競合的酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を用いた固形組織中の環状グアノシン一リン酸(cGMP)の測定

サマリー

このプロトコルでは、競合的酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を使用して、固体組織中の環状グアノシン一リン酸(cGMP)濃度を測定します。このプロトコルでは、固形組織の処理方法、競合ELISAの実施方法、吸光度をピコモル/ミリリットル単位のcGMP濃度に変換する方法、および最終濃度を組織グラムあたりのcGMPナノモルとして計算する方法を説明しています。

要約

環状グアノシン一リン酸(cGMP)を産生する主要な経路は、一酸化窒素(NO)-cGMP経路です。この経路では、NOは可溶性グアニルシクラーゼ(sGC)の触媒活性を刺激し、グアノシン三リン酸をcGMPに変換します。NOは、哺乳類では、主要な血管拡張薬、血小板凝集の阻害剤、免疫機能のメディエーター、神経伝達物質として作用し、身体活動中の持久力を改善するなどの生理学的役割の中でも特に作用するため、興味深いものです。さまざまな組織におけるNOの存在量を測定することは、その機能の解明に役立つ可能性があります。ただし、NOは半減期が数秒未満であるため、直接測定することはできません。通常、NOの代謝産物である硝酸塩と亜硝酸塩は、NOの存在量を推定するために測定されます。これは、これらの分子が酸化還元反応を通じて in vivo で相互変換できるためです。NOの存在量を推定するあまり一般的ではない方法では、NOの下流のシグナル伝達分子であるcGMPの濃度を測定する必要があります。しかし、臓器におけるNOの機能をよりよく理解する可能性を生み出しているにもかかわらず、組織内のcGMPの測定はほとんど行われていません。したがって、固形臓器や組織におけるcGMP濃度を測定するためのプロトコルが必要です。このプロトコルでは、採取したブタ組織を均質化し、処理されたサンプルに対して競合ELISAを実施し、吸光度を元の組織1グラム当たりのcGMPのナノモルに変換しました。要するに、このプロトコルは、サイクリックGMP ELISAキットを使用して固形組織のcGMP濃度を測定するための単純な方法を説明しています。

概要

環状グアノシン一リン酸(cGMP)は、一酸化窒素(NO)-cGMP経路を介して生理学的変化を誘導することができるシグナル伝達分子です。NO-cGMP経路では、NOは、グアノシン三リン酸をcGMPに変換する細胞質酵素である可溶性グアニルシクラーゼに結合し、その触媒活性を高めます^1,2。その後のcGMP濃度の増加は、血管拡張を促進するシグナル伝達経路を^{活性化し3}、in vivoでのNOの存在に特徴的な主要な生理学的反応である血圧^4,5の低下につながります。また、一酸化窒素は免疫機能⁶に影響を与え、身体活動中の持久力^{を向上させる4}、血小板凝集を阻害することで血液凝固を予防する⁷ことが知られています。

NOを直接測定することは、ほとんどの生体組織におけるin vivo⁸の半減期が数秒未満であるため、困難になります。そのため、NOの生理的影響を解明するためには、その存在量をex vivoで測定する方法が必要です。したがって、使用可能な定量法では、NOの直接測定を回避できます。組織内のNO濃度を推定する一般的な方法は、NOのより安定した代謝物である亜硝酸塩と硝酸塩4,5,9,10,11を測定することです。NOの存在量の尺度として亜硝酸塩と硝酸塩の濃度を使用することの主な問題は、両方の代謝物がそれぞれNO前駆体と貯蔵分子としても機能することです。NOの代謝物、特に硝酸塩は、特定の食品に豊富に含まれています。したがって、cGMP濃度の変化(cGMPはNOの下流にある)は、活性NOの量を推定するのに有用であり、NOの存在量は、以前に存在した亜硝酸塩と硝酸塩の干渉なしに決定できます。

これまでの研究では、血漿¹² および血小板¹³のcGMP濃度の測定に依存していましたが、固形組織におけるcGMP濃度の測定はあまり一般的ではありません。固形組織におけるcGMP濃度を測定する能力により、特定の臓器におけるNOの活性の特性評価が可能になります。その目的は、競合ELISAを使用して固形組織のcGMPを測定するための簡便な方法を特定することでした。競合ELISAを使用する利点の1つは、NOに関心のあるほとんどの研究室で一般的に見られる機器、例えば他の目的によく使用されるマイクロプレートリーダーが必要なことです。これに対し、他のいくつかの測定方法は、顕微鏡^14、15、シンチレーション^{カウンター16}、または^{レーザー17}のように、NOに焦点を当てた実験中には使用頻度の低い機器を必要とする。そのアクセシビリティに加えて、競合するELISAによるcGMPの測定は敏感です。cGMP濃度は、cGMP/mL¹⁸の0.1ピコモル(pmol)まで検出できます。cGMP ELISAキット(Table of Materials)プロトコル¹⁸を若干変更するだけで、競合ELISAを使用して固形組織のcGMPを測定する方法が確立されました。

プロトコル

すべての動物処置は、NIDDK動物管理および使用委員会によって承認された分子医学部門動物研究プロトコル(ASP K049-MMB-23)に従って実施されました。組織採取は、MedStar Health Research InstituteのInstitutional Animal Care and Use Committee(プロトコル番号:2006001373 2020-017)が定めたガイドラインに従って行われました。この研究では、生後3か月、体重30〜35kgの若年成人ヨークシャー交配豚(雄2頭と雌2頭)が使用されました。 図1 は、cGMP ELISAキットプロトコルの手順を示す概略図を示しています。この試験で使用された試薬および機器は、 材料表に記載されています。

図1:プロトコルの概略図。 cGMP ELISAキットプロトコルの手順を示す概略図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

1. 組織サンプル調製

注:組織は、収集前にヘパリンナトリウム溶液で灌流し、使用前に-80°Cで保存しました。組織サンプルの収集の詳細については、Park et ^al.19 を参照してください。

1. 組織サンプル処理
   1. 手順を開始する前に、組織粉砕機、ピンセット、スプーンでドライアイスで10分間冷やします。
   2. 粉砕中に一部が失われる可能性があるため、余分な組織の重量を量ります(約90%)。
      注:以前は、170 mgを超えると成功した結果が得られました。.必要に応じて、質量を増減できます。組織質量が、組織サンプルのアセチル化および組織サンプル希釈ステップに十分なサンプル量をもたらすことを確認します。
   3. ドライアイスの上の粉砕機にティッシュを追加します。
   4. 液体窒素で組織を急速凍結し、液体窒素を完全に気化させます。
   5. 粉砕機の蓋を元に戻し、木槌で15回叩きます。
      注:粉砕機のセットアップが利用できない場合、または使用できない場合は、サンプルを冷凍または少なくとも氷上で冷蔵しながら、はさみまたはメスを使用してできるだけ小さく切断する必要があります。このステップは良好な均質化を保証し、特に硬い組織にとって非常に重要です。
   6. ビーズホモジナイザーチューブを風袋引きし、冷やしたスプーンとピンセットを使用して粉砕した組織をチューブに移します。
   7. ビーズホモジナイザーチューブに添加した組織の質量を記録し、後で濃度をモル濃度から質量あたりのモル数に変換します。サンプルを氷の上に保ちます。
   8. 均質化チューブに、ミリグラム単位の組織質量の倍数に等しい0.1N塩酸のマイクロリットル単位の容量を追加します。
      注:適切な希釈により、測定されたサンプルは標準曲線に落ちます。これらの希釈液は、試行錯誤を通じてさまざまな組織タイプで見つかります。以前の実験では、骨格筋組織を1:10の希釈比で、肝臓組織を1:5の希釈比で成功させました。参考までに、100 mg の組織を希釈する場合、1:10 の希釈比には 1,000 μL の 0.1 N 塩酸が必要であり、1:5 の希釈比には 500 μL が必要です。
   9. ビーズミルホモジナイザーまたは同等の技術を使用して、組織サンプルをホモジナイズします。
      注:氷を使用した均質化中にサンプルを冷やすことがあります。ビーズミルホモジナイザーが利用できない場合は、回転式ホモジナイザーまたは超音波ホモジナイザーの使用を含め、細胞を効果的に破壊し、組織ホモジネートを生成する他の均質化方法を代用することができる。
   10. ホモジネートを17,000 x g の速度で30分間遠心分離し、サンプル温度を4°Cに保ちます。
       注:希釈が不十分な骨格筋組織のホモジネートは、過度に粘性があり、ゲル状になります。これは、遠心分離後に最もよく見られます。
   11. 上清を微量遠心チューブに移し、4°Cの温度を維持しながら、上清を17,000 x g で10分間遠心分離します。
   12. 上清のアリコートを微量遠心チューブに移し、サンプルを氷上に保ちます。
       注:250 μLの上清のアセチル化により、良好な結果が得られました。プロトコールを一時停止するには、これらのサンプルを-80°Cで凍結し、最大48時間保存します。アセチル化プロセスの上清の量は、アセチル化の日に測定することをお勧めします。

2. 標準試料作製

注:ELISAマイクロプレート調製当日に標準試料を準備してください。

1. ELISAバッファー調製
   1. 解凍した10x ELISA緩衝液を、90 mLの超純水が入ったガラス瓶に加えます。
      注:調製したELISAバッファーで残留10x ELISAバッファー濃縮物をすすぎ、バッファーをガラス瓶に戻すように注意してください。4°Cで最大2か月間保管してください。
2. 標準的なストック調製
   1. 1 mLのELISAバッファーを標準バイアルに加え、振とうして溶解します。
      注:4°Cで最大6週間保管してください。
3. 標準段階希釈
   1. チューブに標準 B をラベル付けし、9 本のチューブに標準 0 から標準 8 のラベルを付けます。
   2. 9.9 mLのELISAバッファーを標準Bとラベル付けしたチューブに加えます。
   3. 標準ストック100μL(300 pmol/mLのcGMP)を標準Bチューブに移し、完全にボルテックスします。
   4. 標準Bチューブ中の溶液1,000μLを標準1チューブに移します。
   5. 500 μLのELISAバッファーを標準0のチューブに加え、標準2のラベルのチューブを標準8に加えます。
   6. 標準1をボルテックスし、次に500μLの溶液を標準1から標準2に移します。
   7. 標準2をボルテックスし、次に500μLの溶液を標準2から標準3に移します。
   8. 標準n-1から標準nに500μLを移し続け、添加するたびに標準を徹底的にボルテックスします。
   9. 標準8から500μLの溶液を廃棄します。
      注:最適な標準曲線に指定されている場合は、必ずボルテックス標準を使用してください。標準試料0〜8の容量は500 μLです。標準試料は、使用するまで4°Cで保存してください。希釈日に標準物質を使用してください。

3. アセチル化

注:アセチル化反応中に、cGMP分子の2'ヒドロキシル基にアセチル基が付加され、cGMPの構造が修飾され、抗体の結合親和性が増加し、アッセイ感度が~10倍向上します。1.0 pmol/mLを超えるcGMPを含むサンプルでは、アセチル化せずに測定を行うことができ、このステップを省略できます。アセチル化の必要性は、ケースバイケースで実験的に決定されるべきです。

1. 水酸化カリウム製剤
   1. 水酸化カリウムボトルに10mLの超純水を加えて、4M溶液を作ります。
      注意: 水酸化カリウムが溶解するので、ボトルに蓋をしないでください。室温で数ヶ月間保管してください。
2. 組織サンプルのアセチル化
   1. サンプルの250 μLアリコートに、50 μL(5:1)の4 M水酸化カリウムを加え、その後すぐに12.5 μL(20:1)の無水酢酸を添加します。
   2. 15秒間渦巻きます。
   3. 12.5 μLの4 M水酸化カリウムをサンプルに加え、短時間ボルテックスします。
   4. オプション:アセチル化ステップ後に骨格筋サンプルが固化した場合は、サンプルを17,000 x g で10分間遠心分離します。
3. 標準のアセチル化
   1. 標準0とラベル付けしたチューブに、4 M水酸化カリウム100 μLを加え、直後に無水酢酸25 μLを加えます。
   2. ボルテックスを標準で15秒間。
   3. 25 μLの4 M水酸化カリウムを標準試料に加え、短時間ボルテックスします。
   4. 残りの番号付き標準に対して、これらの手順を繰り返します。
      注:一貫した結果が得られるように、すべてのサンプルと標準試料を同じ期間ボルテックスします。

4. 組織サンプルの希釈

1. あらかじめ決定された比率のELISAバッファーとアセチル化サンプルのアリコートを微量遠心チューブに加えます。
   注:各サンプルには2つの異なる希釈が必要です。測定したcGMP濃度が標準曲線に下がる原因となる希釈比は、試行錯誤によって見つけられます。希釈率は、 の割合が20%から80%の間に収まるように、組織の種類ごとに実験的に決定する必要があります。肝臓組織を測定する以前の実験では、1:2および1:3の希釈比により、適切な 率の値で成功した結果が得られました。これらの比率は、骨格筋にも成功した結果をもたらしています。ただし、骨格筋組織の変動により、より希釈されたサンプルが必要になる場合があります。
2. オプション:組織サンプルをELISAバッファーに添加すると沈殿物が形成された場合は、サンプルを17,000 x gで10分間遠心分離します。

5. ELISAマイクロプレートの調製

1. アセチルコリンエステラーゼ(AChE)トレーサー調製
   1. AChEトレーサーバイアルに6mLのELISAバッファーを加え、穏やかに振とうして溶解します。
      注:サンプルは4°Cで最大2週間保存してください。渦巻きにしないでください。
2. 抗血清製剤
   1. 6 mLのELISAバッファーを抗血清バイアルに加え、穏やかに振とうして溶解します。.
      注:4°Cで少なくとも4週間保管してください。渦巻きにしないでください。
3. サンプルと標準インキュベーション
   1. ボルテックス標準0。
   2. ELISAマイクロプレートに、標準0〜5ウェルの50μLアリコート(NSBおよびB₀; 図 2)。
   3. 2つの井戸(NSB; 図2)標準0を含む場合は、50 μLのELISAバッファーを添加します。
   4. 1つのピペットチップを使用して、標準1〜8の50μLアリコートをELISAマイクロプレートに二重に加えます。最も希釈度の高い標準試料(標準品8)から始めて、次に最も希釈度の高い標準試料に進み、すべての標準試料が添加されます。
      注:ウェルに加える前に、各標準試料を数回吸引して分注します。ウェルに追加する前にボルテックススタンダード。
   5. 各サンプルをボルテックスしてから、50 μLのアリコートをウェルに二重または三重に加えます。
   6. 50 μL の AChE トレーサーを各 NSB、B₀、スタンダード、およびサンプルウェルに加えます(図 2)。
   7. 50 μLの抗血清を各B₀、標準、およびサンプルウェルに加えます(図2)。
   8. ELISAマイクロプレートを覆い、4°Cで18時間インキュベートします。
      注意: 一貫した結果を生成するように指示されたときはいつでも、必ずボルテックスしてください。
4. 洗浄バッファーの調製
   1. ガラス瓶に、200 mLの超純水と500 μLの400倍洗浄バッファー濃縮液を加えます。
   2. シリンジを使用して、100μLのポリソルベート20をガラス瓶に加えます。
   3. ボトルを軽く振って混ぜます。
      注:洗浄バッファーは4°Cで最大2か月間保管してください。超純水、400倍洗浄バッファー濃縮液、ポリソルベート20の容量を2倍にすることで、サンプルのフル96ウェルマイクロプレートを作製できます。
   4. 使用前にウォッシュバッファーをウォッシュボトルに移します。.
5. エルマン試薬の調製
   注:ELISAマイクロプレート開発の日を準備してください。
   1. 遮光容器に超純水20mLを加えます。
   2. 超純水のアリコートを使用して、エルマン試薬を溶解します。
   3. エルマン試薬を光保護容器に移します。
   4. エルマンの試薬を使用して、それが来たボトルをすすぎます。.
   5. ピペットを使用して、すべての溶液を光保護容器に戻します。
6. ELISAマイクロプレート洗浄
   1. ELISAマイクロプレートの内容物は、反転させて廃棄してください。ウェルが空になっていることを確認するには、ペーパータオルの上で倒立したELISAマイクロプレートを軽くたたいます。
   2. ウォッシュボトルを使用して、ウェルにウォッシュバッファーを充填します。
   3. ELISAマイクロプレートを5秒間静かに撹拌し、洗浄バッファーを捨てて、ペーパータオルに残った液体を軽くたたいます。
   4. ELISAマイクロプレートに洗浄バッファーを充填し、ELISAマイクロプレートを30秒間穏やかに撹拌し、内容物を廃棄します。これを4回繰り返し、各ダンプの後にELISAマイクロプレートをペーパータオルで軽くたたいて、残りの液体を取り除きます。
      注:ELISAマイクロプレートを徹底的に洗浄することにより、不正確な吸光度の読み取りを防ぎます。
7. ELISAマイクロプレートの開発と読解
   1. エルマン試薬をリザーバーに移します。
   2. 迅速に作業を進め、マルチチャンネルピペットを使用して、200 μLのEllman試薬をブランク、NSB、B₀、TA、標準、およびサンプルウェルに分注します。
   3. 5 μL の AChE トレーサーを TA ウェルに加えます。
   4. ELISAマイクロプレートをパラフィルムで覆い、光保護容器に入れ、攪拌しながら室温で60〜90分間インキュベートします。
      注:B₀ ウェルを適切なインキュベーション時間の指標として使用してください。理想的なB₀ ウェルは、目に見えて黄色く見えますが、暗くはありません。
   5. パラフィンフィルムをはがし、412 nmの光学密度でELISAマイクロプレートを読み取ります。
      注:吸光度が0.3 AUから1.0 AUのB₀ ウェルで、ブランクを差し引いたものは、ELISAマイクロプレートが十分に開発されていることを示しています。
   6. 随意： ELISAマイクロプレートが未発達の場合は、パラフィンフィルムを交換し、光保護容器内でさらに1時間インキュベートします。ELISAマイクロプレートが過剰に現像されている場合は、Ellman試薬を捨て、洗浄バッファーで一度すすぎ、ELISAマイクロプレートをEllman試薬で再現像します。

図2:マイクロプレートのレイアウト。 競合するELISAのマイクロプレートレイアウトの例。NSB は、非特異的結合ウェルを示します。B₀ は、最大結合ウェルを示します。TA は、総アクティビティ ウェルを示します。標準ウェルとそれに対応する番号を示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

6. 濃度への変換

1. バウンドAChEトレーサーの計算
   1. 2つのブランクの吸光度を平均化し、すべてのウェルの吸光度から平均を差し引きます。
      注:残りの計算には、空白から差し引かれた吸光度を使用します。
   2. NSB、B₀、およびブランクウェルの平均吸光度を計算します。
   3. 次の式を使用して、補正された B₀ 吸光度を計算します。
      
      注:Corr.は補正済み、Abs.は吸光度、Avg.は平均を表します。ブランクウェルの平均吸光度(ブランク平均を差し引いたもの)が負の数の場合は、計算にゼロを使用します。
   4. 次の式を使用して、各標準試料とサンプルの 比を計算します。
      
   5. 各サンプルの 比に 100 を掛けて、 パーセントを計算します。
      注:20%から80%のサンプルは標準曲線に該当します。
2. 標準曲線の計算
   1. 各スタンダードの重複ウェルの 比(1〜8)を平均します。
   2. 次の式を使用して、各規格の平均 比のロジットを計算します。
      
   3. 各標準(表1)の既知の濃度をX値として、各標準のロジット をY値として使用して、傾きとY切片を計算します。
   4. 既知のcGMP標準濃度のlog₁₀ をX値、各標準のlogit をY値として使用して、決定係数を計算します。
      注:決定係数が1に近いことを確認します。
3. cGMP濃度の計算(pmol/mL)
   1. 次の式を使用して、各サンプルのロジット を計算します。
      
   2. 各サンプル中のcGMPの濃度(サンプル1ミリリットルあたりのcGMPのピコモル単位)を計算するには、次の式を使用します。
      
      注:DRは希釈率の略です。塩酸の希釈比1:5で希釈した肝臓サンプルのホモジネートD.R.合計は6に等しくなります。ELISAバッファーの1:2希釈比で希釈した肝臓サンプルのバッファーD.R.合計は3に等しくなります。したがって、角かっこでグループ化された項には 18 が乗算されます。
4. cGMP濃度の計算(nmol/g)
   1. ウェルあたりのcGMPのナノモルを次の式で計算します。
      
   2. 各アセチル化サンプルの組織のグラム数を次の式で計算します。
      
      注:「mg of tissue」は、ホモジナイゼーションチューブに添加された組織の質量(ミリグラム)です。「HCl使用量」は、均質化のためにサンプルを希釈するために使用した0.1N塩酸の量です。
   3. ELISAバッファーで希釈した各サンプル中の組織のグラム数を、次の式を使用して計算します。
      
      注:「希釈されたサンプルの量」は、ELISAバッファーによって希釈されたサンプルの量です。「250μL」は、アセチル化されたサンプルの容量です。記載されている「試薬」とは、アセチル化試薬4 M KOHおよび無水酢酸です。
   4. ウェルあたりの組織のグラム数を次の式で計算します。
      
      注:「バッファー容量」とは、サンプルをウェルに添加する前に組織サンプルを希釈するために使用されるELISAバッファーの容量です。
   5. ウェルあたりのcGMPのナノモルをウェルあたりの組織のグラム数で割って、cGMPの濃度をnmol / gで計算します。

標準番号	cGMPの濃度(pmol/mL)
スタンダード1	3.0
スタンダード2	1.5
スタンダード3	0.75
スタンダード4	0.375
スタンダード5	0.1875
スタンダード6	0.09375
スタンダード 7	0.046875
スタンダード 8	0.0234375

表1:標準濃度。 標準物質1〜8の既知の濃度。

結果

食事性塩化ナトリウム(0.15 mmol / kg)または ¹⁵N標識硝酸塩(0.15 mmol / kg)で処理したヨークシャーの家畜豚を、1日1回、5日間連続してチョウのボーラスとして投与し、組織採取前にヘパリンナトリウム(0.9%塩化ナトリウム)溶液で灌流しました。コレクションのすべての詳細は以前に公開されました¹⁹。4匹のヨークシャーの家畜豚の臀筋と肝臓のcGMP濃度は、記載されたELISAプロトコルに従って測定されました。肝臓組織を1:5の希釈比で希釈し、臀筋を1:10の希釈比で希釈し、0.1 N塩酸(HCl)でタンパク質を沈殿させました。HClで希釈したホモジネートをアセチル化した後、肝臓と臀筋の両方のサンプルについて、ELISAバッファーで1:2および1:3の希釈比で希釈しました。cGMP濃度は上記のように測定した。吸光度は、調製されたサンプルのミリリットルあたりcGMPのピコモルに変換され、次に上記のプロトコルに記載されているように、組織のグラムあたりcGMPのナノモル(組織nmol / g)に変換されました。

肝臓組織で測定したcGMP濃度は、上記の条件下で最適な実験結果をもたらしました。ブタ肝臓の対照群および硝酸塩処理群のcGMP濃度は、組織0.0202 nmol / g±0.003 nmol / g、組織0.0364 nmol / g±0.011 nmol / gです(図3)。いくつかの値によって、結果の信頼性が確認されます。ブランクを差し引いた B₀ ウェルの吸光度は 0.466 から 0.475 で、0.3 AU から 1.0 AU の範囲に収まり、Ellman 試薬による十分なマイクロプレートの発達が実証されています。標準曲線の高品質は、標準 1 から標準 8 への吸光度の増分と、0.99 の決定係数によって検証される標準曲線の線形性の両方によって示されます。測定されたすべての井戸の 率(31.5%-71.2%)は20%から80%の間であり、すべてのサンプルが標準曲線上にあることが実証されています。記載されている特性を持つサンプルは、解釈に適しています。

臀筋組織で測定されたcGMP濃度は、最適ではない実験結果をもたらしました。臀筋ウェルのパーセント 値のほとんど(3.69%-27.3%)が20%を下回ったため、吸光度が標準曲線に収まるためには、より希薄なサンプルが必要であったため、最適でないラベルが臀筋の結果に割り当てられています。ブタ大臀筋の対照群と硝酸塩処理群のcGMP濃度は、組織1.22 nmol/g 1±0.49 nmol/g、組織0.732 nmol/g ±0.18 nmol/gです(グラフは示していません)。臀筋サンプルは、肝臓サンプルのB₀ ウェルと標準の吸光度を共有します。これらの最適でないサンプルを使用すると、誤った結論が生じる可能性があります。したがって、より希釈されたサンプルの調製とcGMP濃度の再測定が必要です。

図3:肝臓組織におけるcGMP濃度。 塩化ナトリウム(0.15 mmol / kg)または ¹⁵N標識硝酸塩(0.15 mmol / kg)で処理したブタ肝臓の平均cGMP濃度(組織nmol / g)。n = 4;エラーバーは標準偏差を示します。データはウェルチのt検定によって分析されました。ns は意味がありません。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

このプロトコルは、競合ELISAを使用して固形組織中のcGMP濃度を測定するために必要な手順に関する指示を提供します。cGMP濃度の変動は、組織内のNOの存在量の違いを示している可能性があります。これらの固形組織の違いを調べることで、さまざまな臓器のNOに関する情報を解明することができます。

このプロトコルでは、組織サンプルを最初にELISAに備えてホモジナイズしました。これは、固い組織の塊を瞬間凍結し、次にそれを粉砕することから始まりました。均質化ステップの前に組織を分解することは、ビーズホモジナイザーが細胞を溶解するのを助けることを目的としています。組織は0.1N塩酸でホモジナイズしてタンパク質を沈殿させたが、これは他の方法でも用いられた技術^{である20,21}。最後に、固体と沈殿物を遠心分離によって可溶性成分から分離しました。標準曲線を作成するために、cGMPのストック(300 pmol of cGMP/mL)を段階希釈して、8つの異なる標準を作製しました。標準試料とサンプルをアセチル化して、0.1 pmol の cGMP/mL までの濃度を検出することにより、アッセイの感度を向上させました。この感度の増加は、アセチル基がcGMPと結合し、各抗体(抗血清中に存在する)がアセチル化されたcGMPに結合する能力を改善するときに達成されます¹⁸。スタンダードとサンプルの両方をアセチル化することで、ウェル間のcGMP結合の均一性が確保されます。マイクロプレートウェル内のcGMP濃度が1.0 pmol/mLを超えると予想される場合は、標準試料とサンプルの両方でアセチル化ステップを省略できます¹⁸。

ウェルへのサンプルの添加に備えて、サンプルをELISAバッファーでさらに希釈しました。追加の希釈により、サンプルは標準曲線上に収まり、NSB、B₀、および標準ウェルの内容物により近くなり、均一性が生まれました。サンプルと標準試料に加えて、他のいくつかの溶液がウェルで混合されます。NSBウェルでは、ELISAバッファー(アセチル化試薬の有無にかかわらず)を添加し、抗血清を差し控えます。これは、抗血清を構成する特異的抗体が存在しない状態でウェルに付着したマウスIgGに結合するAChEトレーサー(cGMPに結合したアセチルコリンエステラーゼ)の量を決定するためのものです。B₀ ウェルには、ELISAバッファー(アセチル化試薬を含む)、AChEトレーサー、および抗血清が含まれていました。したがって、B₀ ウェルは、cGMPの競合なしにAChEトレーサーの結合能力を示します。すべてのウェルが適切に充填された後、マイクロプレートをインキュベートし、洗浄します。エルマンの試薬が井戸に加えられました。最後に、Ellman試薬を添加したかなり後に、AChEトレーサーをTAに加えました。これは、抗体によってマイクロプレートにどれだけトレーサーが結合したかに関係なく、AChEトレーサーの触媒活性をよく表しています。マイクロプレートは室温で現像され、AChEトレーサーが比色反応を触媒することを可能にしました。

プロトコルのいくつかのステップにより、アッセイの結果が変わる可能性があります。最適な結果を得るには、次の手順を実行する際に特に注意する必要があります。ホモジナイズステップおよびアセチル化後における各組織タイプに適した希釈液の同定は、サンプルが標準曲線上に収まることを保証するために必要です。標準試料を調製する際は、アリコートを除去する前、またはアリコートを添加した後、溶液を十分にボルテックスまたは混合する必要があります。このステップは、各標準物質の予想されるcGMP濃度に到達するために重要です。アセチル化ステップでは、一貫した吸光度測定値を達成するために、各標準試料とサンプルを同じ時間ボルテックスする必要があります。標準試料とサンプルは、適切なウェルにアリコートを追加する直前にもボルテックスする必要があります。この方法により、より正確なcGMP濃度が得られます。マイクロプレートを徹底的に洗浄すると、ウェルから未結合のAChEトレーサーがすべて除去されるため、吸光度値の精度も向上します。Ellman試薬を添加した後、マイクロプレートが発達するのに十分な時間を確保し、色、そして最も重要なのはB₀ ウェルの吸光度に注意を払う必要があります。重複または三重の検体間のcGMP濃度は、高濃度の検体と比較して、cGMPレベルが低い検体ではより異なる可能性があることを認識することが重要です。より濃縮されたサンプルを測定すると、この問題に対処するのに役立つ場合があります。さらに、マイクロプレート間のばらつきを考慮するために、可能な限り、同じ組織タイプのサンプルを同じプレートで測定する必要があります。これらのガイドラインに従うことで、アッセイの結果データの品質が向上することが期待されます。

上記のプロトコールは、他の軟質の固形組織に外挿することができます。上記のプロトコルの組織調製サブセクションのさらなる開発は、その血管性のために興味深い骨を含む硬組織を処理するのに適した方法をもたらすかもしれない。この技術の継続的な開発により、多種多様な固形組織におけるcGMP濃度の測定に適した方法が得られる可能性があり、その結果、事実上あらゆる組織におけるNOの存在量に関する追加情報を収集するための有用な方法が生まれる可能性がある。上記の競合ELISAプロトコルは、cGMPを測定し、NOの存在量を推定するための有用な手法ですが、2つの顕著な制限があります:(1)このアッセイは、可溶性グアニルシクラーゼによって合成されたcGMPと微粒子グアニルシクラーゼ(pGC)によって合成されたcGMPを区別しません。ナトリウム利尿ペプチドはpGC活性を刺激する²² 、したがって、この経路を介したcGMPの変化は、NOの存在量の変化を示すものではない。(2)さらに、ホスホジエステラーゼ(PDE)酵素がELISAアッセイの結果に影響を与えます。いくつかのPDEはcGMPを加水分解し、NO²³によるsGCの刺激後にその濃度を低下させます。したがって、PDEの触媒活性は、cGMP濃度とNOの存在量との関係を不明瞭にする可能性があります。cGMPの損失を防ぐためにシルデナフィルなどのPDE5阻害剤を追加することは、cGMP濃度の傾向を観察するための測定値を得るのではなく、主に正確なcGMP濃度を得ることに焦点を当てた実験に推奨されます。PDE5阻害剤は、サンプル収集の約1時間前にシルデナフィルとして動物に投与することができます(効果は最大4時間²⁴続きます)またはそのような投与が不可能な場合は、シルデナフィルを収集したサンプルに追加することができます。.組織採取後にPDEを阻害する場合は、シルデナフィルの存在下で組織が均質化されるように、0.1N塩酸にシルデナフィルを添加します。.シルデナフィルの有無にかかわらず、動物治療とシルデナフィルとの間にクロストークがないことを確認するために測定を行う必要があります。.

その制限があっても、このアッセイは、NOシグナルの下流の伝達に関する有益な洞察として使用されます。結論として、固形組織におけるcGMP濃度の測定を他のNO測定方法と組み合わせることで、臓器におけるNOの影響をより深く理解することができます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1 mL BD 透明経口シリンジ	ベクトン・ディキンソン	50382903052177
14 mL 丸底試験管	隼	352059
2.0mlマイクロチューブ、アソート	オリンパスプラスチック	24-283A
30-300 & マイクロ;L マルチチャンネル ピペット	エッペンドルフ	3125000052
無水酢酸(cGMPキット内)	ケイマンケミカルカンパニー	400031	98%純度 Hazard:可燃性、腐食性:皮膚の重度の火傷、目の損傷、急性毒素 安全な取り扱い:発火源から遠ざけ、換気の良い場所で作業し、手袋を着用してください
cGMPアセチルコリンエステラーゼトレーサー(cGMPキット内)	ケイマンケミカルカンパニー	481020	リン酸二塩基性カリウム、塩化ナトリウム、 リン酸カリウム一塩基性、ウシアルブミン、アジ化ナトリウム、EDTA、cGMP AChEトレーサー Hazard:健康被害:反復暴露による臓器毒性、 腐食性:目の損傷、 皮膚および呼吸器刺激物 安全な取り扱い:換気された場所での作業、 手袋を着用する
cGMP ELISA抗血清(cGMPキット内)	ケイマンケミカルカンパニー	481022	リン酸二塩基性カリウム、塩化ナトリウム、 リン酸カリウム一塩基性、ウシアルブミン、 アジ化ナトリウム、EDTA、ウサギ抗cGMPポリクローナル抗血清 Hazard:健康被害:反復暴露による臓器毒性、 腐食性:目の損傷、 皮膚および呼吸器刺激性、急性毒性 安全な取り扱い:換気の良い場所で作業し、手袋を着用してください
cGMP ELISA標準物質(cGMPキット内)	ケイマンケミカルカンパニー	481024	リン酸二塩基性カリウム、塩化ナトリウム、 リン酸カリウム一塩基性、ウシアルブミン、 アジ化ナトリウム、EDTA、cGMP規格 Hazard:健康被害:反復暴露による臓器毒性、 腐食性:目の損傷、 皮膚および呼吸器刺激物 安全な取り扱い:換気の良い場所で作業し、手袋を着用してください
サイクリックGMP ELISAキット	ケイマンケミカルカンパニー	581021
ELISA バッファー濃縮物 10X (cGMP キット中)	ケイマンケミカルカンパニー	400060	1 Mリン酸塩、1%BSA、4 M塩化ナトリウム、10 mM EDTA、0.1%アジ化ナトリウム Hazard:健康被害:反復暴露による臓器毒性、 腐食性:目の損傷、 皮膚および呼吸器刺激物 安全な取り扱い: 換気の良い場所で作業し、蓋を閉める容器に保管し、手袋を着用してください
ELISA試薬リザーバー	ピアース(現サーモフィッシャーサイエンティフィック)	15075
Ellman's Reagent(cGMPキット入り)	ケイマンケミカルカンパニー	400050	リン酸二塩基性カリウム、塩化ナトリウム、リン酸一塩基性カリウム、アセチルチオコリン(ヨウ化物)、5,5'-ジチオビス-(2-ニトロ安息香酸) Hazard:急性毒性、健康被害:臓器毒性、腐食性:眼の損傷、皮膚刺激物、再生性刺激物 安全な取り扱い:換気の良い場所で作業し、手袋を着用してください。
塩酸	シグマ・アルドリッチ	320331	<強い>危険性:腐食性:金属を腐食し、皮膚をひどく火傷する、目の損傷、呼吸器刺激物 <強い>安全な取り扱い:換気の良い場所で作業し、手袋を着用してください
液体窒素	ロバートの酸素		窒素 Hazard: 圧縮ガス: 極低温火傷、凍傷、窒息の危険性 安全な取り扱い: 換気の良い場所で作業し、手袋を着用してください
マウス抗ウサギIgGコーティングプレート(cGMPキット内)	ケイマンケミカルカンパニー	400006	危険: なし
ニュークラシックMFバランス	メトラー・トレド
オービタルシェーカー	ストーバルライフサイエンス株式会社(現IBIサイエンティフィック)	15-453-211 (変動あり)
パラフィルム	株式会社ベミスカンパニー	3023-4526 (変動あり)
ポリソルベート 20 (cGMP キット内)	ケイマンケミカルカンパニー	400035	危険: なし
水酸化カリウム(cGMPキット内)	ケイマンケミカルカンパニー	400029	85%純度 危険性:腐食性:金属や皮膚を腐食し、 目の損傷、急性毒性 安全な取り扱い:換気の良い場所で作業し、手袋を着用してください
Precellys Evolution ホモジナイザー	ベルタンテクノロジーズ	PE000062-PEVO0-A
Precellys 溶解キット硬組織均質化	ベルタンテクノロジーズ	P000911-LYSK0-A
Sense マイクロプレートリーダー	ハイデックス	425-301
Sorvall Legend Micro 17R 遠心分離機	サーモフィッシャーサイエンティフィック	75002441
ティッシュ粉砕機	セルクラッシャー	セルクラッシャーキット
ボルテックス・ジーニー2	科学産業	SI-0246
ウォッシュボトル	シグマ・アルドリッチ	Z423092
洗浄バッファー濃縮物 400X (cGMP キット入り)	ケイマンケミカルカンパニー	400062	リン酸二塩基性カリウム、リン酸一塩基性カリウム、水 Hazard:腐食性:眼の損傷、急性毒性、皮膚刺激性、臓器毒性 安全な取り扱い:換気の良い場所で作業し、手袋を着用してください