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方法論記事

単一細胞RNA配列決定のためのダウリアンジリスの肝移植後の管理と検体採取

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DOI:

10.3791/68443

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2025年9月16日

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1Department of Hepatic Surgery and Liver Transplantation Center of the Third Affiliated Hospital, Organ Transplantation Institute, Sun Yat-sen University; Organ Transplantation Research Center of Guangdong Province, Guangdong Province Engineering Laboratory for Transplantation Medicine, 2Guangdong Key Laboratory of Liver Disease Research, the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 3Collage of Life Science, Shenyang Normal University, 4Institute of Organ Transplantation, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology; Key Laboratory of Organ Transplantation, Ministry of Education, Chinese Academy of Medical Sciences, NHC Key Laboratory of Organ Transplantation, 5The School of Life Science, Peking University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルは、ダウリアンジリス(DGS; Spermophilus dauricus)、典型的な季節性冬眠者。これには、予後評価のために肝臓移植片と血液サンプルを採取し、単一細胞ベースの研究のために処理する方法が含まれています。

要約

移植片の機能回復と移植片と宿主の免疫適合性は、肝移植後の主要な予後上の懸念を表しています。重要なことに、ラットまたはマウスを使用した従来のげっ歯類モデルでは、保存中の低体温誘発性移植片損傷のメカニズムについての洞察が限られています。このギャップは、代替モデルの必要性を強調しています。寒さに適応するダウリアンジリス(DGS; Spermophilus dauricus) は長期の低温保存を維持できるため、移植後の DGS の高い生存率をサポートするため、このプロトコルでは、移植された DGS 被験者に必要な重要な術後の動物ケアと生理学的モニタリングについて詳しく説明しています。さらに、トランスクリプトームプロファイリングや組織病理学的検査のための単一細胞RNAシーケンシング(scRNA-seq)など、下流の分析技術用に高品質の肝移植片サンプルを調製するための標準化された手順を提供します。十分に準備された DGS 移植片標本の生成に成功することは、この型破りでありながら関連性の高いモデルを研究するために、従来の方法論と最先端の方法論の両方を適用するための重要な最初のステップです。このプロトコルは、DGSのマルチオミクス情報に対処するため、冬眠中のげっ歯類だけでなく、他の特殊な生物における外科的介入と疾患モデリングに関する将来の研究が促進されます。

概要

過去20年間で、ますます多くの研究者が、冬眠種の優れた適応能力が生物学的適応における新しいメカニズムを明らかにする貴重な機会を提供し、臓器保存や代謝リハビリテーションなどのさまざまな医療分野でブレークスルーを刺激する可能性があることを認識しています1,2,3,4,5,6,7,8 .冬眠者であるダウリアンジリス (DGS;Spermophilus dauricus)が最近確立されました。どうやら、DGSの低温適応性により、ドナー移植片の長期冷蔵保存とレシピエント動物の高い移植後生存率が可能になります。したがって、術後の動物の回復を監視し、さまざまな組織病理学的およびオミクス研究のためのサンプルを準備するためのフォローアッププロトコルが必要です。

DGSと標準的なげっ歯類モデルの間の大きな生理学的違い、およびレシピエント動物における複雑で動的な肝移植後の生理学的変化を考えると、それらから高品質のサンプルを取得することは、下流の分析、したがって移植後の移植片-宿主の生理学の理解にとって重要です。血液や肝臓組織のサンプルを従来の方法で調達・処理・検査する以外に、肝細胞である肝実質細胞と、内皮細胞、星状細胞、クッパー細胞などの免疫細胞を含む非実質細胞(NPC)の解離に成功すれば、急速に発展する単一細胞ベースのマルチオミクスとの複雑な術後細胞・分子相互作用の解明が可能になります。この目的のために、古典的なコラゲナーゼ灌流ベースの方法が 1950 年代初頭から開発され、継続的に改良されてきました 9,10,11。それにもかかわらず、DGS 肝臓の独特の解剖学的構造、血管再建による術後癒着、および手術によって引き起こされる肝移植片の生理学的変化はすべて、抽出条件の微調整を必要とします。

このプロトコルは、肝移植後の DGS における術後管理とサンプル収集に関する詳細なガイドラインを提供します。具体的には、このプロトコルは、高収率および細胞生存率で肝移植片からの肝細胞の単離を可能にし、単一細胞RNAシーケンシング(scRNA-seq)のための単離された肝細胞のその後の処理を詳述する。

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プロトコル

すべての動物実験は、北京大学動物管理および使用のための機関委員会 (LSC-WangSQ-2) によって承認されました。この研究で使用されたDGSは、張家口市の草原で捕獲された妊娠中の女性のDGSによって実験室で製造されました。実験当時、動物は約1〜2歳でした。男性と女性の両方で、体重が 180 g から 400 g の DGS がドナーおよびレシピエントとして利用されました。レシピエントの体重はドナーの体重よりわずかに大きく、その差は50g未満でした。使用する試薬と機器は 、材料表に記載されています。

1. 移植後のケア

  1. 肝移植後のDGSは、12:12の明暗サイクルで暖かく清潔な環境に収容し、標準的な実験室の食事と水を 自由に提供します。
  2. 毎日体重を監視し、腹部切開部の出血を評価し、レシピエントの精神状態と活動レベルを観察します。
  3. 手術直後に、セフロキシム(16 mg / kg)とブプレノルフィン(0.05 mg / kg)を12時間ごとに3日間皮下注射します。
  4. 組織採取の 24 時間前まで、毎日タクロリムス (1 mg/kg) を筋肉内注射します。
    注:DGSは主に野生捕獲物に由来するため、移植免疫学的要因は無視できないままです。DGS 間の移植は、同種移植 (同系移植ではない) と見なされます。研究で拒絶反応などの免疫学的要因を除外する必要がある場合は、術後にタクロリムスが標準化されていることを確認してください。

2. 肝移植片サンプルの調製

  1. 溶液と機器の調製
    1. 500 μM EGTAを含む50 mLのHBSSを調製します(Ca2+-およびMg2+フリー、pH 7.4)。使用前に40°Cの水浴で予熱してください。
    2. コラゲナーゼIV(0.4 mg / mL)を50 mLのHBSS(Ca2+ およびMg2+を含む)に溶解し、40°Cのウォーターバスで30分間インキュベートします。
    3. Percoll溶液:Percollを10× PBSと9:1(v / v)比で混合し、1× PBSで9:1(v / v)比で15 mLチューブに希釈します。溶液を氷の上に置いてください。
      注:DGSあたり5 mLの90%パーコール溶液で十分です。
    4. 使用前に手術器具を70%エタノールに30分間浸します。
    5. 速度を調整できる蠕動ポンプ、シラスティックチューブ、ウォーターバスで構成される灌流システムを組み立てます。チューブを温かい生理食塩水で洗い流して気泡をパージし、滅菌済みの0.22μmフィルターをチューブの出口に取り付けます。
      注:気泡をパージする前に、70%エタノールを15分間完全に流して再利用チューブを洗い流し、その後、ddH2Oで15分間完全にすすぎ、残留エタノールを除去する必要があります。
  2. 動物の処置
    1. 1 mL/体重 100 g の用量で 2.5% トリブロモエタノールを腹腔内注射 することにより 、移植後の DGS を麻酔します。完全な麻酔を確保するために、つま先をつまむことに対する反応などの反射神経の喪失のテストを実行します。
    2. 腹部の毛皮を剃り、腹側を上に向けて手術板にDGSを拘束します。
    3. 動物の腹部に70%エタノールをスプレーし、鋭利なハサミと歯付き鉗子で皮膚と腹膜を大きく十字形に切開して腹腔を開きます。
    4. 肝移植片、門脈(PV)、および下大静脈(IVC)がはっきりと露出するまで、綿棒で腸を腹腔の右側にそっと動かします(図1A)。
      注:肝移植後の腹腔内の術後癒着のため、湿らせた綿棒を使用して癒着を優しく解剖します。
    5. 吻合ストーマの下のIVCに5mLの注射器を挿入して1〜2mLの血液を採取し、血管から針を引き抜いた後、すぐに乾いた綿棒で穿刺部位に軽い圧力を加えて止血します(図1B)。
      注:出血を最小限に抑えるために、針は約30 Gの1 mLシリンジの針と交換できます。
    6. ベベルアップの向きで、22-G カテーテルを使用して血管表面に対して 15° の角度で PV をそっと穿刺し、続いてカテーテルの針を引っ込めます。穿刺が成功したことが確認されたら、カニューレを血管を通してさらに1〜1.5 cmゆっくりと進めます。血管クランプを使用してカニューレの位置を固定します(図1C)。
      注:カニューレが正しく配置されている場合、血液の逆流が見えます。PV カニューレ挿入が失敗した場合、または技術的な問題が発生した場合は、肝下 IVC のカニューレ挿入に切り替え、PV を灌流液流出経路として指定します。
    7. 6〜8 mL /分の温かい生理食塩水で灌流ポンプを開始し、上記の0.22 μmフィルターをカニューレに接続します。
    8. PV による 灌流が開始されたら、IVC を切開して血液排出を可能にします。適切な灌流には50〜80 mLの生理食塩水が必要です(図1D)。
      注:灌流の成功は、移植された肝臓がこのプロセス中に淡い黄白色に移行すると確認されます。うっ血の暗赤色の領域の一部は、肝臓表面に残り、完全に除去できない場合がありますが、これは虚血再灌流障害などの術中の肝外傷に起因する可能性があります。
    9. 50〜80 mLの温かい生理食塩水で適切に灌流した後、ポンプを一時停止します。
    10. 2-0シルク縫合糸を使用して左外側葉をその基部で結紮し、続いて結紮部位の遠位にある葉を切除します。同様に、正中葉をその基部で結紮し、同じ方法を使用して切除します(図1E、F)。
      注:肝部分切除術は、移植された肝臓を複数の実験目的で最大限に利用し、肝臓の完全な消化を促進しながらコラゲナーゼ緩衝液の消費を減らすために行われます。
    11. 切除した肝組織をいくつかの部分に分割します:1つの部分はNPCの単離に使用され、続いてscRNA-seqが使用され、他の部分は組織学的切片のために4%パラホルムアルデヒドで固定されるか、他の実験のために液体窒素で急速凍結されます。
      注: ステップ 2.2.11 は、時間を節約するために次のステップと同時に別の人が実行できます。
    12. NPCの単離。RPMI-1640培地中で組織を約1〜2 mm3 個に切断し、製造元の指示に従ってgentleMACSで酵素的に消化します( 材料表を参照)。細胞生存率と細胞濃度は、自動セルカウンターを使用して測定されました。
      注: ステップ 2.2.12 とステップ 2.2.13-2.3.5 は同時に進行します。
    13. 横隔膜を切断し、肝上IVCをクランプします(図1G)。
    14. インレットチューブを予熱したEGTAバッファーに移します。ポンプを6〜8 mL/分の速度で再起動します。
    15. 肝実質全体に均一な灌流液の分布を促進するために、IVCを5〜10秒間定期的にクランプします。肝臓はクランプ中に目に見えて腫れ、解放すると弛緩します。
      注: 閉塞が長引くと、肝臓を取り巻く薄い結合組織が破裂し、肝毛細血管床の灌流や流体力学が妨げられるリスクがあるため、長期にわたるドレナージの中断を避けることが重要です。さらに、閉塞が持続すると、機械的な力に対する肝細胞の感受性により、細胞の生存率が損なわれ、収量が低下する可能性があります。
    16. 40〜50 mLのEGTA溶液を灌流した後、コラゲナーゼ緩衝液灌流を4〜6 mL /分の速度で8〜10分間開始します。上記の手順のように、流出血管を短時間クランプします(図1H)。
      注:コラゲナーゼ灌流の5〜6分後、肝臓は著しく柔らかくなり、表面の亀裂が現れます。これらの形態学的変化がない場合は、灌流速度を3〜4 mL / minに下げ、総消化時間を12〜13分に延長します。50 mLのコラゲナーゼ灌流が完了すると、肝臓はもろい豆腐のような粘稠度を示し、これは十分な消化の指標です(図1I)。
    17. ポンプを停止し、カニューレを取り外します。肝臓を体から切り取り、10 mLの氷冷DMEM / F12培地を入れた5 cmの皿に入れます。
  3. 肝細胞精製
    1. 肝臓を引き裂いて細胞を放出し、細胞溶液を50 mLの円錐形に移し、その上に70 μmのフィルターを置きます。
    2. 細胞懸濁液を50 x g で4°Cで3分間遠心分離した後、上清を廃棄し、ペレットを20 mL 1× PBSで再懸濁します。この手順を 3 回繰り返します。最後の遠心分離後に、細胞ペレットを5 mLのDMEM / F12培地で再懸濁します。
    3. 細胞懸濁液を15mLチューブ内の同容量の90%Percoll溶液と穏やかに混合します。200 x g で 4 °C で 10 分間遠心分離します。
      注:パーコール遠心分離後、混合物は3つの異なる層に分離されます:最上層(約0.5〜1 mL)には死細胞が含まれ、生存肝細胞は最下層(約0.5〜0.8 mL)に濃縮されます(図2)。通常、このプロトコルでは、生存率が >80% の 5-8 × 107 個の生率肝細胞の収量が得られます。(図3A、B)。
    4. 死細胞と上清を慎重に吸引し、層の激しい乱れを避け、生細胞を10 mLのDMEM / F12培地で再懸濁します。50 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
    5. 上清を廃棄し、精製した肝細胞を2%ウシ胎児血清を添加した1〜5 mL 1× PBSで500〜1200細胞/ μLの最終濃度に再懸濁します。
    6. 肝細胞とNPCを量の1:1の比率で混合する、すなわち、10,000個の肝細胞と10,000個のNPCを混合して細胞懸濁液を調製した。
  4. ScRNAシーク
    注:ステップ2.4.1〜2.4.3は、液滴ベースのシングルセル3'遺伝子発現ライブラリ調製キット12のユーザーガイドに従って実行されました。液滴ベースのマイクロ流体シングルセルパーティショニングおよびバーコードプラットフォームが採用され、標準プロトコルに従ったゲルビーズインエマルジョン(GEM)生成、cDNAライブラリ構築、イルミナシーケンシングの重要なステップを網羅しました。
    1. GEMの生成とバーコードを実行するには、20,000個の肝細胞とNPCを含む細胞懸濁液を使用します。細胞捕捉効率は60%以上です。
    2. cDNA増幅の場合は、ユーザーガイド12に従ってGEM-RT後のサンプルをクリーンアップします。
    3. 図書館の構築
    4. シーケンシングプラットフォームを使用してシングルセルRNAライブラリーをシーケンシングし、サンプルあたり150Gbの深さを達成します。Cell Ranger(v8.0.0)を使用して、生のベースコールファイルをFASTQファイルに逆多重化します。
    5. FASTQファイルを Ictidomys tridecemlineatus ゲノム(NCBIアクセッション:GCF_016881025.1)にアライメントして発現定量化し、実験ワークフローを完了します。

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結果

4°Cで24時間保存され、DGSに移植された移植片の組織学的検査により、術後3日目と6日目に炎症、壊死、または胆汁うっ滞の兆候が最小限で正常な肝小葉構造が明らかになり、偽手術群に匹敵しました(図4A-C)。

手術後の DGS からの初代肝細胞の単離には約 1 時間かかります。記載されたプロトコルを使用して、5×107 以上の肝細胞が得られ、細胞生存率は約80%である(図3A、B)。単離された初代肝細胞を肝臓NPCと混合してその後のscRNA-seq解析を行い、クラスタリング解析により12種類の細胞が明らかになりました(図5)。

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ディスカッション

DGS におけるドナー肝臓の冷蔵保存と移植を記述するプロトコルに従って、ここで説明する手順では、少なくとも 24 時間冷蔵保存された肝臓を移植した DGS の術後モニタリングとカスタマイズされた薬理学的管理について詳しく説明します。このプロトコルは、移植後7日を超えるレシピエントの生存を可能にし、標準的なげっ歯類モデルよりも臓器保存13,14および移植の研究モデルとしての冬眠者の明確な利点を示します。

ここでは、2段階のコラゲナーゼ灌流手順が、独自のDGS肝臓テクスチャー特性に適応するように変更されています(図6)。調整された酵素濃度(0.4 mg / mLコラゲナーゼ)と消化時間(8〜10分)により、単離された肝細胞の生存率は80%を超えました。これは、信頼性の高いトランスクリプトームプロファイリングのために高品質の個々の細胞を必要とする...

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開示事項

著者には宣言すべき利益相反はありません。

謝辞

この研究は、非感染性慢性疾患-国家科学技術主要プロジェクト(2023ZD0507600)、中国国家自然科学基金助成金(82170671、92254301、32230048、82371794、32301306)、国家研究開発プログラム(2024YFA0916804)、および浙江大学教育財団学者樹森蘭娟人材財団の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1×PBSのサービスバイオG4202
10&回;PBSのサービスバイオG4207
4%パラホルムアルデヒドバイオシャープBL539A型
ブプレノルフィンシャフェイH12020276
カニューレ (22 g)ブブラウン4254090B
セフロキシムセレックE4838
細胞培養皿(60mm)巣705001
コラゲナーゼIVシグマ・アルドリッチC5138
コニカルチューブ(15mL)巣601052
コニカルチューブ(50mL)巣602052
綿棒家庭用品店
Countstar 自動セルカウントルイユカウントスター リゲル S2
DMEM/F12ジビコC11330500BT
エグタシグマ・アルドリッチE4378
FBSのギブコ10099-141
フィルター(0.22μm)メルク・ミリポアSLGP033RB
フィルター(70μm)バイオロジックス15-1070
ジェントルMACSミルテニー130-093-235
HBSS(Ca2+およびMg2+を含む)サービスバイオG4204
HBSS(Ca2+およびMg2+なし)サービスバイオG4203
NPC解離キットミルテニー130-096-730
パーコールサイトバ17-0891-09
蠕動ポンプユヤンBT100
RPMI-1640ジビコC11875500BT
塩田SRBのSRB009
シーケンサーイルミナ NovaSeq X プラス
シラスティックチューブタイゴンE-3603型
シルク縫合糸エティコンSA845G
シリンジ(1mL)リゲサイエンスLG05-124注射器の針のみが必要です
シリンジ(2mL)リゲサイエンスLG05-124必要なのは注射器のバレルだけです
タクロリムスセレックS5003
移送ピペットバイオロジックス〒30-0138A1
トリブロモエチルアルコールシグマ・アルドリッチT48402
ウォーターバス叶えるSAP2

参考文献

  1. Ou, J., et al. IPSCs from a hibernator provide a platform for studying cold adaptation and its potential medical applications. Cell. 173 (4), 851-863 (2018).
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