腫瘍および疾患研究のための接着剤ベースの組織マイクロアレイ構築

Summary

このプロトコルは、接着剤ベースのTMA構築のための低コスト生産と効率的な検証方法を説明し、腫瘍および疾患研究に便利な病理学的診断プラットフォームを提供します。

Abstract

組織マイクロアレイ技術 (TMA) は、複数の組織サンプルを同時に検出および分析するためのハイスループット プラットフォームであり、効率的な腫瘍および疾患バイオマーカー研究を促進します。しかし、従来のTMA工法では、操作の複雑さ、手技の手間がかかる、精度のばらつきなどの限界に直面することが多い。これらの課題を克服するために接着剤ベースの TMA 構築法が開発され、組織コアの固定が改善され、構造安定性が向上しました。体系的な検証には、組織学的評価 (HE 染色)、標的タンパク質の免疫組織化学的プロファイリング、および蛍光 in situ ハイブリダイゼーション (FISH) 分析が含まれていました。結果は、接着剤ベースの方法が優れたスライスの完全性を維持し、信号対雑音比を改善し、バッチ間の一貫した再現性を保証することを実証しました。このアプローチは手動操作に限定されていますが、中程度のスループットの TMA 生産には信頼性が高くコスト効率の高いオプションとなります。この方法は、大規模な自動化よりも柔軟性とサンプルの多様性を重視する研究環境に特に適しており、学術および診断環境における TMA の有用性を拡大します。

Introduction

組織マイクロアレイ(TMA)は、組織サンプル^1,2,3を分析するためのハイスループット技術です。複数のドナー組織コアが得られ、ドナーパラフィンブロックをレシピエント組織ブロックに移し、理論的に同じ^{性能条件下で}同時に差分分子分析と比較分子分析を行います^2,4。組織マイクロアレイ(TMA)を構築する古典的な方法は、ホールパンチを使用してドナー組織サンプルから組織コアを抽出し、それらをレシピエントパラフィンブロックに順次配置することです。この方法は、同様の深さのドナーパラフィンブロックに適しており、1つのスライス上の複数のサンプルの効率的な分析を可能にし、研究の効率^{とデータの一}貫性を大幅に向上させます^5,6,7。それにもかかわらず、この方法には、包埋プロセス中の組織コアの不適切な取り扱いなど、依然として一定の制限があり、その結果、その後の分析でサンプルの染色に一貫性がなくな^{る可能性があります8。}

TMA構築の2番目の方法は、テープ法^9,10です。この方法は、コアの長さ^11,12に関係なく、完成時にTMAの上部と同じ高さになる逆直立コアの周りにブロックをキャストすることにより、建設プロセスを反転させます。ただし、この方法では、組織コアの適切な配置とテープの有効性を確保する必要があり、従来の技術と比較して処理できるサンプルの数も制限されます。

本研究では、従来の技術に存在する組織コアの安定性の不足や操作の複雑さなどの問題の解決を目指し、TMAを構築するための革新的な接着剤法を提案します¹³。この方法は、接着剤を使用して複数の組織コアを正確に固定し、操作が簡単でサンプルの硬さが強いという利点があります。従来の切片化法やテープ法と比較して、接着法は組織コアの保持率を高め、コストを削減できます。この方法は、サンプルサイズが中程度の臨床研究に適用でき、実験計画の柔軟な調整が必要な研究デザインに特に適しています。ただし、この方法の処理能力は超高スループット⁹の要求を満たしていないことに注意する必要があります。一方、実際の申請プロセスでは、標準化された操作基準と品質管理システムの完全なセットを確立する必要があります。オペレーターは、技術業務の標準化と結果の再現性を確保するために、体系的なトレーニングを受け、専門的な評価に合格する必要があります。包括的な分析により、この技術は運用の柔軟性、費用対効果、技術的信頼性のバランスが取れており、リソースは限られているが品質管理を保証する必要がある研究シナリオに特に適しています。

Protocol

すべてのドナーブロックは、2016年から2018年の間に南京医科大学付属淮安第一人民病院で収集されたアーカイブ病理標本から取得されました。サンプルは使用前に匿名化され、承認されたプロトコルに従って処理されました (南京医科大学付属淮安市第一人民病院倫理委員会、KY-2024-250-01)。

1. ドナー組織の評価とタグ付け

1. 厚さ≥5 mm、面積≥15 mm×15 mmの組織ブロックを選択します。端に 2 mm の安全マージンを確保し、組織の完全性を維持するために壊死、出血、または石灰化を示す領域を除外します。
2. ターゲットエリアの識別とマーキング
   1. 光学顕微鏡を使用してH&E染色切片を評価します。低出力スキャンで標的領域を特定し、高出力に切り替えて細胞の形態特性を確認します。スライドのターゲット領域の境界をマークします。
   2. 選択した領域の座標をパラフィンブロックの表面にマッピングして、マーキング変換を完了します。

2. 組織コアの抽出

1. 穿刺の準備とサンプルの前処理
   1. 直径2mmのハンドヘルドホールパンチャーを選択し、刃先の滑らかさと操作のしやすさを確認してください。
   2. ドナーパラフィンブロックを4°Cの冷たいプラットフォームに15分間置きます。
2. 針をマークされた点に垂直に合わせ、一定の回転圧力を加えて限界深さに達します。プロセス中は傾けたり振動したりしないでください⁷ (図 1A)。
3. 針を反時計回り(≤2回転/秒)にゆっくりと回して引き抜きます。組織コアを針から慎重に取り出し、事前に冷却した96ウェルプレートの個々のウェルに移します。各ウェルのコア位置を記録します(図1B)。
   注意: ティッシュコアの底が不均一な場合は、ブレードで水平にしてください。トリミング後、完全性を再確認します。
4. すべてのドナー番号と対応するELISAプレートウェル位置(A1-H12)を登録フォームに事前に記録します。操作中は、ドナー番号とウェル位置が厳密に一致していることを確認するために再確認してください。
5. すぐにコアの完全性を検査します。破損、曲がったコア、または直径の偏差が >0.1 mm のコアを廃棄します。
   注: コアの長さの一貫性 (変動係数、CV ≤5%) を確保し、表面の傷や圧縮アーティファクトを避けてください。

3.組織コア固定

1. 防水マーカーを使用して金型表面に直接グリッドを描き、線が明確で均等な間隔になります。
   1. 有効底面積が 3.0 cm × 2.5 cm の標準金型を使用し、両側に 1.5 mm のブランク境界領域を確保します。
   2. 0.5mmの微細な点防水マーカーを使用して、水平方向と垂直方向に等間隔の平行線を9本描画し、9×9の位置決めグリッド(合計81の交点)を形成します。
      注意: 開始する前に、キシレンを染み込ませた綿棒で金型内部を清掃し、層間剥離の原因となる残留パラフィンを取り除いてください。描画プロセス中は、鋼定規を使用して線の太さを均一にし、交点を明確に区別できるようにします。
2. ピペットを使用して5 μLの接着剤を引き出し、事前に標識されたスライドの中央にそっと置いて単一の液滴を形成します。すぐに細いピンセットを使用して、組織コアを90°の角度で垂直に持ち上げ、接着剤滴に垂直にゆっくりと押し込みます(図1C)。
3. ピンセットを使用して、金型上の対応するグリッドの交点にコアを挿入します。確実に接着するために、5秒間穏やかな圧力を加えます(図1D)。
4. 組織コアが変位した場合は、接着剤が固まる前に(30秒以内)、細いピンセットを使用してすぐに微調整してリセットします。固化して位置がずれたコアを廃棄して、貴重なサンプルを最大限に保存しながら調製品質を維持します。

4. カセットの取り付けとパラフィンの埋め込み

1. ティッシュカセットをスチール製の金型の上に垂直に置き、圧縮を加えずにコアチップと接触するようにします。四隅すべてに磁気クランプを使用してカセットを固定し、溶融パラフィンで継ぎ目を密閉します。
2. 溶融パラフィンをジグザグパターンで45°の角度で注入し、1 mL/sの流量を維持します。パラフィンレベルがコアチップを2mm超えていることを確認します(図1E)。
3. ブロックを4°Cのコールドプレート上で5分間急速冷却して、剛性のある支持層を形成します。ブロックを22°Cの環境に20分間移し、内部応力を低減します。最後に、40°Cのヒートガンを使用して表面を優しく滑らかにし、収縮跡をなくします。
4. パラフィンを少し加熱して柔らかくし、カセットの端に沿って慎重にカットしてブロックを緩めます。カセットをそっと持ち上げ、残留パラフィンを取り除き、組織コアの完全性を確保します(図1F)。

Results

本研究では、接着剤法を用いて高品質の組織マイクロアレイを構築した。この方法の有効性を検証するために、H&E 染色、特定のタンパク質の免疫組織化学的検出、蛍光 in situ ハイブリダイゼーション (FISH) 分析などの一連の実験が実施されました。構築プロセスの重要な要素は、予想される位置と距離に組織コアドットが存在することであり、これは目視検査によって評価されます。TMAブロックを目視検査すると、コアが各TMAに存在し、規則的に間隔をあけていることがわかります(図2A)。H&E染色は、すべての組織コアが均一に配置され、均一な間隔、一貫したサイズ、および豊富な標的組織を備えていることを示しました(図2B)。免疫組織化学染色の結果は、TMAにおける10の前立腺がん関連タンパク質(ZCCHC24、SMAD9、TARBP1、CDHR4、CRTAC1、DNASE1L3、GPR146、IGSF10、ITIH1、およびCDK1)の強力な発現を示し、一貫した染色強度と最小限のバックグラウンド干渉を...

Discussion

組織マイクロアレイ (TMA) を構築する革新的な方法として、接着法は、構築手順の容易さと費用対効果により、大きな利点を示しています。高度な器具^14,15に依存する従来のニードルアレイ法と比較して、接着法は、基本的なツールのみで行うことができる接着によるサンプルの固定を可能にし、技術的しきい値を大幅に低減します。従来の包埋法とは対照的に、接着法は局所分注によって固定されるため、組織コアの局在化時間が大幅に短縮され、高温による感受性抗原の破壊が回避されます^16,17 (表 2)。

しかし、実際の施工手順では、複雑でデリケートな工程が多くあります。これらの手順は多くの時間を費やすだけでなく、オペレーターの技術レベルと経験に対して非常に高い要件を課します。...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
乳がんHER2検出キット	Anbiping	2502001	がんHER2検出キット
CDHR4	Abcam	ab166914	CDHR4
CDK1	Abcam	ab265590	CDK1抗体
CRTAC1抗体	Abcam	ab254691	CRTAC1抗体
DNASE1L3抗体	Abcam	ab203669	DNASE1L3抗体
包埋機	P.S.J MEDICAL	BM450A	包埋機
全自動組織脱水機	ライカバイオシステム	ASP3005	全自動組織脱水機
ガラス顕微鏡スライド	Citotest	250124A1	ガラス顕微鏡スライド
着剤	TIZO	200	接着剤
GPR146 抗体	Abcam	ab117104	GPR146 抗体
IGSF10 抗体	Abcam	ab197671	IGSF10 抗体
ITIH1 抗体	Abcam	ab233032	ITIH1 抗体
プロファイルミクロトームブレード	サーモフィッシャー	3052835	ロープロファイルミクロトームブレード
マーカーペン	デリ	SK109	マーカーペン
クロトーム	ライカバイオシステムズ	HistoCore BIOCUT ミ	クロトーム
パラフィンワックス	Solarbio	YA0012	パラフィンワックス
SMAD9 抗体	Abcam	ab262940	SMAD9 抗体
TARBP1 抗体	Abcam	ab115896	TARBP1 抗体
ZCCHC24 抗体	Abcam	ab88756	ZCCHC24 抗体