出生後早期マウス脳発生におけるミクログリア活性化を特徴付けるためのフローサイトメトリーと単一細胞解析

Summary

このプロトコルは、フローサイトメトリーとシングルセルRNAシーケンシングを組み合わせて、出生後早期マウス脳の小脳におけるミクログリア細胞の状態を単離し、特徴付けます。酵素解離、パーコール遠心分離、免疫染色を使用してミクログリアの不均一性を明らかにし、小脳の発達と疾患におけるミクログリアの役割の理解を深めます。

Abstract

脳に常在する免疫細胞であるミクログリアは、発生および疾患中に領域および状況固有の転写プロファイルを示します。このプロトコルは、マウス小脳組織におけるミクログリア集団を研究するための2つの補完的な方法、フローサイトメトリーと単一細胞RNAシーケンシングを提示する。

最初に使用された方法として、フローサイトメトリーベースのプロトコルは出生後早期の脳に最適化されており、実験条件全体での堅牢な細胞分離と一貫性を保証します。酵素消化による組織解離から始まり、その後、Percoll密度勾配遠心分離によるミエリン除去により高品質の神経細胞懸濁液が得られ、CD45およびCD11b発現に基づくゲーティング戦略が行われます。生/死染色は細胞の生存率を確保し、蛍光色素結合抗体を使用してミクログリア上の選択された表面マーカーの発現をプロファイリングします。補償コントロールは、蛍光マイナス1(FMO)コントロールを使用した検証済みのゲーティング戦略を備えたラテックスビーズを使用して実行されます。

2番目の方法は、10X Genomicsを使用した単一細胞RNAシーケンシングを含み、同じ上流の単離ステップに従い、条件全体でミクログリアのトランスクリプトームプロファイリングを可能にします。遺伝子発現解析を用いてミクログリアクラスターを同定し、実験群間で差次発現解析を行います。ランダムフォレスト分類器は、多重化時に男性と女性のサンプルを区別するためにのみ適用されます。

これらの再現性と適応性のあるプロトコルを組み合わせることで、脳の発達初期における小脳のミクログリアの多様性と、実験的摂動後の潜在的な変化を調査するための堅牢なフレームワークが提供されます。

Introduction

出生後早期は脳の発達にとって重要な段階であり、認知、感情、行動機能の基礎を築く複雑な細胞および分子プロセスを特徴とします¹。しかし、この時期は、混乱が神経発達の軌道を変化させ、長期的な神経障害や精神障害につながる可能性があるため、脆弱性によっても特徴付けられます。脳に常駐する免疫細胞であるミクログリアは、シナプス剪定、食作用、免疫監視、および環境的侮辱への反応を通じて、発達中の脳を形成する上で中心的な役割を果たします^2,3。これらの細胞は顕著な可塑性を示し、脳領域、発達段階、および病理学的状況に応じて変化する転写プロファイルを採用しています^4,5。

発達中の脳におけるミクログリアの活性化を正確に分析するには、未熟な脳組織の文脈でミクログリアの動的表現型を分析できる堅牢で再現性のある方法論が必要です。フローサイトメトリーは信頼性の高いソリューションを提供し、細胞集団とマーカー発現のハイスループット特性評価^{を可能にします6。}しかし、出生後初期の脳からのミクログリアの研究におけるその応用は、組織の繊細な性質と効率的な細胞単離および濃縮プロトコルの必要性のために技術的に困難です^7,8。

ここで提示するプロトコルは、フローサイトメトリーと単一細胞RNAシーケンシング(scRNA-seq)を組み合わせて、出生後3日目(P3)から出生後30日目(P30)9までの小脳に特に焦点を当て、出生後3日目(P3)から生後30日目(P30)⁹までの小脳に焦点を当てています。

このワークフローには、酵素解離、破片除去と細胞濃縮のための密度勾配遠心分離、細胞外および細胞内マーカーのパネルを使用した免疫染色が含まれます。ミクログリアの多様性を特徴付けるために、さまざまな表面および細胞内マーカーが使用されます^10,11。固定ラベル(炎症性または修復性)を割り当てる代わりに、プロトコルは離散マーカー発現プロファイルに基づいて亜集団を定義します。例えば、CD80、CD86、およびiNOS、CD206およびArg1、CD86およびCD64、またはCD163およびCD206を発現するミクログリアは、分子的に異なるサブセットとして同定および分析されます。これらのマーカーは、さまざまな活性化されたミクログリア状態^10,11を反映し、発現プロファイルとして提示されます。

このマルチパラメトリックゲーティング戦略により、表面マーカー発現に基づいてミクログリアサブセットを正確に同定することができ、出生後の脳発達中の免疫不均一性を分析するための合理化されたフレームワークを提供します。表現型プロファイリングを拡張し、転写の多様性を明らかにするために、細胞単離後に単一細胞RNAシーケンシングが実行されます。この研究は、神経発達プロセスとミクログリア活性化の長期的な影響の理解を深めるための一貫性のあるスケーラブルなワークフローを確立します。最適化されたフローサイトメトリーと scRNA-seq を発生的および地域的に情報に基づいたフレームワーク内に統合することにより、このプロトコルは、幼少期のミクログリア生物学と神経発達の結果との関連性を調査するための強力なツールとして機能します。

Protocol

すべての動物処置は、CHU Sainte-Justine Research Center の倫理委員会によって審査および承認され、Ste-Justine Research Center およびモントリオール大学 (カナダ、ケベック州モントリオール) のガイドラインとポリシーに準拠しています。

1.脳からの細胞の分離

1. 麻酔/安楽死処置に続いて、脳全体を頭蓋腔からすばやく取り出し、ミクログリア細胞培養培地を含む15 mLチューブに入れます( 材料表を参照)。チューブを氷の上に置いてください。必要に応じて、追加のマウスに対して同じ手順を繰り返します。
   この研究で使用されたすべてのマウスは、トレンブレイ博士の研究室の社内繁殖コロニーに由来しました。実験マウスは、B6.129-Cx3Cr1^{CreERT2-EYFP/WT}マウスとB6-Rosa26^iDTR/WTマウスを交配することによって生成されました。この育種戦略は、IDTR対立遺伝子のヘテロ接合性の子孫を生み出し、タモキシフェン誘導性Cre-loxPシステムを介してCx3Cr1発現細胞(主にミクログリア)の条件付き枯渇を可能にしました。組織採取の前に、マウスにケタミン(150μg/g)とキシラジン(10μg/g)の腹腔内注射によって麻酔をかけた。安楽死は、施設の動物のケアと使用ガイドラインに従って、深い麻酔下で首を切ることによって行われました。
2. 必要に応じて、脳全体を保存するか、特定の領域の解剖を進めます。細胞生存率を維持するために、ミクログリア細胞培養培地( 材料表を参照)を含む小さなペトリ皿で氷上で解剖を行います。
   注:このプロトコルは、P1からP30までの全脳と小脳について検証されています。
3. ミクログリア細胞培養培地を取り出し、ペトリ皿でメスを使用して脳組織を細かく切断します。
4. 酵素消化のために、均質化された組織を5mLチューブに移します。2 mg/mLのコラゲナーゼDおよび14 μg/mLのDNase Iを添加した2 mLのHBSS(1x)を加えます( 表1を参照)。チューブキャップをパラフィルムで密封します。チューブを37°Cのウォーターバスで15分間インキュベートし、5分ごとにチューブを振とうします。消化を止めるには、チューブを氷の上に置きます。
5. ホモジネートを140μmの金属メッシュフィルター( 材料表を参照)に通して、大きな破片を取り除きます。ガラス乳棒を使用して細胞を解離します。
6. フィルターをミクログリア細胞培養培地(洗浄ごとに3 mL)で複数回洗浄します。
7. 10 mLピペットを使用して濾液を収集し、15 mLチューブに移します。溶液を500 g で4°Cで7分間遠心分離します。
8. チューブを慎重に反転させて上清を捨てます。ラックをそっとこすってペレットを再懸濁します。
9. 10 mLの37%シリカベースのコロイド媒体溶液( 表1を参照)を加えて、ミエリンと破片を除去します。溶液を500 g で4°Cで10分間、最小限のブレーキ力で遠心分離します。
10. 10 mLピペットを使用して、溶液の上部にあるミエリン層を吸引します。
    注:連続吸引により、ミエリンが溶液に再び混入するのを防ぎます。
11. 10 mLのHBSS(1x)を加えて細胞を洗浄し、500 × g で4°Cで7分間遠心分離します。
12. 上清を捨てます。ラックでそっとこすってペレットを再懸濁し、10 mLの蛍光活性化細胞選別(FACS)バッファーを加えます( 表1を参照)。溶液を500 g で4°Cで10分間遠心分離します。
13. 上清を廃棄し、最終ペレットを再懸濁し、細胞を保持します。単離された細胞は、フローサイトメトリー染色またはシングルセルRNAシーケンシングの準備が整いました。
14. 単一細胞RNAシーケンシング単離では、卓上安定性蛍光試薬( 材料表を参照)を使用して顕微鏡下で細胞をカウントし、トリパンブルー( 材料 表を参照)とともに生細胞と死細胞を区別します。細胞が良好な状態にあり、生存率が最大 90% であり、濃度が 1000 細胞/μL に達していることを確認します。次のステップについては、セクション 9.1 で説明します。
    注:プロトコル全体を通してチューブを氷の上に置いてください。すべての遠心分離ステップは、最小ブレーキが指定されているPercollステップを除き、最大ブレーキで4°Cで実行する必要があります。最良の結果を得るには、プロトコル全体を同じ日に実行してください。単離に使用するすべての溶液を単離に使用する単一細胞RNA配列プロトコルフィルターの場合、ステップ1.11で2回目の洗浄にHBSS(1x)を使用し、ステップ1.12で70〜100 μLの細胞溶液を保持します。

2. フローサイトメトリー細胞外染色プロトコル

1. すべての細胞を円錐形の底を持つ96ウェルプレートに移します( 材料表を参照)。プレートを500 g で4°Cで5分間遠心分離します。
2. プレートを素早く反転させて、上清を1回の動作で除去します。
3. 細胞ペレットを25 μLのブロッキング溶液に再懸濁します( 表1を参照)。室温(RT)で15分間インキュベートします。
4. 細胞外抗体染色ミックス( 表2を参照)を調製するには、抗体ストックを10,000 × g で遠心分離して、潜在的な凝集体を除去します。ペレットを乱すことなく、上清から所望の容量を慎重に吸引して染色混合物を調製し、FACSバッファーで容量を25 μLに調整します。
5. 各ウェルに25 μLの細胞外抗体ミックスを加えます。RTで20分間インキュベートします。
   注:実験的使用に先立ち、すべての抗体を小脳(または脳)単一細胞懸濁液で滴定して、最適な作業濃度を決定しました。滴定は、飽和曲線を生成するために連続希釈によって実行され、最小のバックグラウンドでシグナルプラトーに対応する希釈がシグナルステージング用に選択されました。
6. 混合せずに、150 μLのFACSバッファーをウェルに加えます。プレートを500 × g で4°Cで5分間遠心分離します。 プレートを反転させて、1回の動きで上清を取り除きます。
7. 細胞ペレットを200 μLのFACSバッファーに再懸濁します。プレートを500× g で4°Cで5分間遠心分離します。 プレートを反転させて、1回の動きで上清を取り除きます。同じ条件下で200 μLのFACSバッファーを使用して、もう一度洗浄を繰り返します。

3.細胞内染色

1. 細胞を100 μLのサポニン-パラホルムアルデヒド(PFA)緩衝液( 表1を参照)に再懸濁して、細胞を固定および透過性化します。光から保護して、RTで10分間インキュベートします。
2. 混合せずに、100 μLのサポニンバッファーを加えます( 表1を参照)。プレートを500× g で4°Cで6分間遠心分離します。 プレートを反転させて、1回の動きで上清を取り除きます。
3. 細胞ペレットを200 μLのサポニン緩衝液に再懸濁します。20 μLのビーズ( 材料表を参照)を11個の空のウェルに加えることにより、補償コントロールを調製します。プレートを500× g で4°Cで6分間遠心分離します。 プレートを反転させて、1回の動きで上清を取り除きます。
4. 細胞内抗体染色ミックス( 表3を参照)を調製するには、抗体ストックを10,000 × g で遠心分離して、潜在的な凝集体を除去します。ペレットを乱すことなく、上清から所望の容量を慎重に吸引して染色混合物を調製し、サポニンバッファーで容量を50 μLに調整します。
5. ペレットを50 μLの細胞内抗体ミックスに再懸濁します( 表3を参照)。各抗体1 μLをビーズウェルに加えます。RTで30分間インキュベートします。
6. 混合せずに、各細胞サンプルウェルに150 μLのサポニンバッファーを加え、補償コントロールを含む各ウェルに100 μLのFACSバッファーを加えてビーズを洗浄します。プレートを500× g で4°Cで6分間遠心分離します。 プレートを反転させて、1回の動きで上清を取り除きます。
7. 細胞ペレットを200 μLのサポニンバッファーに再懸濁し、代償対照を200 μLのFACSバッファーに再懸濁します。プレートを500× g で4°Cで6分間遠心分離します。 プレートを反転させて、1回の動きで上清を取り除きます。同じ条件下で200 μLのサポニンバッファーを使用して、もう一度洗浄を繰り返します。
8. 細胞と代償対照を200 μLのFACSバッファーに再懸濁します。懸濁液をFACSチューブに移し、フローサイトメトリー取得まで4°Cで保存します。
   注:感光性試薬を含むすべてのステップが最小限の光条件で行われることを確認してください。1つのビーズウェルには抗体が含まれておらず、これは染色されていないビーズチューブに対応します。

4. フローサイトメトリーの取得

1. フローサイトメーターの電源を入れ、次にコンピューターの電源を入れます。
2. フローサイトメーターソフトウェアを開き、サイトメータータブの[ 実行 ]を選択して、フルイディクスの起動を開始します。
3. [ 新しいフォルダー ] をクリックし、名前を割り当てて、新しい実験フォルダーを作成します。次に、[ 新しい実験 ]をクリックして実験に名前を付け、[ 新しいチューブ ]を選択して標本とサンプルチューブを追加します。

5. 報酬管理を設定する

1. パネルで使用される蛍光色素ごとに、染色されていないコントロールとともに、単一染色された補正ビーズを準備します。
2. サイトメーターに補償チューブをロードします。前方散乱(FSC)と側面散乱(SSC)の電圧を約250に設定します。
3. 各蛍光チャネルの電圧を調整して、負の母集団が軸の最初の10年になるようにします。
4. チューブごとに少なくとも5,000のイベントを取得します。
5. 補償行列を使用して、すべての正のピークが負の母集団から明確に分離され、それぞれの軸の 10⁴ より上の中央に配置されるまで、スペクトルのオーバーラップを調整します。
   注:サイトメーターの設定または蛍光色素の性能はスペクトルの重複に大きく影響する可能性があるため、すべての実験で補償制御を実行する必要があります。一部の脳組織アプリケーションでは細胞ベースの代償制御が推奨されていますが、P3マウス小脳から得られるミクログリアの数が少なく、細胞ベースの代償の実現可能性が制限されているため、このプロトコルでは抗体キャプチャービーズが使用されました。抗体蛍光は当初、脳由来細胞で検証され、ビーズベースのシグナルに匹敵することが判明しました。最初のパネル最適化中に未染色の脳由来細胞懸濁液を含めて、組織の自家蛍光を評価し、ベースラインシグナルレベルを確立します。この制御は、各蛍光チャネルで負の母集団を適切に設定するために不可欠です。

6. FMO コントロールの準備と取得

1. 各キーマーカーについて、テスト対象の抗体を除くすべての抗体を含む蛍光マイナス1(FMO)コントロールを準備します。
2. 完全に染色されたサンプルと同じ取得設定を使用してFMOコントロールを実行します。
3. FMOプロットを使用して、低母集団または重複母集団のゲーティングしきい値を定義し、真陽性とバックグラウンドノイズを区別します。
   注:FMO制御は、特に脳などの自家蛍光の高い組織において、正確で信頼性の高いゲーティング境界を定義するために、最初のパネル最適化中に実行する必要があります。染色パネル、機器設定、または実験条件を変更する場合は、FMOコントロールを繰り返す必要があります。同じ検証済みパネルとサイトメーターの設定を使用した後続の実験では、以前に定義したゲーティング閾値を再利用して、生物学的複製間での一貫性を確保できます。

7. アイソタイプコントロールの準備と取得

1. 蛍光色素と濃度が試験抗体と一致するアイソタイプコントロール抗体でコントロールサンプルを染色します。
2. 同じサイトメーター設定を使用してデータを取得します。
3. アイソタイプコントロールは、特に細胞内マーカーまたは特性評価が不十分な抗体の場合に、潜在的な非特異的結合を評価するためにのみ使用してください。アイソタイプコントロールは特異的抗体と同じ結合速度を反映しないため、ゲーティングには使用しないでください。
   注:アイソタイプコントロールはゲーティングには適していないため、集団の定義には使用しないでください。それらの使用は任意であり、選択された症例で抗体特異性を検証するために予約する必要があります。

8. フローサイトメトリーのゲーティング戦略

1. シーケンシャルゲート用に次のドットプロットを作成します。
   FSC-A と SSC-A の比較により、破片を排除
   FSC-A と FSC-H で一重項を選択します。
   FSC-A と Amcyan (生存率色素) による生細胞のゲート。
2. CD11b(FITC)とCD45(AF700)を使用して、ミクログリアをCD11b⁺CD45⁺ として識別します。
   注:発生段階(P3-P15)、炎症状況、および酵素消化により、TMEM119およびP2RY12は、フローサイトメトリーによってミクログリアを他の骨髄集団から明確に分離するのに信頼できませんでした。したがって、出生後の脳で以前に検証されたCD11b⁺CD45⁺ ゲーティング戦略は、汚染を最小限に抑えながらミクログリア集団を特定するために使用されました。対照条件では、典型的な収量は、P3からP15までの全脳あたり300,000〜200,000個のミクログリア細胞の範囲です。特に小脳に焦点を当てた実験の場合、平均収量は脳あたり約5,000個のミクログリア細胞です。
3. FMO コントロールを使用して、アクティベーション マーカーのゲーティングしきい値を定義します。
4. 免疫関連マーカーの発現に基づいてミクログリア亜集団を同定します。
   CD80⁺ (スーパーブライト436)
   CD86⁺ (PE)
   iNOS⁺ (PE-eFluor 610)
5. マーカー発現の組み合わせによってミクログリアサブセットをさらに特徴付けます。
   CD206⁺ (APC)^次にArg1+ (PE-Cy7)
   CD86⁺ (PE)、^CD64+ (PerCP-eFluor 710)
   CD163⁺ (スーパーブライト600)^次にCD206+ (APC)
   注:マーカーの組み合わせは、ミクログリア集団内の分子の不均一性を説明するために使用されます。これらのサブセットは、マーカー発現のみに基づいて報告され、ミクログリアの可塑性と状況依存の表現型を認識する現在の基準に従って、特定の機能的役割は割り当てられていません。
6. 実験サンプルをロードします。FSC を 300 に、SSC を 200 に設定します。低流量を使用し、必要な数のイベントを記録します。
7. 取得後、サイトメーターを洗浄し、データを としてエクスポートします。分析用のFSCファイル。
8. フローサイトメーターソフトウェアを使用してデータを分析します。

9. シングルセルRNAシーケンシングサンプル

1. フローサイトメトリーで説明されているのと同じ細胞単離プロトコル(ステップ1.14を参照)を使用して、解離した細胞をFACSバッファーに再懸濁します。細胞の安定性を維持するために、収集チューブおよびその後のすべての取り扱いステップにFACSバッファーを使用します。
2. 脳領域からすべての細胞型をキャプチャすることが目的の場合は、蛍光活性化細胞選別(FACS)を実行しないでください。ただし、実験でミクログリアの濃縮が必要な場合は、シーケンス前にFACSソーティングステップを含めます。
3. 卓上で安定した蛍光生存率色素とトリパンブルーを使用して、細胞生存率を直ちに評価します( 材料表を参照)。血球計算盤を使用して顕微鏡下で細胞を数えます( 材料表を参照)。
4. 細胞懸濁液が少なくとも90%の生存率を示し、シングルセルRNAシーケンシングを続行する前に、約1,000細胞/μLの最終濃度に調整することを確認します。
5. すべてのサンプルを氷上に保管し、解離後すぐに処理して、細胞ストレスと転写変化を最小限に抑えます。
6. 製造元の指示に従って、サンプルをペアでマルチプレックスします。
   注: 実験コストを削減するために、同じ実験グループから 1 人の男性と 1 人の女性をプールしました。
7. scRNAseqライブラリーを調製し( 材料表を参照)、推奨されるメーカーのガイドラインに従ってください。
   注:ライブラリの調製は、モントリオール大学の免疫学およびがん研究所(IRIC)のゲノミクスプラットフォームによって行われました。
8. シーケンシングシステムを使用してscRNA-seqライブラリをレーンあたり平均3200Mリードの深さまでシーケンスします。
   注:シーケンシングは、モントリオールのゲノムケベックで実施されました。

10. シングルセルRNAシーケンシング解析

1. 10X GenomicsのCell Rangerソフトウェア(v8.0.0)とMouse GRCm39 2024-Aリファレンスゲノムを使用して、固有分子識別子(UMI)カウント解析を実行します。ダウンストリーム分析には、Seurat Rパッケージ(v5.1)を使用します。
2. ミトコンドリアRNAが例えば、全RNAの30%を超える細胞(図1A)、または潜在的なストレスのある細胞を除去するために選択されたより厳しい閾値を持つ細胞を除外することにより、品質管理を実施します。log10GenesPerUMIが0.75より大きい(図1B)、ユニーク特徴数(「nUMI」)が500未満、細胞あたり検出される遺伝子数(「nGene」)が300を超える低品質の細胞を除外します(図1C)。次に、Rの「scDblFinder」パッケージで液滴を除去します。nUMIとnGeneの相関プロットが閾値を示すと、フィルタリング効果が見えるはずです(図1D)。
3. Seuratの SelectIntegrationFeatures 関数を使用して、サンプルごとに2,000の変動性の高い遺伝子を同定することで、バッチ効果を軽減します。
4. 正準相関分析(CCA)を使用してデータセットを統合し、次元削減のために主成分分析(PCA)を実行します。50 個の主成分 (PC) で RunPCA 関数を使用し、データをスケーリングし、不要な変動源 (ミトコンドリア含有量など) を回帰させます。エルボプロットとJackStraw分析に基づいて、保持されたPCの数を評価します。
5. Seurat RunUMAP 関数を介して、一様多様体近似および投影 (UMAP) アルゴリズムを使用してクラスターを視覚化します。 FindAllMarkers 関数を使用して、クラスター固有の遺伝子発現プロファイルを同定します。同定されたマーカー遺伝子をPanglaoDBやCellMarkerなどのキュレーションされた単一細胞リソースと相互参照することにより、転写シグネチャに基づいてクラスターに注釈を付けます(図2)。ミクログリアを含む細胞型は、事前定義された表面マーカーからではなく、これらのトランスクリプトームプロファイルから推測されます。

11.性に基づく細胞分離

1. 性特異的遺伝子の発現に基づいて男性細胞と女性細胞を同定します:4つの女性特異的遺伝子(Xist、Tsix、Usp9x、Eif2s3x)と3つの男性特異的遺伝子(Eif2s3y、Uty、Ddx3y)。
2. Seuratの サブセット 関数を使用して、これらの遺伝子のいずれかについて正規化されたUMIカウント>1を発現する細胞をフィルタリングすることにより、男性と女性の集団を分類します。
3. 男性と女性のセルを別々にサブセット化して、Seuratオブジェクトを生成します。これらのオブジェクトを個別に保存して分析し、下流の比較を行います。
4. FeaturePlotおよびVlnPlot関数を使用して性特異的遺伝子発現を視覚化することで分類を検証し、男性と女性の細胞集団を明確に分離します。
   注:ステップ12.1および12.2は、サンプルが1人の男性と1人の女性を混合して多重化された場合にのみ実行する必要があります。

12. 統計モデルに基づくミクログリア分類

1. 既知のグループラベルを持つ ~1,000 個のセルのトレーニングセットを使用して、R で 5 つの統計モデル (ランダムフォレスト、ロジスティック回帰、ナイーブベイズ、サポートベクターマシン、決定木) を構築します。
2. 10倍のクロスバリデーションとレシーバ動作特性(ROC)曲線を使用して、モデルのパフォーマンスを評価します(図3)。Seuratの FindAllMarkers 関数を使用して、分類に寄与する主要な遺伝子を特定します。
3. ROC曲線(AUC)の下の面積が最も大きいモデルを選択します。ランダムフォレストモデルは、優れたAUCスコアに基づいて選択されました。
4. RandomForest R パッケージの predict 関数を使用して、選択したモデルを未分類のセルに適用します。merge を使用して、予測された分類を Seurat で以前に注釈が付けられたデータセットとマージします。
5. FeaturePlotとVlnPlotでマーカー遺伝子発現を可視化することで分類を検証します。予測された細胞同一性の一貫性を確保するために、適切な統計検定(フィッシャーの正確確率検定など)を使用して、分類された細胞を追加する前後に重複するマーカー遺伝子セットの濃縮を評価します。

13. ミクログリアの異なる遺伝子発現解析

1. Seurat関数「FindMarkers」を使用して、 ident.1 が目的グループを表し、 ident.2 が参照グループを表し、2つの特定の関心グループ間で差異遺伝子発現(DEG)解析を実行します。
   注:出力には、ident.1と比較してident.2で差次的に発現する遺伝子がリストされています。これに関連して、アップレギュレーションされた遺伝子は、ident.2と比較してident.1でより高い発現を示す遺伝子であり、ダウンレギュレーションされた遺伝子はident.1でより低い発現を示します。それらの比較は、火山プロットを生成し、条件固有の転写変化を解釈するために使用されます。
2. 調整された P値≤0.05で差次発現遺伝子(DEG)を同定します。2つの特定のグループ間の比較には、次の基準で FindAllMarkers 関数を使用します:細胞の少なくとも10%で発現する遺伝子(min.pct = 0.1)およびlog2倍数変化閾値0.25(logfc.threshold = 0.25)。すべてのミクログリアにわたる複数グループ比較には、同じパラメーターで FindAllMarkers 関数を使用します。調整された P値 が0.05≤遺伝子は、有意に差次的に発現していると見なされます。DEG発現パターンを視覚化するには、 EnhancedVolcano パッケージの組み込み関数を使用して火山プロットを生成します(図4)。
3. フローサイトメトリーの結果を比較するには、まずミクログリアを見つけるために使用されるサイトメトリーマーカー、特に遺伝子PtprcとItgamに対応するCD45⁺とCD11b⁺を調べます。SeuratのFeaturePlot関数を使用して遺伝子発現を確認します。
4. CD80やNOS2、Mrc1、Arg1、Fcgr1、CD163 など、異なるミクログリア状態に一般的に関連するマーカーを評価します。Seurat関数FeaturePlotとDotPlotを使用して、セルクラスター全体でそれらの式を視覚化します。
5. Seurat の DotPlot 関数を使用してドット プロットを生成し、マーカー式を要約し、母集団分類を検証します。

Results

このプロトコルは、フローサイトメトリーを効果的に利用して、選択された表面および細胞内マーカーの発現に基づいて、マウス脳サンプル中のミクログリア細胞集団を特徴付けます。次のセクションでは、ワークフローの主要なステップから得られた結果について詳しく説明し、実験条件に応じたミクログリアサブセットの分布と不均一性を強調します。

報酬とゲーティング戦略の検証
補正ビーズを使用して、蛍光シグナルを校正し、蛍光色素間のスペクトルの重複を補正しました。各蛍光色素の陽性と陰性の母集団が明確に分離され、正確な補償マトリックスの生成が可能になりました。ゲーティング閾値は、特に不十分なマーカーや重複するマーカーの場合、真のシグナルとバックグラウンドを区別するために、パネル最適化中に蛍光マイナス1(FMO)コントロールを使用して最初に検証されました。これらの閾値は、その後、同じ染色パネルとサイトメーターの設定を使用して実験全体で再利用され、一貫性を確保しました。アイソタイプコントロールは、特に細胞内マーカーの潜在的な非特異的結合を監視するために含まれていましたが、ゲーティングの決定には使用されませんでした。

ミクログリア細胞の同定
生/死(Amcyan)細胞ゲーティング戦略は、死細胞を排除することに成功しました。ゲーティング戦略は、CD45(AF700)およびCD11b(FITC)の発現に基づいてミクログリア細胞集団を効果的に単離しました。前方散乱(FSC)および側方散乱(SSC)パラメータを最適化し(FSC = 300、SSC = 200)、ドットプロット内のミクログリア集団を中央に配置しました(図5)。

ミクログリア細胞の表現型解析
ドットプロット分析により、表面マーカーと細胞内マーカーの異なる発現に基づいてミクログリア亜集団を同定することができました。FlowJoソフトウェアの特定のゲーティング戦略を使用して、CD80(Super Bright 436)、CD86(PE)、およびiNOS(PE-eFluor 610)を発現するミクログリア細胞のサブセットが同定されました(図6A)。ダブルゲーティングは、CD206(APC)およびArg1(PE-Cy7)を発現するサブセットを定義するためにも使用されました( 図6Bを参照)。追加の集団は、CD86(PE)とCD64(PerCP-eFluor 710)、ならびにCD163(Super Bright 600)とCD206(APC)の共発現によって特徴付けられました(図6C、D)。これらの表現型プロファイルは、ミクログリア集団内のマーカー定義の不均一性を反映しており、固定された機能状態を推測することなく、転写的および免疫学的に異なる複数のサブセットを区別するこのプロトコルの能力を実証します。

ミクログリア単一細胞解析
Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) を使用して、細胞の不均一性を視覚化し、他の脳細胞タイプの中でもミクログリア細胞クラスターを特定しました。各ドットは単一の細胞を表し、クラスターは転写の類似性に基づいて色分けされています(図2)。

ミクログリアクラスター内で差次発現解析を行い、実験条件下で調節された遺伝子を同定しました。調整されたP値≤0.05の遺伝子は、差次的に発現していると見なされました。

ミクログリア細胞のこれらの差次的に発現する遺伝子を視覚化するために火山プロットを作成し、高い倍数変化と統計的有意性の両方を持つ遺伝子を強調しました(図4)。

これらの単一細胞の結果をフローサイトメトリーデータと比較するために、ミクログリアマーカーCD45およびCD11b(Ptprc および Itgam) の発現を調べました。UMAPは、異なる細胞集団内での発現を示しています(図7)。

最後に、選択された免疫関連マーカーの発現を評価して、ミクログリア細胞間の転写の不均一性を特徴付けました。Violin プロットは、 CD80 や NOS- などの遺伝子、および Mrc1、 Arg1、 Fcgr1、 CD163 の単一細胞レベルでの発現を示しています (図 8)。これらのマーカー発現パターンにより、フローサイトメトリーベースのプロファイリングとの比較が可能になり、実験条件全体でミクログリアサブセットの分子多様性が浮き彫りになります。

図1:単一細胞トランスクリプトームデータの品質管理。 (A)細胞全体のミトコンドリアRNA含有量の分布。ミトコンドリアRNAが>30%の細胞を除外し、潜在的にストレスを受けた細胞や死にかけている細胞を除去しました。(B)log10GenesPerUMIが0.75>細胞をフィルタリングして、一貫した遺伝子対UMI比を確保し、複雑度の低いライブラリからのノイズを低減しました。(C)検出された転写物(nUMI)が500未満または検出された遺伝子(nGENE)が300を超える細胞も除外され、低品質または複数の細胞が排除されました。(D)フィルタリングしきい値の影響を示すNUMIとnGeneの相関プロット。検出されたダブレットは除去されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:単一細胞トランスクリプトームのUMAP視覚化。 2匹の動物から得られたトランスクリプトームプロファイルに基づく単一細胞の分布を示すUMAPプロット。各ドットは 1 つのセルを表し、クラスター ID によって色分けされています。ミクログリア細胞クラスターは、他の細胞集団の中で同定されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:クロスバリデーションによって評価されたランダムフォレスト分類器のROC曲線。 遺伝子発現プロファイルに基づいてミクログリアを他の脳細胞型と区別するために使用されるランダムフォレストモデルの性能を示す受信者動作特性(ROC)曲線。このモデルは、既知のラベルを持つ ~1000 個の細胞のセットでトレーニングされ、10 倍の交差検証を使用して評価されました。テストした5つの統計モデル(ランダムフォレスト、ロジスティック回帰、ナイーブベイズ、サポートベクターマシン、決定木)の中で、ランダムフォレストモデルが最高の分類性能を達成しました。曲線下面積 (AUC) は、モデルの精度を反映します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:ミクログリア細胞における異なる遺伝子発現解析。 2つの実験グループ(対照対小脳損傷)間のミクログリアで差次的に発現する遺伝子のlog2倍の変化と調整されたP値を表す火山プロット。アップレギュレーションされた遺伝子は、目的のグループ(ident.1)でより高く発現し、ダウンレギュレーションされた遺伝子は、参照グループ(ident.2)と比較して発現が低下します。有意に差次的に発現する主要な遺伝子が標識されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:フローサイトメトリーによるミクログリア同定のためのゲーティング戦略。 (A)対照生後3日目(P3)マウスの小脳細胞に適用されるゲーティング戦略。(B)ダブレットを除外するために一重項が選択されました。(C)生存細胞は、生存率色素を使用して同定されました。FSC-Aが低いイベントは、破片を除去し、無傷の細胞の分析を確実にするために除外されました。(D)ミクログリアは、2つの異なる集団を持つCD45 ⁺ およびCD11b ⁺ として同定されました:静止ミクログリアのCD45^{low-CD11b int} と活性化ミクログリアのCD45^int -CD11b^high 。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6.フローサイトメトリーによるミクログリアマーカー発現プロファイルの特性化(A)CD80、CD86、およびiNOS発現に基づくCD45 ⁺ CD11b⁺細胞の逐次ゲーティング。(B)CD206を発現するサブセットの同定、それに続くArg1発現に基づくゲーティング。(C)CD86を発現するサブセットの同定、続いてCD64発現に基づくゲーティング。(D)CD163を発現するサブセットの同定、続いてCD206発現に基づくゲーティング。これらのゲーティング戦略は、表面および細胞内マーカーの発現に基づくミクログリア集団の表現型の不均一性を示しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図7:シングルセルRNAシーケンシングデータにおける Itgam および Ptprc 発現を使用したミクログリアの同一性の確認。 UMAPは、小脳細胞の転写状況をP15で表示し、 Itgam と Ptprc の遺伝子発現がクラスター全体に重ねられています。これらの標準骨髄マーカーの共発現は、ミクログリア集団の同定をサポートし、フローサイトメトリーで使用されるマーカーと一致し、トランスクリプトーム分析とタンパク質レベル分析の間のクロスバリデーションを提供します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図8:単一細胞RNAシーケンシングによって同定されたミクログリア細胞における選択された免疫関連遺伝子の発現プロファイル。 バイオリンプロットは、個々のミクログリア細胞にわたる CD80、 NOS2、 Mrc1、 Arg1、 Fcgr1、 およびCD163 の遺伝子発現の分布を示しています。これらのマーカーは一般に免疫関連プロセスに関連しており、ミクログリア集団内で観察される転写の不均一性を示しています。対照と小脳損傷 (CBI) の両方の状態についてのデータが示されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:神経細胞の単離と染色に使用される溶液の組成。 この表は、細胞の単離と染色に必要な溶液の詳細な組成を、それぞれの濃度と成分を含めて示します。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表2:細胞外染色の抗体混合濃度。 この表は、細胞外染色に使用される抗体と生/死溶液の濃度を詳述し、1つのサンプルの染色ミックス中の各抗体に必要な容量と希釈度を指定します。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表3:細胞内染色のための抗体混合濃度。 この表は、細胞内染色に使用される抗体の濃度を詳述し、1つのサンプルの染色ミックス中の各抗体に必要な量と希釈度を示しています。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

Discussion

この研究は、出生後早期の脳発生中のミクログリア細胞の単離と特性評価のために、フローサイトメトリーと単一細胞RNAシーケンシング(scRNA-seq)を組み合わせた詳細で最適化されたプロトコルを提示します。フローサイトメトリーは依然として費用対効果が高くアクセスしやすい技術ですが、単一細胞トランスクリプトミクスとの統合により、タンパク質レベルのマーカー発現と遺伝子レベルの転写プロファイルを結び付けることで、補完的な洞察が得られます。このプロトコルは、効率的な解離、破片とミエリンの除去、最適化された免疫染色戦略など、未熟な脳組織に特有の技術的課題に対処し、主要な発生時点にわたるミクログリア集団の分析における再現性と信頼性を確保します。

フローサイトメトリーを使用して、選択された表面マーカーおよび細胞内マーカーの発現に基づいてミクログリアサブセットを同定しました。機能状態を推測するのではなく、サブセットは、CD80⁺/CD86⁺/iNOS⁺ などのマーカー発現プロファイルによって区別されました。CD206⁺/Arg1⁺ ;CD86⁺/CD64⁺ またはCD163⁺/CD206⁺ 表現型これらのマーカー定義集団は、ミクログリアコンパートメント内の分子の不均一性を反映し、ハイスループット特性評価のための実用的なアプローチを提供します。これらの表面マーカーベースの分類は、ミクログリアの多様性の複雑さを完全に捉えていない可能性がありますが、特に高次元の分子ツールが利用できない状況では、有益な情報を提供します。最近の文献¹²で説明されているように、ミクログリア表現型のスペクトルのような文脈依存的な性質を認識して、M1 / M2パラダイムなどのバイナリ分類は意図的に避けられてきました。

これらの観察は、正常な脳の成熟と環境的または病理学的刺激への反応の両方におけるミクログリアの役割を強調した以前の研究と一致しています^13,14。ミクログリアの不均一性を区別する能力は、ミクログリア細胞の分極が神経発達障害にどのように寄与するかについての貴重な洞察を提供します^15,16。

単一細胞RNAシーケンシングは、より高い分解能を提供し、転写的に異なるミクログリア細胞亜集団の同定を可能にしますが、そのコストと分析の複雑さにより、アクセスしやすさが制限されます。周産期損傷後の出生後15日目に収集された現在のデータセットでは、炎症反応のピークはほぼ解消されており、その結果、活性化されたミクログリアの数が少なくなります。その結果、UMAPなどの次元削減技術では、十分に分離されたミクログリアサブクラスターを回収できず、クラスターレベルの転写分析はこのプロトコル原稿に含まれていませんでした。

このプロトコルの重要な革新は、出生後初期段階(P3〜P30)に小脳からミクログリア細胞を単離および特徴付けするための最適化です。この領域と年齢固有の状況には、細胞収量の低下、ミエリン含有量、組織の脆弱性の増加など、明確な課題があります。これらの制約に対処するために、このプロトコルは、適応された解離ワークフロー、効率的な破片とミエリンの除去、および少量の小脳組織に適した慎重に調整された免疫染色条件を統合しています。小脳ミクログリアは、機能的および転写的に他の脳領域のミクログリアとは異なるものとして認識が高まっているにもかかわらず、それらの分離と分析のための詳細なプロトコルは依然として限られています。現在の方法は、特に小脳ミクログリアの発生研究に合わせた、信頼性が高くアクセスしやすいワークフローを提供します。

この原稿の主な目的は、特定の生物学的発見を報告するのではなく、再現可能で適応性のある方法論的枠組みを提供することです。このワークフローは、転写的に異なるミクログリア状態がより顕著になる可能性のある他の発生段階または実験モデルへの適応に適しています。このような状況では、フローサイトメトリーは、特に補完的なアッセイと統合した場合、依然として貴重なツールです。

このプロトコルの主な強みの 1 つは、生後 3 日目 (P3) から生後 30 日目 (P30) までのさまざまな発達段階にわたる適応性です。これにより、脳の成熟が進むにつれてミクログリアの表現型を縦断的に分析することができます。フローサイトメトリーとscRNA-seqを併用することで、表面マーカーだけでなく、ミクログリア細胞に関与する細胞内シグナル伝達経路や転写因子の研究も可能となります。

それにもかかわらず、酵素消化は一部の表面マーカーの発現に影響を与える可能性があり、特定の実験目標^17,18のために消化条件を慎重に最適化する必要があります。さらに、フローサイトメトリーも単一細胞シーケンシングも集団レベルのデータを提供できないため、ネイティブ環境内でのミクログリア細胞相互作用の空間的および機能的ニュアンスを完全に捉えられない可能性があります。単一細胞空間技術を組み込むと、ミクログリア細胞の空間的コンテキストを維持することで、この制限に対処するのに役立つ可能性があります。このプロトコルを免疫組織化学、in vivoイメージング、ウェスタンブロット、または単一細胞空間トランスクリプトミクスなどのイメージング技術と組み合わせた将来の研究は、ミクログリア細胞の動態に関する補完的な洞察を提供する可能性があります。

この方法は、炎症、低酸素症、環境ストレス要因などの幼少期の傷害がミクログリア細胞の表現型にどのように影響し、長期的な神経発達転帰に寄与するかを調査するための新たな道を開きます。ミクログリア細胞の活性化状態の正確かつ信頼性の高い特性評価を可能にすることで、神経発達障害の予防または軽減を目的として、幼少期のミクログリア応答を調節する治療標的の特定を容易にします。

結論として、このプロトコルは、脳の初期発生中のミクログリア細胞の多様性を研究するための堅牢でアクセスしやすいフレームワークを提供します。フローサイトメトリーと単一細胞 RNA シーケンシングの組み合わせにより、さまざまな発生段階や実験モデルにわたる柔軟な適用が可能になり、生理学的および病理学的状況の両方におけるミクログリア生物学のより深い探索が容易になります。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
140 & マイクロ;Mメタルメッシュフィルター 	シグマ・アルドリッチ	S3895
15mLチューブ	ザルシュテット	62.554.205
5mLチューブ	ザルシュテット	55.526.006
円錐形の底 を備えた96ウェルプレート。	ザルシュテット	82.1583.001
アルギナーゼ1 - Conjugate Pecy7 - クローン:A1exF5	サーモフィッシャーサイエンティフィック	25-3697-82
卓上安定性蛍光試薬	インビトロゲン	A49905
CD11b - コンジュゲートフィック - クローン : M1/70	BDファミンゲン	553310
CD163 - コンジュゲートSB600 - クローン : TNKUPJ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	63-1631-82
CD206 - コンジュゲートAPC - クローン : C068C2	バイオレジェンド	141708
CD45 - コンジュゲート A700 - クローン : 30-F11	BDファミンゲン	560510
CD64 - コンジュゲート PerCP-eF710 - クローン : X54-5/7.1	サーモフィッシャーサイエンティフィック	46-0641-82
CD80 - コンジュゲートSB436 - クローン:16-10A1	サーモフィッシャーサイエンティフィック	62-0801-82
CD86 - コンジュゲート Pe - クローン : GL-1	バイオレジェンド	105008
コラゲナーゼD	シグマ–オールドリッチ	11088866001
DNase I	シグマ–オールドリッチ	10104159001
ウシ胎児血清(FBS)	シグマ–アルドリッチ	F1051
HBSS(ハンクの平衡塩溶液)10x	Wisent Bioproducts	311506CLの
血球計算器	VWRインターナショナル	82030-470
ヘペス	Wisent Bioproducts	330.050.EL
iNOS - コンジュゲートPE- eF610 - クローン : CXNFT	サーモフィッシャーサイエンティフィック	61-5920-82
KCl	サーモフィッシャーサイエンティフィック	BP366-500
KH2PO4	サーモフィッシャーサイエンティフィック	BP362-500
ライブ/デッド・アムシアン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	L34957
ミクログリア細胞培養培地	ライフテクノロジー	A12475-01
Na2HPO4	サーモフィッシャーサイエンティフィック	BP332-500
NaCl	サーモフィッシャーサイエンティフィック	BP358-212
パラホルムアルデヒド	シグマ–アルドリッチ	P6148
ラット抗マウスCD16/CD32	BDバイオサイエンス	553142
サポニン	シグマ–アルドリッチ	S7900
scRNAseqライブラリー	10倍ゲノミクス	1000121
シリカ系コロイド媒体	サーモフィッシャーサイエンティフィック	45001747
アジ化ナトリウム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	BP922I-500
トリパンブルー	ギブコ	1525006