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方法論記事

低酸素症は、マウスの自閉症スペクトラム障害の非メンデル遺伝に関与するmiRNAレベルを変化させます

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DOI:

10.3791/68435

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2025年7月11日

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1Gevher Nesibe Genome and Stem Cell Institute, Erciyes University, 2Betül Ziya Eren Genome and Stem Cell (GENKÖK) Center, Erciyes University, 3Department of Medical Biology, Erciyes University, 4Department of Histology and Embryology, Yozgat Bozok University, 5Department of Physiology, Erciyes University, 6Department of Obstetrics and Gynecology, Faculty of Medicine, Erciyes University, 7University of Nice Sophia Antipolis, 8Department of Medical Genetics, Erciyes University

この記事について

サマリー

ここでは、新生児マウスをさまざまな酸素濃度の制御された環境で送達することにより、低酸素症を誘発するプロトコルを紹介します。出生時に酸素変動を受けたマウスモデルは、自閉症などの行動表現型変化の誘導に関与するmiRNAの発現を永続的に変化させています。

要約

低酸素症は、周産期にさまざまな理由でさまざまな程度で発生する可能性があり、発達に影響を及ぼします。私たちは、マウスにおける軽度から重度の新生児低酸素症の影響を調べることを目指しています。自閉症スペクトラム障害(ASD)に関連する神経変性胎児の脳機能障害との潜在的な関連に焦点を当てています。

新生仔マウスを酸素濃度の異なる制御された環境で送達することにより、低酸素症を誘発しました。その結果、大脳皮質と海馬におけるHIF-1α(低酸素症のマーカー)のレベルが上昇し、これらの領域で神経変性が増加したことが示されました。さらに、ASD関連miRNA(miR-19a-3p、miR-361-5p、miR-150-5p、miR-126-3p、miR-499a-5p)の低酸素群での発現変化が観察され、ASDのヒトおよび動物モデルにおける以前の結果と一致しました。これらの分子変化は、低酸素状態のマウスにおいて、運動、速度、社会的相互作用、反復行動の減少などの行動変化を伴い、またコーナー探索行動を示す傾向の増加を伴いました。行動的および分子的変化は12%O2 グループ(軽度の低酸素症)で検出できましたが、最も顕著な変化は、10%O2 および8%O2のより深刻な低酸素グループで観察されました。

全体として、結果は、新生児の低酸素症が神経変性疾患に関連する持続的な分子変化を誘発し、行動に影響を与える可能性があることを示唆しています。さらに、正常な出産であっても、初期の発達中に低酸素症にさらされると、記憶と学習が損なわれる可能性があります。この結果は、長期的な神経学的問題を予防するために、低酸素症にさらされた新生児の早期発見と介入の必要性を強調しています。miRNAのレベルは発生中に制御され、組織、特に生殖細胞におけるmiRNAの修飾は、次世代のリスク因子を構成します。この解析は、低酸素下での機能的および行動的変化に影響を与える調節経路を研究するための基礎となります。

概要

低酸素症は、酸素欠乏状態と定義され、さまざまな病状におけるその役割を理解するために重要な独特の細胞および分子応答を引き出すことができます。İtは発生シーケンスを混乱させ、分子、細胞、およびニューロンの変化や損傷を引き起こす可能性があります。さらに、低酸素症への早期曝露は中枢神経系(CNS)の発達を中断し、軸索接続とシナプスの発達を損ないます1。

さらに、低酸素症はCNSの発達に悪影響を与えることが示されていますが、胚発生中などの特定の条件下でも重要な生理学的役割を果たす可能性があります。正常な生理学的低酸素症とは、胚発生中に酸素レベルが自然に低い状況を指します。このプロセスにより、胚細胞は嫌気性代謝を促進することでエネルギーを生成することができ、血管新生を促進することで循環器系の発達をサポートし、心臓と骨の適切な発達を確保し、神経堤細胞の移動を刺激します2。逆に、生理学的状況外で発生する低酸素症は、胚発生を含む発生や全体的な健康に悪影響を与える可能性があり、未熟児や胚致死につながる可能性があります1。したがって、多くの新生児が通常の分娩中に低酸素状態を経験し、多くの場合、介護者や医療関係者によってすぐに認識されないため、これは主要な公衆衛生問題です3。さらに、低酸素症に関連するニューロン接続の交代は、自閉症スペクトラム障害(ASD)や知的障害などの神経発達障害に関連しています1。

分子的な観点から見ると、低酸素症はシナプス機能を調節する遺伝子の発現を変化させることで神経発達に影響を及ぼし、それによってニューロンの接続を乱し、神経発達障害の発症に寄与する可能性があります4。

臨床的には、新生児低酸素症はホルモンおよび代謝経路を介してCNSの発達に影響を与えます1。急性低酸素症に応答して、視床下部はコルチコトロピン放出ホルモンとアルギニンバソプレシンを急速に放出し、それが下垂体前葉からの副腎皮質刺激ホルモン放出を引き起こし、続いて胎児副腎皮質でグルココルチコイド産生を引き起こし、この応答の程度は低酸素症の強度と持続時間と相関しています。.急性ストレスに対する視床下部-下垂体-副腎(HPA)軸のこの迅速な応答は、ストレスの生理学的影響を制限し、関連する遺伝子発現、タンパク質合成、および細胞代謝に影響を与えることにより胎児の恒常性を維持するグルココルチコイドの重要な役割を強調しています5,6。

正常な酸素レベルが低下すると、低酸素症に対するさまざまな反応が活性化されますが、そのほとんどは転写因子、低酸素誘導因子(HIF)、およびプロリルヒドロキシラーゼ(PHD)1などの細胞性酸素センサーによって制御されます。HIF-1は、in vitro試験7で示されているようにO2恒常性の調節因子であり、HIF-1αとHIF-1β8からなるヘテロ二量体である。低酸素条件下では、水素原子が錯体中のヒドロキシル基に置換されることで、HIF-1αが蓄積し、HIF-1βと二量体化します。その結果、HIF-1二量体は核に移動し、そこで数百の遺伝子の転写を活性化します1。

ニューロンは酸素に依存するため、特に低酸素ストレスの影響を受けやすくなります。したがって、低酸素症は、軸索経路探索とシナプスの発達を損なうことにより、脳の生理機能に大きな影響を与え、ニューロン機能に長期的な影響を与える可能性があります9。ニューロン接続のこれらの変化は、ASDや知的障害などのさまざまな神経発達障害の素因となる可能性があります9,10。

周産期仮死は、分娩中の酸素欠乏と定義され、母体胎児の出血、臍帯圧迫、胎盤合併症、子宮破裂、肩甲難産、新生児の初呼吸の失敗などの周産期イベントの結果として発生する可能性があります。この深刻な出来事は、毎年世界中で約400万人の新生児に影響を及ぼし、11,12,13人の新生児が死亡しています。ほとんどの乳児は低酸素症のエピソードを生き延びますが、一部の患者は低酸素性虚血性脳症を発症し、発作障害、脳性麻痺、認知遅延、運動障害などの永続的な神経学的問題を引き起こす可能性があります。さらに、窒息や虚血は、CNS(28%)、心血管系(25%)、腎臓(50%)、肺(23%)など、さまざまな臓器やシステムの機能不全を引き起こす可能性があります11。

さらに、脳血管系の未熟さと自己調節不良は、新生児を虚血リスクにかかりやすくする要因です。このようなプロセスでは、炎症と酸化ストレスが新生児の低酸素性虚血性損傷と関連する細胞死メカニズムの主なメディエーターです。異常なアポトーシスは、発達中の脳を運動障害や認知障害のリスクにさらす可能性があります14。

ASDの複雑さを考えると、ポリジーン構造を持っているように見える根本的な遺伝学と、その発生を決定する環境要因を理解することが不可欠です。特に、ASDのポリジーン基盤は、遺伝的素因が低酸素症を含む外部要因と相互作用する多因子性病因を意味します。一卵性双生児で観察された60%-92%の一致は、遺伝的影響の重要性を強調していますが、不一致は環境要因も役割を果たしていることを示しています。自閉症の有病率は10,000人中13人と推定されており、この割合は近年増加していると考えられています15。研究は、妊娠中の環境要因への曝露が自閉症のリスクを高める可能性があるという仮説を支持していますが、これらの研究の結果は、診断基準、比較グループ、サンプルサイズ、および曝露評価方法の違いにより、しばしば一貫性がありません15,16。

特徴的な神経病理学的所見は不明ですが、研究により、微視的で機能的な脳の異常が明らかになりました。これらの異常は、病因学的に関連する期間が子宮内にある可能性があり、発症は出生前の期間に始まる可能性があることを示唆しています15。妊娠中の曝露は、自閉症の潜在的な危険因子に関する疫学研究の主な焦点です。特に、産科合併症がASDのリスクを高める可能性があるという仮説は多くの研究によって支持されていますが、これらの影響の大きさと結果は研究によって異なります17。

遺伝的要因に加えて、エピジェネティックなメカニズムは、低酸素条件下での遺伝子発現の調節に重要な役割を果たします。特に、miRNAは、HIFへの影響など、低酸素症に対する細胞応答における重要な制御メカニズムを示しています。 低酸素症の初期段階では、miRNAレベルの特定の変化がHIF-1の蓄積とHIF-2およびHIF-3の安定レベルの維持に寄与する可能性があります18。多くのmiRNAの発現プロファイルは低酸素および虚血条件下で変化しますが、限られた数の低酸素関連miRNAが機能的役割を果たし、HIF発現に影響を与えることが示されています。これは、組織特異的なmiRNA発現により、異なるヒト組織で低酸素応答が異なる理由を説明しています18。

また、新たなデータでは、特定のmiRNAがASDの病理に関与していることが示されています。また、これまでの研究で、がんにおける細胞の生存、分化、ストレス応答を調節することが知られているmiR-19a-3p、miR-361-5p、miR-150-5p、miR-126-3p、miR-499a-5pが、ASD患者では異常な発現を示し、神経発達の転帰に影響を与える可能性があることを実証しました。次に、ASDのマウスモデルからの血液、視床下部、および精子サンプルでこれらの知見を確認し、遺伝子調節の変化と疾患との一貫した関連を示しました19。これらの結果は、成長と発達の重要な段階でのこれらのmiRNAのダウンレギュレーションが、ASDなどの疾患の発症に大きな影響を与える可能性があることを示しています。これは、新生児の低酸素症が分子的および行動的特性に及ぼす深い影響をさらに示しています。

この研究では、軽度から中等度の新生児低酸素症が成人期の自閉症を発症するリスクに与える影響をテストしました。これを行うために、新生児マウスをさまざまなレベルの低酸素症に曝露しました。実際、出生時に低酸素症を経験したマウスは、成人期に行動の変化を示し、さらに重要なことに、分子レベルではASDに関連する変化を示します。このように、私たちの結果は、低酸素症の長期的な影響に関する貴重な情報を提供しました。

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プロトコル

すべての実験プロトコルは、Erciyes大学(HAYDEK)のローカル動物実験倫理委員会によって承認され、ライセンス番号21/216の下で実施されました。

1.動物被験者

注:この研究は、Erciyes大学のBetül-Ziya EREN Genome and Stem Cell Center(GENKÖK)のトランスジェニックユニットの Balb / c マウスを対象としました。

  1. 平均体重18〜25 gの生後2か月のBalb / cマウスを使用します。マウスを20±2°Cの温度、湿度52±3%に12時間の明暗サイクル(6〜18時間)で維持します。
  2. マウスに標準的なマウスペレットを与え、毎週寝具を交換し、餌と水に無制限にアクセスできるようにします。
    注:分子研究は、GENKÖKのゲノミクスおよび低酸素研究所、およびボゾク大学の組織学および発生学研究室で行われました。「STOPポイント」は、指定された温度で作業を一時停止して保存できる場所を示します。

2. 低酸素モデルの構築

  1. 3つの低酸素対照群と1つの偽対照群を含む4つのグループを含むように実験を設計します。
  2. 健康な雌マウスを健康な雄マウスと交配させて健康な妊娠雌マウスを形成し、最終的には次のグループに分類されます:重度の低酸素症(8%O2)(n = 4)、中等度の低酸素症(10%O2)(n = 4)、軽度の低酸素症(12%O2)(n = 4)、および正常酸素症(21%O2)を偽対照群(n = 4)。
  3. 低酸素症を誘発するには、妊娠中のマウスを低酸素症研究所に移し、E21.5 日の 72 時間前にモニタリングを開始します。
  4. 低酸素群の妊娠中マウスの送達点を検出し、直ちに低酸素チャンバーにマウスを配置します。各グループの説明に従って、各チャンバーの酸素レベルを調整します(ステップ2.2に示されています)。
  5. 新生児を低酸素状態で5分間だけ保管し、その後すぐに通常の飼育状態に移します。
    注:被験者を低酸素状態に長期間保持すると、致死的となる可能性があります。
  6. 各グループから2人の新生児(ランダムに選択)を使用して、低酸素症による損傷を確認し、性別を決定します。残りの子犬は、成体期のための追加の分子的および行動的試験のために、授乳期間が終了するまで母親の隣に通常の住居条件で保管します( 補足図1の実験デザインを参照)。

3.新生児期の性別間の低酸素効果の潜在的な違いを評価するための性別決定

  1. 各マウス(ランダムに選択(x2 /グループ))を個別に体重を量り、麻酔薬の必要な投与量を計算します。ケタミンを100 mg / kgで、キシラジンを10 mg / kgで腹腔内に投与します。.
  2. マウスが完全に麻酔されたら、子宮頸部脱臼による安楽死を進め、直ちに滅菌標識された1.5 mLチューブ(STOPポイント、-80°C)に尾組織を採取します
  3. すべての脳組織を直ちに収集し、10%ホルムアルデヒドを含む遠心分離管に移し、さらなる分析を行います(STOPポイント、25°C)。
  4. DNA抽出用の組織を調製します。
    1. テールサンプルを調製し、25°Cで解凍します(必要な場合)。1 M Tris、0.5 M EDTA、4% SDS、dH2O、およびプロテイナーゼKを含む300 μLの溶解バッファーをサンプルに加えます。
  5. サンプルを均質化します。
    1. ボルテックスでサンプルを十分に混合し、55°Cで一晩インキュベートします。
    2. 翌日、酢酸アンモニウム100μLを加え、ボルテックスして短時間混合します。12,000 g で20分間、25°Cで遠心分離します。
  6. 位相分離を実行します。
    1. 透明な水相を新しい滅菌ラベル付き1.5 mLチューブに慎重に移します。
    2. 500 μLのイソプロパノールを加え、25 °C(STOPポイント、-20 °C)で5分間インキュベートします。12,000 g で25°Cで10分間遠心分離します
  7. DNAペレットを洗浄します。
    1. チューブの底にあるペレットを検査した後、上清を慎重に捨てます。
    2. 1000 μLの70%エタノールを加え、チューブを軽くたたいてペレットを浮かせます。7500 g で25°Cで10分間遠心分離します
  8. DNAを精製します。
    1. チューブの底にあるペレットを検査した後、上清を慎重に捨てます。
    2. 10μLのマイクロピペットを使用して残留エタノールを除去し、完全に乾燥させます。
    3. 100 μLのヌクレアーゼフリー水(NFW)を加えて、ペレットを再懸濁します。+4°Cで10〜15分間インキュベートします。
  9. DNAを定量化して保存します。
    1. 分光光度計を使用してDNA濃度を測定します。DNAサンプルは、さらに使用するまで+4°Cで保存してください。(STOP ポイント)。
  10. ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行います。
    1. SRY-F、SRY-R、および間接的なPAX6-F、PAX6-Rプライマーを設計します(補足表1を参照)。
    2. 5 μL の PCR バッファー (10x)、4 μL の MgCl2 、4 μL の dNTP、4 つのプライマーのそれぞれ 0.5 μL 、31 μL の dH2O、および 0.5 μL の Taq ポリメラーゼを (サンプルあたり) 調製します。
      注:Taqポリメラーゼは、最適な増幅を確保するために、使用直前および使用直前に添加する必要があります。
    3. ラベル付きのPCRチューブを調製し、+4°Cの冷却ラックに置きます。混合物の45μLをチューブに分配します。
    4. ブロックを軽くたたいて、PCR混合物の液滴がチューブの底にあることを確認します。
    5. 5 μLのDNAサンプルを加え、短時間ピペットで披露します。短時間ボルテックスしてから、チューブを遠心分離します。
    6. チューブをPCRマシンにセットし、プログラムを次の条件に設定します:最初に、95°Cで5分間インキュベートし、94°Cで1分間の変性を40サイクル行い、57°Cで45秒間アニーリングし、72°Cで1分間伸ばします。サイクル後、72°Cで10分間延長し、その後40°Cで無期限に保持します。
  11. 2%アガロースゲル電気泳動を使用して結果サンプルを視覚化します。
    注:2つのバンドを示すサンプルは男性であり、1つのバンドのみを持つサンプルは女性です。

4. 新生仔マウスにおける低酸素障害の確認

  1. 犠牲マウスから採取した脳組織を顕微鏡で評価し、低酸素損傷を確認し、免疫組織化学的にHIF-1αを試験します。
    1. 組織を固定し、パラフィンを埋め込みます。
      1. 組織をホルムアルデヒドで12時間保存し、次に水で6時間洗浄します。
      2. エチルアルコールシリーズで各濃度(70%、80%、90%、100%エチルアルコール中で3時間)で1日間脱水することにより、組織を固定します。ティッシュをキシレンに15分間入れて透明にします。
      3. 組織をパラフィンシリーズI、II、およびIIIにそれぞれ1時間移します。3時間後、脳サンプルの向きを適切に整え、きれいなパラフィンに埋め込みます。
      4. 回転式ミクロトームを使用して、パラフィンブロックから厚さ5 μmの切片を切り取ります。
    2. スライドを準備します。
      1. ヘマトキシリンおよびエオシン(HE)の染色には、切片をプレーンなスライドガラスの上に置きます。
      2. 免疫組織化学の場合は、正に帯電したスライドガラス上に切片を配置します。
        注:(STOPポイント)、スライドはこの段階でアーカイブして、さらなる評価と作業を行うことができます。
    3. HE染色を行います。
      1. サンプルをキシレンI溶液に10分間浸漬します。
      2. サンプルをキシレンII溶液にさらに10分間浸漬します。
      3. サンプルを一連の減少するアルコール濃度に、それぞれ100%、96%、および80%の1分間移します。
      4. サンプルを蒸留水で2分間洗浄します。
      5. サンプルをヘマトキシリンに8分間浸し、次に蒸留水で2分間洗浄します。
      6. 洗浄後、サンプルを酸性アルコールで1秒間処理し、続いて1分間洗浄します。
      7. サンプルをアンモニア水に10秒間入れ、1分間の洗浄を繰り返します。
      8. サンプルを70%アルコールに30秒間入れます。
      9. サンプルをエオシンに10分間浸します。
      10. アルコール濃度をそれぞれ1分間(96%、96%、100%)上げて、サンプルを徐々に移します。
      11. サンプルをキシレンI、キシレンII、およびキシレンIII溶液にそれぞれ1分間浸漬します。
      12. カバースリップで覆います。
    4. 顕微鏡で調べます。
      1. HE染色後、各グループの脳組織全体を光学顕微鏡で調べます。
      2. ニューロンの変性および細胞周囲/血管周囲浮腫について、海馬および皮質領域を評価します。
  2. HIF-1α染色を行います。
    1. 正に帯電したスライド上のサンプルをインキュベーター内で67°Cで一晩インキュベートし、適切な固定を確保します。
    2. 切片をキシレンIおよびキシレンII溶液に通して、脱パラフィンを完了します。
    3. 切片を100%、96%、80%、70%のエタノール溶液にそれぞれ5分間順次入れ、続いて蒸留水で5分間すすいで再水和します。
    4. 0.01 Mクエン酸(pH 6.0)で切片を665 Wでマイクロウェーブし、5分間のサイクルを2回行うことにより、エピトープのマスクを解除します。
    5. 切片を室温(RT)で20分間冷却します。
    6. 疎水性ペンでセクションの周囲に線を描き、次にセクションをPBSで3回、それぞれ5分間洗浄します。
    7. 切片をメタノール中の3%過酸化水素で10分間インキュベートし、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックします。
    8. 切片をPBSで毎回5分間3回再度洗浄します。
    9. 非特異的免疫グロブリンの結合を防ぐため、切片をUVブロッキング試薬で7分間インキュベートします。
    10. 切片を抗HIF-1α一次抗体(希釈度1:200)と4°Cで一晩インキュベートします。
    11. 切片をPBSで毎回5分間3回洗浄します。
    12. ビオチン化二次抗体を切片にアプライし、室温で40分間インキュベートします。
    13. 切片をPBSで毎回5分間3回再度洗浄します。
    14. 切片にストレプトアビジン溶液を塗布し、RTで30分間インキュベートします。
    15. 切片をPBSで3回、毎回5分間洗浄します。
    16. 3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)を塗布し、光学顕微鏡で観察することにより、染色反応を進行させます。
    17. 改質したGill IIヘマトキシリン溶液で切片を対比染色し、核を染色します。
    18. 切片を高濃度のエタノール(70%、80%、96%、100%エタノール)に通すことにより、切片を脱水します。
    19. 切片をキシレンI溶液とキシレンII溶液でそれぞれ10分間インキュベートして、切片を透明にします。
    20. 封入材とカバースリップでセクションを取り付けます。
    21. 光学顕微鏡で取り付けられた切片を検査し、海馬と前頭前野の領域を評価します。
    22. オープンソースの画像処理ソフトウェアを使用して免疫反応性レベルを測定します。

5. 行動実験

  1. 低酸素症の確認後、残りのマウスが母親との授乳期間を完了するのを待ちます。
  2. 出生後21日目に肛門性器の距離に基づいて性別決定を行い、その後、性別に基づいて動物を異なるケージに収容します。低酸素対照群と偽対照群のマウスが生後2か月に達したら、行動実験を行います。
  3. 行動テストを実行する前に、テストの前に被験者をテスト環境に15〜30分間順応させます。
  4. 被験者と試験の間のすべてのデバイス/装置を 70% エタノールを使用して消毒してください。
  5. 新規物体認識(NOR)テストを実行します。
    1. 被写体がはっきりと見え、監視できる位置にカメラを設定します。
    2. 適切なビデオ追跡ソフトウェアをインストールします。
    3. マウスより大きくない 2 つのオブジェクトを使用して、テスト アリーナ (60 cm × 6×0 cm × 40 cm ボックス) を準備します。2 つのオブジェクトが同様のサイズと形状であり、簡単にアクセスできる (壁から 10 cm × 10 cm 離れ、平行) ことを確認してください。
    4. 1日目:習熟期:
      1. 2つの同一のオブジェクトがあるアリーナにマウスを置きます。マウスが一定時間(たとえば、10分)オブジェクトを自由に探索できるようにします。
      2. このセッションでは、マウスが各オブジェクトに費やした時間を観察して記録します。また、マウスが各オブジェクトに向けられた回数、または各オブジェクトと対話した回数を記録します
    5. 2日目:新しいオブジェクトの紹介:
      1. 1日目のおなじみのオブジェクトの1つを新しいオブジェクト(外観、テクスチャ、形状が異なる)に置き換えます。
      2. マウスをアリーナに戻すと、最初のセッションと同じ時間、再び自由に探索できるようになります。
    6. マウスがおなじみのオブジェクト(1日目から)と新しいオブジェクトに費やした合計時間を記録します。マウスが各オブジェクトに向きを変えた回数、または各オブジェクトと対話した回数を記録します。
    7. 識別指数(DI)を計算して、次の式を使用してマウスの記憶と学習を評価します。
      識別指数 (DI) = {(新規オブジェクトと過ごした時間 − 身近なオブジェクトと過ごした時間)/(両方のオブジェクトに費やした合計時間)} × 100.
      注:DIが高いほど、新しいオブジェクトへの関心が高いことを示し、記憶力と学習能力が向上していることを示唆しています。DI が 0 に近い場合は、好みがないことを示し、おなじみのオブジェクトに対する関心が等しいか、記憶力が低いことを示しています。
    8. DIを使用して、マウスの自然な好奇心と、身近な物体と新しい物体を認識し区別する能力に基づいて、マウスの学習能力と記憶能力を客観的に評価します。
  6. テールサスペンションテスト(TST)を実行する
    1. マウスがはっきりと見え、監視できる位置にカメラを取り付けます。適切なビデオ追跡ソフトウェアをインストールします。
    2. 実験装置は、3匹のマウスを同時に収容できるスペースを用意します。
    3. 高さ25cmの段ボールパネルを20cm間隔で使用してマウスを隔離し、テスト中にマウスが互いに見えないようにします。
    4. 長さ12cmのテープを切り取り、各マウスのテールに慎重に取り付け、テールが損傷を与えないようにしっかりと取り付けられていることを確認します。テープをテールの端(2 cm)に配置して、マウスがそれ自体を傷つけずに吊り下げられるようにします。
    5. マウスを吊り下げた状態で6分間記録します。
    6. デュレーションが終了したら、録音を停止し、マウスを取り外して、ハウジングケージに戻します。ビデオを分析して、アクティブな動きの時間と動かない時間を決定します。
      注:不動は学習性無力感またはストレスの状態を示すことが多いため、これはストレス反応への洞察を提供します。不動の程度は、マウスの行動的絶望またはストレス反応を測定するために一般的に使用され、これはストレスまたは抑うつ状態の影響に関連している可能性があります。
    7. 観察された運動と不動のパターンに基づいて、強制停止に応答したマウスの感情状態とストレス対処メカニズムを評価します。
  7. 大理石の埋設試験を行う
    1. 空のケージ(20 cm × 35 cm × 15 cm)に、高さ5 cmのトウモロコシの穂軸を入れます。20個のビー玉を5列に並べ、それぞれに4個のビー玉を配置します。ビー玉が表面全体に均等に分布していることを確認します。
    2. 被写体をケージの隅に置き、ケージ全体に自由にアクセスできるようにします。
    3. マウスがケージを探索するのに20分かかります。この間、マウスはビー玉をトウモロコシの穂軸で覆おうとして、何らかの埋没行動を示すことがあります。20分後、マウスをケージから取り出します。
    4. 20分間にマウスがトウモロコシの穂軸の下に埋めたビー玉の総数を数えます。埋もれたビー玉の総数を記録します。これは行動の重要な尺度です。
      注:埋められたビー玉の数は、げっ歯類の不安、強迫行動、または新恐怖症の指標として一般的に使用されます。埋もれたビー玉の数が多いほど、不安や強迫的な傾向が高くなります。
    5. 埋もれたビー玉の総数に基づいて、マウスの不安関連行動と強迫傾向を評価し、治療や実験条件の効果を評価するために使用できます。
  8. ソーシャルインタラクションテストを実行します。
    1. マウスがはっきりと見え、監視できる位置にカメラを取り付けます。
    2. カメラをコンピューターに接続し、適切なビデオ追跡ソフトウェアをセットアップします。長方形のボックス(60cm×40cm×25cm)と2つの壁(40cm×25cm)と2つのドア(8cm)を設置して、3つのチャンバーを分離します。
    3. 実験対象に馴染みのあるマウスが入ったケージ(15cm×10cm)と、実験対象と以前に相互作用したことのないマウスが入った別のケージ(15cm×10cm)を置きます。
    4. 録音を開始し、被写体を中央のコンパートメントに置きます。
      注:この試験で用いるマウスは、実験動物以外は同性で健康であること。
    5. 被写体を5分間監視し、ビデオカメラで記録します。期間が終了したら、録音を停止し、マウスを取り外してハウジングケージに戻します。
    6. SITソフトウェアを使用して、マウスの社会的相互作用時間と社会的新規性傾向を分析し、それらを偽対照群と比較します。
      注:社会的行動(グルーミングやスニッフィングなど)に費やす時間が増え、攻撃性を避けたり示したりする時間が減ることは、高い社交性を示していると解釈できます。交流を避けたり、孤立して過ごす時間が増えたり、攻撃性が増したりすることは、不安、社会的引きこもり、または社会的に交流する能力の低下を示唆している可能性があります。
  9. オープンフィールドテストを実施します。
    1. マウスがはっきりと見え、監視できる場所にカメラを配置します。カメラをコンピューターに接続し、適切なビデオ追跡ソフトウェアをセットアップします。
    2. テストアリーナ(60cm×60cm×40cmのボックス)を設定し、ボックスを仮想の線で分割して16個の正方形を作成します。
    3. 録音を開始し、マウスをアリーナの中央に慎重に置きます。マウスの行動を5分間観察して記録します。
    4. デュレーションが終了したら、録音を停止し、マウスを取り外して、ハウジングケージに戻します。
    5. 追跡ソフトウェアを使用して、歩行、登山、脱出、グルーミング、不動、全交差、排便、排尿の外部および内部の行動を測定し、被験者の不安、自発運動、探索的、および感情的な活動のレベルを評価します。
  10. モリス水迷路(MWM)テストを実行します。
    1. 直径120cm、深さ60cmの水深60cmの迷路を、23±1°Cの行動実験室で安定した位置に準備します。
    2. 迷路を4つの想像上の象限に分割し、底面から約20cmの迷路の壁の各象限の中央にさまざまな視覚的な手がかり(形と色)を吊るします。長さ17cm、直径10cmのプラットフォームを壁から20cmの位置に配置します。
      注:迷路、キュー、およびプラットフォームは、マウスが正確に記憶を訓練できるように、位置や位置を変更してはなりません。
    3. 迷路をプラットフォームの下1cmまで21〜26°Cの水で満たし、黒い多面アクリル染料で染色します。
      注:他の系統のマウスを使用する場合、水をマウスのコントラストカラーで着色して、マウスを監視できるようにする必要があります。
    4. カメラをフルイメージをキャプチャする位置に置き、コンピューター上のMWMソフトウェアに接続します。
      注:プラットフォームスポットは、5日目のトライアルのプログラムに割り当てる必要があります。
    5. テストは5日間続き、それぞれ4回の試行が行われます。最初の4日間は、記録を開始し、被験者を毎日異なる象限に注意深く配置し、顔をタンクの壁に向けて試験を開始します。
    6. 5日目のテストスケジュールでプラットフォームの場所を割り当てます。
      注:これにより、被験者が連想記憶を形成するのを防ぎます。被験者を水中に注意深く配置し、正しい温度を維持することは、外部ストレスの追加を避けるために不可欠です。トライアルは5分間続き、(i)プラットフォームに到達したとき、(ii)5分の制限時間が経過したときに自動的に終了します。数日かけて、被験者はプラットフォームの場所を学び、より短い時間でそれを見つける必要があります。
    7. 5日目に、プラットフォームを取り外し、前述のようにマウスを迷路の正方形に慎重に配置します。
      注:試用は、(i)マウスがプラットフォームを見つけて足を踏み入れたとき、(ii)5分の制限時間が経過すると自動的に終了します。健康な被験者は、前のプラットフォームの場所を見つける必要があります。このソフトウェアは、各試行でマウスがプラットフォームを見つけるのにかかった時間を自動的に計算し、被験者の短期および長期記憶と学習能力の評価を支援します。

6. 成体マウスの低酸素障害の確認

  1. 行動テストが完了したら、被験者を頸椎脱臼によって犠牲にします。
  2. 分子解析のために、偽対照群を含む各群の6匹のマウスから海馬組織と血液サンプルを採取します(セクション7)。
  3. 残りの4匹のマウスの脳を10%ホルムアルデヒド溶液に入れて、新生児期の低酸素曝露が成体の脳形態に及ぼす影響を調べます。
  4. セクション4で前述したのと同じ手法を用いて、成体マウスの脳の組織学的解析を行います。

7. 成体期サンプルからの全RNA単離

  1. 各組織サンプルに500 μLのトリゾールと500 μLの血液を加えます。
  2. 脳組織の場合は、シリンジを使用してサンプルを均質化します。
  3. 混合物をRTで5分間インキュベートします。
  4. 各チューブに200 μLのクロロホルムを加え、RTでさらに5分間インキュベートします。
  5. 12,000 g で+4°Cで20分間遠心分離します。
  6. 水相(RNA)を新しい滅菌チューブに慎重に移します。
  7. イソプロパノール(水相に対する1:1の比率)を添加し、混合物を一晩インキュベートします。(STOPポイント/ -20°C)。
  8. 翌日、12,000 g で+4°Cで10分間遠心分離します。
  9. 上清を慎重に捨て、ペレットに1000μLの75%エタノールを加えます。
  10. 7,500 × g で+4°Cで5分間遠心分離します。
  11. エタノール洗浄ステップを2回繰り返します。
    注:ペレットが小さすぎる場合は、1回の洗浄で十分です。
  12. 上清を捨て、ペレットをRTで風乾させます。
  13. 完全に乾いたら、ペレットを50 μLのNFWで再懸濁し、氷上で+4°Cで10〜15分間インキュベートします。
  14. RNA濃度を分光光度法で測定します。
  15. RNAサンプルは、さらなる分析まで-80°Cで保存してください。

8. 相補的DNA(cDNA)合成

  1. 冷却+4°Cラックで、血液および脳組織から分離したRNAサンプルを調製します。
  2. 標識されたPCRチューブを準備します。
  3. cDNA合成キットの試薬を製造元の指示に従って混合します。
  4. 各サンプルに合計14μLの反応混合物を調製し、チューブに分配します。
  5. 6 μL の RNA サンプルを混合物に加えます。
  6. PCR装置でcDNA合成は、メーカーが指定した温度および時間条件に従って行ってください。
    注:この段階で合成されたcDNAは、さらに使用するまで-80°Cで保存できます。
  7. 合成したcDNAを1:5の比率で希釈します。
  8. 希釈したcDNAを-80°Cで保存し、将来のqPCR分析に備えます。

9. miRNA(標準化制御としてのmiR-19a-3p、miR-361-5p、miR-150-5p、miR-126-3p、miR-499a-5p、およびU6低核RNA)発現の定量的リアルタイムPCR

  1. 各 miRNA のプライマーを設計します(配列については 補足表 2 を参照)。
  2. PCR反応混合物は、製造元の指示に従って調製します。
  3. 14 μLの反応ミックスを96ウェルPCRプレートの各ウェルに分注します。
  4. 1:5で希釈したcDNAを6 μLを各ウェルに加えると、総反応量は20 μLになります。
  5. 95 °Cで120秒間の初期変性、95 °Cで10秒間の45サイクルの変性、56 °Cで60秒間のアニーリングと増幅、60 °Cで60秒間の融解曲線分析、60 °Cで15秒、次に95 °Cで融解曲線分析を行い、変動を最小限に抑えるために、各サンプルに対してPCRを二重に実行します。
  6. Ct(サイクル閾値)値を使用して結果を分析し、2-ΔΔCt 法を使用してデータを正規化します。

10. 統計解析

  1. .ヒストグラム、Q-Q プロット、Shapiro-Wilk 検定を使用してデータの正規性を評価し、miRNA 発現データを解析します。
    1. データが正規分布している場合は、一元配置分散分析を使用します。
    2. データが正規分布していない場合は、クラスカル・ワリの検定、スチューデントのt検定、またはマン・ホイットニーのU検定を適用します。
  2. 各グループ内の性差を評価するときは、データの分布に応じて、学生のt検定またはマンホイットニーU検定を使用します。統計的有意性は、p値<0.05で求められます。
    注:すべての分析は、適切な統計ソフトウェアを使用して実行する必要があります。ここでは、GraphPad Prism 8を使用しています。
  3. ヒストグラム、Q-Q プロット、および Shapiro-Wilk 検定を使用してデータの正規性を評価し、行動実験の結果を分析します。
    1. データが正規分布している場合は、二元配置分散分析を使用します。
    2. 正規分布していないデータについては、クラスカル・ワリの検定、スチューデントのt検定、またはマン・ホイットニーのU検定を実行します。
    3. データの分布に応じて、学生のt検定またはMann-Whitney U検定を使用して、各グループ内の性差を評価します。ここでも、p値が0.05<場合、結果が統計的に有意であると考えてください。
  4. 免疫組織化学分析では、二元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定を使用して、女性グループと男性グループを比較します。
  5. 各低酸素状態内の女性グループと男性グループを比較するには、Sidakの事後テストを使用します。統計的有意性は、p値が0.05<場合に決定されます。

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結果

本研究では、妊娠中の Balb/c マウスを分娩時に8%O2 (重度)、10%O2 (中等度)、12%O2 (軽度)の低酸素状態に曝露し、これらの低酸素条件下で新生児マウスを5分間維持し、軽度、中等度、重度の新生児低酸素症のモデルを確立した。偽対照群として指定されたグループは、正常酸素(21%O2)の出生条件にさらされ、その後、標準治療条件下での生活が許可されました。これにより、さまざまな酸素レベルがマウスに与える真の影響を分離し、実験結果の妥当性を確保できます。

新生児低酸素モデルを確立した後、新生児の脳における低酸素曝露の影響を検出するために、新生児マウスのグループを免疫組織化学的染色(HIF1αおよびH&E染色)のために犠牲にしました。行動試験は、生後2か月の残りのマウスで行われました。行動試験終了後、マウスを屠殺し、全脳の病理組織学的評価により、海馬および血液サンプル中のmiR-19a-3p、miR-3...

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ディスカッション

周産期低酸素症は、新生児の健康問題であり、重要な発達過程を混乱させることにより、分子、細胞、ニューロンの変化を引き起こす可能性があり、自閉症スペクトラム障害(ASD)1を含むさまざまな神経発達障害と関連しています。重度の低酸素症は、その即時的な影響について広く研究されてきましたが、周産期の軽度から中等度の低酸素症の長期的な影響については、まだ十分に理解されていません。私たちの研究は、新生児低酸素症の神経行動学的および分子的転帰を調べることにより、このギャップを埋めることを目的としており、両方の領域で有意な変化を明らかにしました。これを達成するために、新生児低酸素症のマルチレベルマウスモデルを実行し、続いて包括的な組織病理学的、行動的、および分子的分析を行いました。このプロトコルは、臨床現場で一般的に観察される軽度から中等度の低酸素イベントを再現するように設計されており、致死性は低いですが、それでも長期的な影響を誘発する可能性があります。

このプロトコルの重要なステップ...

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開示事項

著者は、利益相反を宣言しません。

謝辞

この研究は、トルコ科学技術研究評議会(TÜBİTAK)の資金提供を受けており、著者らはCelalettin Göktaş(トランスジェニック動物施設)と生物学者のSelda Taşdemir(行動研究所)に感謝しています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
(-20 & deg;C) 冷凍庫シーメンス KD86NAWE0N
(+4 & deg;C) ブロックアンタジェン・バイオサイエンスhttps://antagen.net/product/384-well-pcr-plate-rack-cat-rkp384/
(+4 & deg;C) 冷蔵庫シーメンス KD86NAWE0N
(-20 & deg;C) ブロッククリーバー・サイエンティフィックhttps://www.cleaverscientific.com/electrophoresis-products/coolcube-storage-rack/
絶対エタノールメルク1070172511
酢酸アンモニウムシグマ238074-500G
分析的均衡 アダム・イクイップメントLAB214i
クロロホルムメルク1024451000
クエン酸 メルク100241
コンピュータHP(馬力発散)https://www.hp.com/us-en/shop/pdp/hp-all-in-one-24-cr1000t-238-9p2v3av-1
EDTAシグマE9884-1KG
エンテラン メルク107961
イオシンメルク109844
エペンドルフ(1.5 mL)?ソラブ078.03.021
エソビジョンシステムノルドゥスhttps://noldus.com/ethovision-xt
エトゥヴヌーヴェEN 400/500 該当なし
ファルコンチューブ(15 mL)アイソラボ078.02.001
ホルムアルデヒドメルク104002
ヒートカメラサムスンSC2000
ヘマトキシリンメルク105175
HIF-1&α;抗体バイオスbs-20398R 
低酸素室 バイオスフェリックスAチャンバー
アイソプロポナルメルク1096342511
ライトサイクラー480 IIロッシュ5015278001
マーブル埋葬テストの檻ヴィシュヌ https://guide.labanimal.com/product/standard-housing-stainless-steel
マイクロ遠心分離機チューブ(1.5 mL)グライナー616201
マイクロピペットチップ(100およびマイクロ;L)グライナー774353
マイクロピペットチップ(1000およびマイクロ;L)グライナー778353
マイクロピペット(10およびマイクロ;L)ギルソンFD10001
マイクロピペット(100およびマイクロ;L)ギルソンFD10004
マイクロピペット(1000およびマイクロ;L)ギルソンFD10003
マイクロピペットチップ(10およびマイクロ;L)グライナー772353
マイクロピペット(2およびマイクロ;L)ギルソンGFAM00064
顕微鏡オリンポスBx53
miRCURY LNA RT KIT(CDNA合成キット)キアゲン339340
miRCURY LNA SYBR Green PCRキットキアゲン339346
マルチウェルプレートロッシュ4729692001
ナノ分光光度計島津C101-E112
ノベル・オブジェクト・レココニトン・テストのアリーナグローバル・バイオテクノロジー137
オープンフィールドテストのアリーナグローバル・バイオテクノロジー117
オキシサイクラー バイオスフェリックスA42OC
パラフィン ライカ 39602012
PBSタブレットシグマP4417-50TAB
PCRデバイスセンソクエストT3-0140
プレートスピンペクラブ91-PSPIN-P
プリズムグラフパッドhttps://www.graphpad.com/
プロテイナーゼKシグマP6556-10MG
QIAzol溶融試薬分離試薬キアゲン79306
SDSシグマ8170342500
セカンダスター抗体 アブカムA0545-1ML
社会的相互作用テストの三つの部屋グローバル・バイオテクノロジー118
スピンギルソンPMC880
注射器(2 mL)バイビhttps://beybi.com.tr/urunler/medikal-urunler/medikal-sarf-malzemeleri/parcali-enjektorler
テールサスペンションテストのセットアップセルフメイド(Self Made)も、ハーバード・アパラタスで似たようなものを見つけることができますセルフメイド、似たようなものは(https://www.harvardapparatus.com/tail-suspension-test.html)で見つかります。
サーモミキサーエッペンドルフ#5355
トリズマ基地シグマ1503-1KG
渦ハイドルフ541-10000-00-1
キシレン Isolab 9,90,01,92,501

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