このプロトコルでは、てんかんの治療のためのユニークな抗てんかん化合物を特定するための ショウジョウバエ の幼虫の使用について詳しく説明します。
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この記事について
サマリー
要約
てんかんは、薬物抵抗性の人の数が多いために悪化する重大な健康負担を呈しています。薬剤抵抗性の患者の中には、非薬物治療(迷走神経刺激療法、ケトン食療法など)に反応する人もいますが、多くの人にとって最後の手段は、発作を緩和するための困難で高価な手術です。一般に、より幅広い標的を持つ抗てんかん薬が必要であると認識されていますが、それを実現するためのハードルは、新規薬剤の標的の特定です。遺伝的に扱いやすいモデル動物は、この点で有望です。ショウジョウバエ( Drosophila melanogaster)は、発作のメカニズムとより良い治療法を調査するための強力なモデルとなっています。多くの同定されたハエの突然変異は、幼虫と成虫が強い刺激(電気的、機械的、および/または熱的)に反応して発作のような活動を示す結果となります。これらの突然変異の多くは、ヒトの遺伝的てんかんの原因となる遺伝子と相同な遺伝子(電位依存性Na+ チャネルなど)に存在します。また、ハエの遺伝子を、さらに疾患関連の突然変異を持つヒトの遺伝子に置き換えることも可能になりました。このように、謙虚なハエは人間の病気をモデル化するためのアバターになりました。この研究では、 ショウジョウバエ の幼虫を低から中程度のスループットの薬物スクリーニングに使用して、抗発作性を持つユニークな化合物とその標的を特定するための適切な方法について説明します。
概要
てんかんは依然として大きな健康上の負担であり、世界の人口の約1%が罹患しています。現在、臨床治療のために30種類以上の抗てんかん薬(ASM)が存在しますが、てんかん患者の約3分の1は依然として薬剤抵抗性であり、薬物治療にうまく反応しないことを意味します1,2。また、利用可能な薬物は緩和薬に過ぎず、そのため、てんかんの発生を予防することも、治療法を提供することもできません3。したがって、より良いてんかん治療を特定することが非常に重要です。より効果的な治療法の開発を阻むのは、新規薬剤の標的の特定です。実際、現在のASMのほとんどすべてが、電位依存性ナトリウムチャネル(Nav)を含むイオンチャネルや、γ-アミノ酪酸(GABA)4,5によって媒介される抑制性神経伝達など、同様の標的に影響を与えています。従来の医薬品開発方法を継続的に使用しても、このシナリオが根本的を変える可能性は低いと一般に認められています。
ショウジョウバエDrosophila melanogaster、およびゼブラフィッシュ
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プロトコル
この研究では、ショウジョウバエ( Drosophila melanogaster)が使用されています(詳細については、結果のセクションを参照)。この手法は、徘徊するサードインスター幼虫(L3)に最適です。実験プロトコルは比較的単純ですが、完璧にするには練習が必要です。私たちの経験では、新入生はアッセイを習得するのに約2週間かかり、他の経験豊富な研究者がカメラ対応の解剖顕微鏡などを使用してリアルタイムでアッセイを実行するのを見ることで大きなメリットが得られます。この研究で使用した試薬と機器は、 材料表に記載されています。
1.幼虫の選択
- 標準的な食品(5 Lの水、390 gのブドウ糖、360 gのトウモロコシ、250 gの酵母、40 gの寒天、135 mLのニパギン、15 mLのプロピオン酸)が入ったハエのバイアル/ボトルの側面から幼虫を採取します。.
- 活発に動いていて、餌を離れて容器の側面を這い上がった幼虫のみを使用してください(さまよう3番目のインスター、L3)。移動が大幅に減少する前蛹を選択しないでください。
2.電気ショックの手順
- 1つのさまようL3....
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結果
多数のショウジョウバエの突然変異は、発作様の振る舞いを増強する7,20。これらの突然変異の遺伝的基盤はさまざまであり、これはヒトてんかんの同様に多様な遺伝的原因を好意的に模倣しています。最も研究されているショウジョウバエの突然変異の3つは、parabangsenseless(parabss)、julius seizure(jus)、およびeasy-shocked(eas)です。パラbss変異は、麻痺性電位依存性Na+チャネルの機能獲得をもたらし、easはエタノールアミンキナーゼをコードし、jusはまだ同定されていない膜タンパク質である(jusは最近までスラムダンスと呼ばれていたことに注意.......
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ディスカッション
ショウジョウバエの幼虫に発作を誘発する電気ショック法は、新規の抗てんかん化合物や遺伝子操作を特定するためのシンプルでありながら効率的なスクリーニングを提供します。しかし、これは定性的なアッセイであるため、その主な制限は、この方法では小さな効果サイズを容易に特定できないことです。それにもかかわらず、研究者1人あたり週に最大~5種類の化合物をスクリーニングできる中程度のスループットにより、非常に強力な全動物アッセイが得られます。この手法のシンプルさは、学部レベルの研究室プロジェクトにも適しています。したがって、3〜4人の研究者は、比較的短時間で多くの化合物をスクリーニングでき、同等のマウス発作アッセイを使用するよりもはるかに少ない費用でスクリーニングできます。アッセイの自動化により、スループットがさらに向上します。しかし、この研究ではこれに成功しませんでした。寒天内に2つの電極が埋め込まれたリチウム含有寒天培地は、複数の幼虫に同時に衝撃を与える試みられましたが、成功しませんでした。他の方法、おそらく光遺伝学に基づく方法は、自動化により適しているかもしれない.......
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開示事項
著者は、競合する利益を宣言しません。
謝辞
この技術を長年にわたって共同開発してきた多くのベインズ研究所のスタッフ、特にこの技術を堅牢で信頼性の高いものにするために多大な努力を払ったリチャード・マーリーに感謝します。 図2に示す幼虫を描いたAnna Munroに感謝します。この技術の開発に貢献したベインズ研究室での研究は、BBSRC、MRC、およびウェルカムトラストから寛大な支援を受けています。この研究は現在、R.A.B. (Grant 217099/Z/19/Z) への Wellcome Trust 研究者賞からの資金提供によってサポートされています。この技術の開発は、大学とウェルカム・トラスト(Grant 087742/Z/08/Z)からの資金提供によって設立されたマンチェスター・フライ・ファシリティ(Manchester Fly Facility)からも恩恵を受けた。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 電極ホルダー | ワールドプレシジョンインスツルメンツ | M3301 | |
| ガラスキャピラリー | ハーバード・インストゥルメンツ | GC100F-10 | |
| タングステン線(99.95%) | グッドフェロー ケンブリッジ、英国 | 直径0.1mm | |
| 電圧刺激装置 | Digitimer Ltd、英国 | DS2A mkII | 定電圧絶縁刺激装置 |
参考文献
- Fiest, K. M., et al. Prevalence and incidence of epilepsy: A systematic review and meta-analysis of international studies. Neurology. 88 (3), 296-303 (2017).
- Knezevic, C. E., Marzinke, M. A. Clinical use and monitoring of antiepileptic drugs. J Appl....
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再版と許可
