診断および分析までの実験手順の概要は 図1に示されています。

1. AAV-PSD95-TagRFPウイルスの生成と効率

1. PSD-95pTagRFP配列(Addgeneプラスミド#52671;RRID:Addgene_52671)を用い、GFPを除去した後、CMVプロモーターの下流に挿入します(Addgeneプラスミド#67634;リッド:Addgene_67634)。
2. ウイルスは三重形質染色HEK293Tを用いて調製し、PEG/クロロホルムで精製し、10¹² ip/mLのタイターに濃縮します(Negriniらに記載)。²¹歳。
   注:このウイルス産生方法は通常、超遠心法よりも低い抗体価を生み出しますが、これらの実験では感染細胞がまばらであることが望ま^{しいです。}これらの実験で使用されたカプシド/血清型バージョンは7m8(Addgeneプラスミド#64839;リッド:Addgene_64839)。
   1. 完全な画像診断プロトコルを進める前にAAVの効率をテストしてください。
      注意:このプロトコルを実装する読者は、個々のRGC樹状突起の識別と分離を目的とするため、RGCの標識はまばらに行うべきです。
3. トランスフェクションの成功を確認し、その後網膜を2%のPFAで固定し、1x ACSFに含めます。シナプスタンパク質については、蛍光標識のクリアな解像度を確認するために、共焦点顕微鏡で63倍のシグナルを確認してください。
   注:固定濃度が低いため、シナプスタンパク質の標識を保持するのに役立ちます。使用されるAAVがシナプス成分でない場合、読者は代わりに4%のPFAを使用することを選択できます。

2. マウス飼育とAAV-PSD95-TagRFP硝子体内注射

1. 雄と雌のCD-1アルビノマウス(株022)とB6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J(株005582)を交配し、EGFP発現ミクログリアを持つCD-1アルビノマウスを作製しました。実験にオスとメスのCx3cr1ヘテロ接合マウスを使うには、最低でも4世代の逆交配を待ってください。遺伝的ドリフトを防ぐために、10世代後にCD-1背景に株を維持・更新してください。
2. 動物(P30-P60)を、誘導室で3-5%の麻酔薬を酸素に含み、流量1L/minで麻酔します。動物を立体顕微鏡に置きつつ、鼻のコーンを通してイソフルランを継続的に投与します。動物が麻酔されているか確認するために、足の指を少なくとも3回つまんで確認してください。
3. AAVを注射する前に0.5%のプロパラカインを一滴加えます。26s G 10 μL注射器を使い、両眼の上側頭辺縁部に2μLのAAV-PSD95-RFPを ゆっくり と硝体内注射します。注射部位を通るAAVの逆流を防ぐために、針をゆっくりと抜いてください。注射後は目に抗生物質軟膏を塗ってください。
4. 注意:針は硝子体腔の周囲の半分以上まで通さないようにしてください。そうすることで、針先で網膜や水晶体が損傷し、斑点状のトランスフェクションや失敗に終わることがあります。白内障の発生や出血は注射技術の誤りを示しています。
5. 注射後は、動物が意識を持っているか確認してから元のケージや収容室に戻します。動物に注射後の痛みがある場合は、腹腔内注射でブプレノルフィンを投与します。AAVの発現は3週間待ちましょう。誘導型モデルを用いて眼圧を上げる(または他の操作を行う)場合は、片目の眼圧上昇を誘導する前に3週間待つべきで、対照として反対側の目や未熟な動物の目を用いてください。

3. 安楽死と網膜平坦化

1. 人工脳脊髄液(ACSF、pH 7.4)を1xPBSで新たに1x溶液で準備し、mM単位の成分は以下の通りです:119 NaCl、2.5 KCl、1.3 MgCl₂·6H₂O、2.5 CaCl₂·2H₂O、1 NaHPO₄、11 グルコース、20 HEPES)。
2. 急性解剖使用前に溶液を少なくとも15分間酸素化してください。チューブを酸素タンクに接続し、ガスの漏れを防ぐために中央に穴の開いたキャップを取り付けます。
3. 最小限の誘導室内で少なくとも1mLのイソフルラン麻酔でマウスを安楽死させ、その後子宮頸部脱臼を行います。摘出前に角膜の鼻側にマーカーを付け、網膜の位置を実験中に追跡できるようにします。
   1. マイクロビーズ注射やレーザーで照射された眼を摘出するには、限定的な結膜腹膜切開を行い、ハサミを目の後ろに置いて視神経の基部から眼を切り離します。これにより繊細な目は無傷のまま保たれます。
4. 解剖顕微鏡を使い、23Gまたは25Gの針で角膜に小さな穴を開け、酸素を含んだACSFが眼に灌流できるようにします。この穴にハサミを差し込んで、鼻の端に受託者的な切り込みを入れます。
5. 角膜と虹彩の残りを縁部で切り取ってください。
6. 虹彩とレンズを外してください。網膜が水晶体にくっついている場合は、鉗子で分離してください。
7. 鉗子を使ってRPEと神経網膜の間を優しく切り離し、網膜と強膜を分離します。
8. 網膜を混合セルロースエステル(MCE)膜フィルターペーパーの非グリッド面に置き、明確に観察・イメージングします。
9. 網膜の他の3つの象限に小さくリラックスできる切開を入れ、最も長い切開は鼻の網膜にして網膜の位置を追跡します。
   注意:網膜は4つ葉クローバーのように見えるべきです。
10. フィルターペーパーから網膜を実験室用ワイプに移します。ACSFを1滴で網膜を湿らせ、その後ワイプでフィルターペーパーを乾かします。網膜がフィルターペーパーに密着するように、少なくとも8〜10滴の繰り返してください。
11. 網膜を酸素供給チャンバーに入れ、対側の眼を解離します。
12. 画像化の準備ができたら、ステップ3.10で言ったようにフィルターペーパーを乾かし、網膜をマテックペトリ皿に逆さに置きます。網膜を金属ビーズかリングで押さえつけてください。ACSFを3〜5滴加えます。
    注意:金属ビーズ浴やリングなどの小さな金属ビーズは、網膜の完全性を損なうことなくドリフトを防ぐのに十分なサイズと重量を持っています。
13. スチールワイヤーと伸ばしたナイロン紐を接着し、重りを加えて、固定されたピンチと平行な紐のリングを作り上げます。
    1. ワイヤーを直径1/2インチの円筒に巻きつけ、ペンチでピンと引っ張ります。シリンダーから各リングを切り取り、バイスで平らにします。
    2. リングの片面を研磨して、粗く平らな面にします。直径1〜2インチのボトルの開口部にナイロン紐を伸ばし、輪ゴムで固定します。
    3. リングをナイロン弦の上に置き、リングの内側の周囲に少量の接着剤を塗って慎重にナイロン弦に接着します。その後、コインや細い金属線などの軽い重りをリングの上に置いてリングを固定します。
    4. 乾燥後、リングの外縁からナイロン紐を精密なハサミで切ります。その結果、リングの直径を張り詰めた固定並行弦が形成されます。
    5. リング内のナイロン弦の密度が高すぎる場合は、実験のニーズに合わせてマイクロディセクションスプリングハサミで個別の弦を切断します。
       注意:解剖と取り付けのプロセスは約5分ほどで終わるはずです。組織が 生体外で平衡された生理的条件に置かれるのが速ければ早いほど、組織はより健康になります。

4. 回転円盤共焦点取得

注意:画像撮影前に5%_CO2 で加湿チャンバーを起動し、少なくとも1時間稼働させてください。システムと試料が熱平衡に達することを許すことで、ドリフトの低減に役立ちます。

1. 接眼レンズを10倍でスキャンしてミクログリアにピントを合わせます。組織をスキャンして画像化する領域を探す際は、ミクログリアチャネルを基準とし、明るいシナプス脈点が共局するミクリア(10〜20μm以内)にのみ注目してください。AAV標識は組織全体で均一ではないため、ミクログリアと点点の両方が同じ平面内に共局する領域をスキャンします。これらの条件を満たすエリアを見つけたら、ピント合わせは60倍に切り替え、 カメラ ボタンをクリックしてカメラモードに切り替えます。
   1. イメージングシステムソフトウェアを使って画面を右クリックすると、xyナビゲーションが表示されます。プレビュー画面が表示され、3×3、5×5、または最適な領域のためにカスタムサイズのスクリーンを作成することで組織をスキャンできます。連続的なフォトブリーチを防ぐために、3×3または5×5のフレームサイズと1つの参照チャンネルを使いましょう。
      注:このプロトコルでは、ミクログリアチャネルを使用しました。
2. 60倍対物レンズ(NA 1.49)を搭載した回転円盤共焦点顕微鏡で、装着した網膜を迅速に画像化してください。
3. サンプルをプレビューするには、画面を右クリックして「ライブ」を選択し、 自動調整 ボタンをクリックすると、システムが現在のLUTに基づいてビューを調整できます。レーザー設定を調整するには、まず各チャンネルを個別に選択し、必要に応じてレーザー出力と露出を調整してください。次に、フルオロフォアを右クリックして「 顕微鏡に設定を割り当て 」とカスタム設定を保存してください。別のチャンネルに切り替えてもソフトウェアが保存しません。
   1. 次のチャンネルに切り替えて必要に応じて調整します。フルオロフォアを右クリックして設定を保存します。同じフレーム内の複数のチャンネルを取得する場合は、各チャンネルを個別にプレビューした後に同じ値を入力してください。フルオロフォアを右クリックして設定を保存してください。
   2. マルチチャンネル取得の場合は、 ラムダ タブで関心のあるチャンネルを選択してください。ライブイメージングでは、すべてのチャンネルを1つのチャンネルにまとめて、対象セルからの微細な動きを高速に捉え、各チャンネルを同時に取得できるようにします。これによりセルの速度によってタイムラプスに遅延が生じることがあります。
4. 希望の時間のタイムラプスを入手しましょう。
   1. 左下の タイム タブで、20秒間隔のタイムラプスを5〜10分のタイムラプスで入力します。
   2. 右側の取得設定タブで、画像解像度を608 x 832、ピクセルサイズ0.12 μmに設定します。
   3. 0.3μmのステップサイズで10〜20μmの画像を収集し、z軸に沿った微細なミクログリア突起とシナプス脈点の許容範囲の解像度を確保します。セルトラッキングを成功させるために、フレーム間の時間間隔を20〜30秒に保ちましょう。
      注意:組織 の体外の脆弱性のため、まず実験網膜を撮影し、1時間以内に撮影することが推奨されます。これは、第一網膜を撮像する際に酸素入りチャンバーに置くべき対側コントロール眼の状態を正規化するためです。
5. このプロトコルを使って網膜の表層を画像化します。20μmを超えるタイムラプスを取得することで、20秒間隔の間に微細なプロセスの動きを捉えるのが難しくなります。したがって、20μmスタック内に収まるミクログリアのみを画像化します。

5. 追跡分析とデータエクスポート

1. ミクログリアの表面レンダリング
   1. タイムラプスファイルをファイル変換ソフトを使ってIMS形式に変換してください。ステップ4.2で取得した画像の特性に基づく以下のボクセルサイズを入力します:x = 0.1272423 ミクロン、y = 0.1272423 ミクロン、z = 0.3 ミクロン。
   2. リリース後、分析ソフトウェアはArenaで開始されます。 Observe フォルダをクリックすると、以前に変換されたファイルを開いてください。画像が 3Dビューであることを確認しましょう。
   3. 個々のマイクログリア全体を検出するには、オブジェクトツールバーの青い表面アイコンをクリックしてください。アルゴリズム設定の最後の3つのオプションを選択してください:Track Surfaces(時間経過)、Classify Surfaces、Object-Object統計。青い再生ボタンをクリックして次のステップに進みます。
      1. 複数のミクログリアがある場合は、1つの表面オブジェクト内に個々のミクログリアが存在することを確認するために、関心領域のみ(ROI)を選択してください。x、y、zのパラメータをそれぞれ設定し、対象となる個々のミクログリアの表面だけを作成します。
   4. サーフェスレンダリングを作成するチャンネルを選択してください。必要に応じて、表面作成を滑らかにするために 「Smooth 」を選択し、画像のボクセルサイズに対して 1:1 - 1.25の比率 を使います。例えば、画像の ボクセルサイズが0.12 x 0.12 x 0.3 μmの場合、 表面の詳細 を 0.15 - 0.16 μmに設定します。 閾値設定では、 Machine Learning Segmentation を選択して、ソフトウェアが関心のあるセルを検出する学習をします。
      注:次のステップは、機械学習セグメンテーションを通じてトレーニングデータをImaris AIに入力することです。
   5. トレーニングデータでは、背景(背景検出)と前景(サンプルの真 信号検出)の2つのペイントブラシツールを観察します。希望するペイントブラシを選択してShift+左クリックで筆のストロークを描きます。設定から「補間表示」を選択してください。「Train」と「Predict」を選択して、ペイントブラシのストロークからトレーニングデータを入力してください。
      注意:6回以上のストロークを与えると、AIの処理時間が長くなり、セルの捕捉が不正確になります。
      1. 中央の 黄色いポインター を使ってZスタックを移動します。x、y、zの平面に複数の筆で描き、タイムラプスのいくつかの(すべてではありませんが)時間枠内で描いてください。1回のエントリーにつき3〜5回の短い筆描きをしてください。AIは少しずつ情報を得るのが一番効果的です。このステップを各エントリごとに繰り返し調整し、セルの正確な表面が作成されます。
      2. 最終チェックとして、トレーニングディスプレイと実際に作成された表面を切り替えるために 黄色い長方 形を選択してください。また、タイムラプス全体で、表面がセルを正確に表しているかも確認してください。
   6. 正確な表面レンダリングが得られたら、次のステップに進みましょう。分割オブジェクトの選択を解除してください。
   7. ヒストグラム内のボクセル数を調整してください。閾値を移動させて、メインの表面に接続されていない小さなオブジェクトを除去します。
      注意:このステップは、背景ノイズによってできた小さな不要な表面を除去するために使われます。目的は、対象の主細胞体に接続されていない表面を除去することです。
   8. 次に、必要に応じてサーフェスを編集します。メインサーフェスやカットエッジ以外のオブジェクトは必要に応じてハサミツールで手動でクリアしてください。
   9. 希望すれば、オブジェクトに関連付けられる隙間の閾値を設定できます。移動セルのトラッキングアルゴリズムを選択します。
      注:自己回帰モーションはセルトラッキングで最も一般的に使われるツールで、タイムラプス全体を通して連続した動きを追跡します。
      1. 最大距離と最大ギャップサイズは、表面が逸脱しうる重要な点を設定するユーザー定義の数値です。 最大ギャップ距離 を 0.96μm 、 最大ギャップサイズ を 3 (デフォルト設定)に設定します。
   10. ステップ5.1.7で表面オブジェクトをフィルタリングしたのと同様に、メインの表面に紐づいていないトラックをフィルタリングします。これもヒストグラムによって調整されます。フィルター調整から5時間以内の小さなスポットトラックが削除されるタイミングで、閾値を設定する場所を定義します。
   11. 次に、必要に応じて分類を設定しましょう。例えば、変位長を 0〜1μm から 1+μm の範囲で分類し、小さなプロセスの移動から大きくなるプロセスやセルの変位を判別します。
   12. 最後に、前の段階の分類を使って特定のイベントに適切なラベルを付けます。
       注:このステップは、シナプス後信号のスポットが生成された後に最適に活用されます。
2. PSD95のスポット分類
   1. 個々のマイクログリア全体を検出するには、オブジェクトツールバーの青い表面アイコンをクリックしてください。アルゴリズム設定の最後の3つのオプションを選択してください:Track Surfaces(時間経過)、Classify Surfaces、Object-Object統計。青い再生ボタンをクリックして次のステップに進みます。
   2. シナプスマーカーの ソースチャネル を選択します。スライサーや他のチャンネルをオフにしてPSD95だけを表示してください。 ctrl ボタンと ポインター選択ツール を使って、句点のxy直径を推定してください。
      1. タイムラプス全体を通して持続する明るい点をいくつか選びましょう(サイズは 0.6μm から 1.2μmの範囲)。
      2. 背景の減算をオフにしてください。画像に背景減算が必要な場合は、タイムラプス処理の前に画像処理の背景減算ツールを使用してください。
   3. 次にスポット品質に基づくフィルターを追加します。タイムラプス全体を通してPSD95の句点が正確に記録されるようにヒストグラムをドラッグします。
      注:品質はスポット⁹の中心の強度に基づいています。このフィルターは、ボクセルフィルターや直径フィルターの数と比較して、PSD95の実際の信号を最も正確に捉えます。
   4. 次に、編集ステップでノイズで生成されたスポットを削除します。キューブカーソルとサークルカーソルの間を切り替えると、ノイズのために1〜2時間しか現れない単一の点または複数の点を除去できます。
   5. 希望すれば、オブジェクトに関連付けられる隙間の閾値を設定できます。シナプスマーカーに適した追跡アルゴリズムを選択します。
      1. 最大距離と最大隙間サイズは、スポットが逸脱しうる重要なポイントを設定するユーザー定義の数値です。 最大ギャップ距離 を 14.6μm 、 最大ギャップサイズ を 3 (デフォルト設定)に設定します。
   6. ステップ5.2.3でスポットオブジェクトをフィルタリングしたのと同様に、異なる句点に関連付けられていないトラックをフィルターします。これもヒストグラムによって調整されます。閾値を設定する場所を定義するには、小さなオブジェクトトラックがどこから外されるかを確認します。
   7. 必要に応じて分類を設定してください。例えば、最短距離(Shorts Distance)を用いて、被覆、接触、未接触の点を区別します。表面内0 μm<任意のポイントのように取り込まれ、表面から0〜0.5 μmの距離で接触、または0.5+ μmから接触しない位置で設定します。
   8. 最後に、前の段階の分類を使って特定のイベントに適切なラベルを付けます。
3. 表面やスポットが関心のあるミクログリアと点を正確に表したら、 各 オブジェクトの統計タブからすべての統計値をエクスポートします。詳細な統計を抽出し、変 位長、速度 、 接触事象を分類してください。
   1. 面積、体積、変位長、速度など多くの統計はイマリスから出力されます。表面変位の長さと速度をエクスポートして、実験中のミクログリア動態を定義します。
      1. 変位長を表面の初期位置と最終位置の間の距離(μm²²)と定義します。
      2. 速度とは、表面が次の時間区間に瞬時に移動する速度であり、μm/s²²で測定したものと定義します。
         注:接触イベントとは、著者らによってシナプス後脈点が完全な形で、個々のミクログリア間で少なくとも5回の一定期間にわたって0μmの距離を共有する現象を指します。

Results

CX3CR1-GFPのマウス網膜からミクログリアを画像化した。マウスのAAV-PSD95-RFP注射時のP30からP60の範囲で、AAV発現が認められるまでに少なくとも21日経過していました。マイクログリアの代表的な画像と、解析前後のPSD95点との相互作用は図2に示されています。微膠細胞活性化を誘導するために、マウスレーザー誘発眼圧高血圧(LIOH)モデルを用いました。このモデルは一時的に眼内圧(IOP)10,16,17,1 ^8,19,20

Discussion

このプロトコルにより、RGCの樹状突起に沿ったシナプス後部位との個々のミクログリア相互作用の可視化と追跡が可能になります。緑内障のような神経変性疾患では、ミクログリアは網膜の内側の神経質層(IPL)におけるシナプスと共局します。シナプス分解におけるミクログリアの役割は十分に理解されていません。しかし、ミクログリアはシナプスを異常に包み込む、アポトース細胞の残骸を受動的に除去する、あるいはこれらのメカニズムの組み合わせなど、いくつかの潜在的なメカニズムを通じて寄与する可能性があります。

このプロトコルは、発生状態や疾患状態におけるミクログリアの挙動を特徴づける強力なツールとなり得ます。前述の実験プロトコルを用いて、病変マウス網膜におけるミクログリアの動態とシナプス構造との相互作用を成功裏に画像化しました。レーザー条件下では、対照群と比較してミクログリア突起の置換の長さと速度が増加することが観察されました。さらに、ミクログリアとシナプス後タンパク質PSD95との接触増加も観察されました。固定網膜での最近の発見は、興...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
25ゲージ針	アルコン	8065420920
26sゲージ10およびマイクロ;Lシリンジ	ハミルトン	701RNWG
7m8	アッドジーネ	64839	http://n2t.net/addgene:64839
ベンド&ステイ多目的304ステンレススチールワイヤー	スタンフォード先端材料	SS3368	リングを作るための鋼線
塩化カルシウムヘキサハイドレート	シグマ・オルドリッチ	C5080-500G
解剖顕微鏡	アンスコープ		網膜の剥離とマウント
解剖用ハサミ	FST	15024-10
D-(+)-グルコース	シグマ・オルドリッチ	G7528-250G
鉗子	デュモン	11252-21
ヘペス	シグマ・オルドリッチ	H3375-500G
Imaris 10.0.2	オックスフォード・インストゥルメンツ		解析ソフトウェア
イマリスファイルコンバーター	オックスフォード・インストゥルメンツ
ロックタイト瞬間接着剤ウルトラジェルコントロール	ロックタイト	1363589	指輪作り用の接着剤
塩化マグネシウム・ヘキサハイドレート	シグマ・オルドリッチ	M9272-100G
MCE膜フィルターペーパー(13mm)	ミリポール	HABG01300	0.45 & mu;m 孔径
微小環境チャンバー	東海ヒット	STXG-TIZBX-セット
ニコン エクリプス Ti2-E 倒立顕微鏡	ニコン
NISエレメンツ	ニコン
ネオマイシンおよびポリミキシンBスルフェスおよびバシトラシン亜鉛眼薬軟膏、USP	バウシュ+ロンブ	24208-780-55
ペイントブラシサイズ00	アマゾン
プリズム8.0	グラフパッド
プロパラカイン塩酸眼科溶液 USP、0.5%	サンドズ	61314-0016-01
PDLコーティングペトリ皿(35mm)	マテック	P35GC-1.5-14-C	No 1.5 コバースリップ
PSD95_pTagRFP	アッドジーネ	52671	http://n2t.net/addgene:52671
塩化カリウム	シグマ・オルドリッチ	P9333-500G
塩化ナトリウム	シグマ・オルドリッチ	S7653-1KG
リン酸ナトリウム一塩基一水和物	シグマ・オルドリッチ	S9638-25G