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方法論記事

寒冷適応型Daurian Ground Squirrelsにおける肝臓の低温保存と移植

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DOI：

10.3791/68444

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2025年7月3日

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1Institute of Organ Transplantation, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 2Key Laboratory of Organ Transplantation, Ministry of Education, 3NHC Key Laboratory of Organ Transplantation, 4Key Laboratory of Organ Transplantation, Chinese Academy of Medical Sciences, 5Organ Transplantation Clinical Medical Research Center of Hubei Province, 6Department of Hepatic Surgery and Liver Transplantation Center of the Third Affiliated Hospital, Organ Transplantation Institute, Sun Yat-sen University, 7Guangdong Province engineering laboratory for transplantation medicine, Organ Transplantation Research Center of Guangdong Province, 8Guangdong Key Laboratory of Liver Disease Research, the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 9College of Life Science, Shenyang Normal University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、標準的なげっ歯類モデルでは技術的に困難であったドーリアン地上リス(DGS)における長期肝臓冷蔵および移植モデルを確立するためのプロトコルを紹介します。

要約

肝移植では、長期の冷蔵保存後のドナー移植片の機能回復が大きな課題です。同じ障害が、確立された外科的プロトコルにもかかわらず、肝移植用の標準的なげっ歯類モデル(マウスやラットなど)にも当てはまり、移植後の機能回復や宿主移植片の免疫適合性などの主要なトピックに関する研究が制限されています。本研究では、義務的な冬眠者であるDaurian ground squirrel(DGS; Spermophilus dauricus)は、超深部の低体温再加温および虚血再灌流遷移に対する内因性適応を示しています。私たちの手では、24時間冷蔵後の肝移植片の移植は、7日間の観察時間枠内でDGSレシピエントの100%の生存率をもたらしましたが、Sprague-Dawley(SD)ラットでの同じ手順では、手術後24時間の生存率は0%でした。このように、DGSやその他の寒冷適応哺乳類モデルは、臓器寒冷適応と移植耐性の根底にあるメカニズムを調査するためのユニークで堅牢なプラットフォームを提供し、移植医療の分野における新しい治療または手術戦略の開発を支援することができます。

概要

冷温温と虚血再灌流は、肝移植片の損傷に大きく寄与し、早期の同種移植片機能障害のリスクを高めます。マウスやラットなどの標準的なげっ歯類生物への肝移植は成功裏に確立されていますが1,2、これらの寒冷不耐性種に関する研究は、寒冷適応のメカニズムに関する洞察が限られているため、臓器保存と移植医学の進歩が妨げられてきました。

適切な寒冷適応種における移植研究モデルの開発は、このようなギャップを埋めるかもしれません。例えば、哺乳類の冬眠動物は、周囲温度が低く、食料不足の長期間を生き抜くように進化してきた3,4。冬眠中、彼らの生理機能は、低コア体温を維持し、急速な再加温と血液再灌流に耐えるために、不安定で間抜けな覚醒状態のサイクルで移行します。驚くべきことに、冬眠できる地上リスは、活動的な優温状態でもラットよりも虚血再灌流障害に対する回復力が高いことを示しています5,6。近年、冬眠者に触発された研究により、低温貯蔵による損傷を大幅に軽減し、非冬眠種から単離された組織および器官の機能回復を改善するために調節できるいくつかの寒冷適応メカニズムおよび創薬可能な標的が明らかになった7,8,9,10,11。

ラット12,13,14の肝移植用に開発されたプロトコルを基に、ここでは、肝臓調達、静的冷蔵、およびドーリアン地上リス(DGS;Spermophilus dauricus)は、中国北部に生息する冬眠中のげっ歯類の種です。私たちの手では、DGS移植片のレシピエントは、ウィスコンシン大学(UW)の溶液で4°Cに24時間保存された優体温(活性)または低体温(魚雷)ドナーからの移植片で移植後100%の生存率を示しました。これとは対照的に、同じワークフローに従属したSprague-Dawley(SD)ラットの生存率は0%であり、DGS肝移植モデルの利点を明確に示しています。また、DGSや他の実験室で飼育された寒冷適応種(13列の地上リス(Ictidomys tridecemlineatus)やシリアハムスター(Mesocricetus auratus)など)の他の臓器の長期冷蔵保存や移植も可能になると期待しており、研究者が長期的な移植片の機能回復と宿主移植片適合性を研究し、新薬をテストするユニークな機会を提供すると期待しています。

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プロトコル

すべての動物実験は、北京大学動物管理委員会(LSC-WangSQ-2)によって承認されました。この研究に使用された適切な機器は、 材料表 にリストされており、 図1に示されています。

注:実験室環境での13並みの地上リスなどの野生で捕獲された冬眠齧歯類種の取り扱いと繁殖が説明されています15,16。この研究で使用されたDGSは、張家口市の草原で捕獲された妊娠中の女性DGSによって実験室で作成されました。実験当時、彼らは約1〜2歳でした。元の妊娠した雌のDGSについては、動物が実験室に到着する前に寄生虫が排出されていました。動物が到着すると、一般的なウイルスの検疫と検査が行われ、検査結果が陰性のものは施設内で繁殖されました。

1. 術前準備

  1. 実験動物
    1. ドナーおよびレシピエントとして、体重が180gから400gの1〜2歳の男性と女性の両方の成人DGSを使用してください。レシピエントの体重はドナーの体重よりわずかに大きく、差は50g未満でした。
    2. 対照群のドナーおよびレシピエントとして、体重200〜300 gの雄と女性の両方で、8〜10週の成体SDラットを使用します。実験手順全体を通して、DGS動物の取り扱いと移植中は、サージカルマスク、白衣、ニトリル手袋、および非常に重い革手袋を着用してください。
  2. 門脈(PV)と下肝下大静脈(IHIVC)のカフを、それぞれ6Fと8Fの紹介シースを使用して作成します。各カフは、本体と長さ2mmのエクステンションで構成されていました。蚊の鉗子で優しく固定することにより、袖口の周囲に複数の溝を作成します(図2)。
    注:PVとIHIVCの直径は、DGSのサイズと性別によって大きく異なります。したがって、適切な選択のために、術前に5-F、6-F、7-F、および8-Fカフを準備することをお勧めします。通常、PVには5-Fまたは6-Fのカフが適しており、IHIVCには7-Fまたは8-Fのカフが適しています。
  3. 胆管(3mm)と肝動脈(2mm)のステントを、22Gと24Gの静脈カテーテルをメスで両面斜めに切断して作製します。
    注:ステントに過度の圧力をかけると、内腔の狭窄または閉塞につながり、レシピエントの生存が損なわれる可能性があるため、避けてください。

2. 寄付者運営

  1. 最初のステップ
    1. 麻酔を誘発するために1 L / minの空気流量で5%のイソフルラン濃度を使用し、メンテナンスのために1 L / minで2%を使用します。
    2. DGSをボード上の仰臥位に配置します。腹部から毛皮を剃り、ポビドンヨードと70%エタノールを使用して皮膚を滅菌します。
  2. 灌流前の肝臓の分離
    1. 剣状突起から恥骨結合まで、そして横方向に腋窩中部まで伸びる十字靭帯切開を行います。蚊の鉗子を使用して剣状突起を引っ込め、サポートとして背中の下に5mLの注射器を置きます。
    2. 鎌状靭帯を切断します。左横隔膜静脈を上肝下大静脈 (SHIVC) から分離し、7-0 縫合糸で結紮します。肝脾靭帯を焼灼します。
    3. 綿棒を使用して、右腎静脈の上のIHIVCを周囲の組織から慎重に解放します。.肝臓近くのIHIVCに流れ込む右副腎静脈と腰椎静脈を7-0縫合糸で結紮します。
    4. 総胆管(CBD)の前壁に小さな切開を行います。胆管ステントを挿入し、7-0シルク縫合糸で固定します。縫合糸の一端を約5mmの長さにして、レシピエントのCBDによる後の吻合を容易にします。
    5. 適切な肝動脈(PHA)、胃十二指腸動脈(GDA)、および総肝動脈(CHA)を周囲の組織から分離します。
    6. 1.5 mLのヘパリン食塩水(300 IU / mL)を陰茎静脈(男性ドナー)またはIHIVC(女性ドナー)に投与します。.
  3. 肝臓灌流
    1. 左腎静脈の下の腹部大動脈を分離します。7Gの静脈注射針を大動脈に挿入し、クランプで固定します。
    2. 横隔膜を切開し、胸部大動脈に血管クランプを留置します。
    3. 輸液ポンプを使用して、大動脈カニューレを介して20〜30 mLの冷たいUW溶液を180〜210 mL / hの速度で肝臓を灌流します。.胸腔内大静脈とIHIVCを右腎静脈より上に切開して、灌流液の排出を可能にします。.
      注:綿棒を使用して肝臓葉の位置を調整し、中央と右の葉に特に注意を払いながら、均一な灌流を確保します。灌流は、肝臓全体が均一な蒼白を示すときに完了します。
    4. 灌流中に、胆嚢を切除します。
      注:ラットとは異なり、DGSには胆嚢があります。胆嚢を切除し、胆管をUW溶液で洗い流すことは、胆汁凝固による術後の胆道閉塞を防ぐために不可欠です。
  4. 灌流後の肝移植片の収穫
    1. マイクロ鉗子を使用して、PVを周囲の結合組織から分離します。7-0縫合糸で幽門静脈を結紮し、横断します。脾臓静脈のレベルでPVトランクを横断します。
    2. GDAを遠位に結紮し、横断します。CHAの前壁に小さな切開を作成します。肝動脈ステントをCHAに挿入し、7-0シルク縫合糸で固定し、一端を約5mmの長さにして、レシピエントのCHAによる後の吻合を容易にします。
    3. SHIVCをダイヤフラムにできるだけ近づけて解剖します。
    4. 尾状葉と胃の間の付着物を解剖します。背側靭帯を切断した後、肝臓を完全に動員します。
    5. 肝臓を冷たいUW溶液が入った7cmのスチールボウルに入れます。ボウルを4°Cの冷蔵庫に移して保存します。
      注:24時間を超える肝臓の風邪保存の場合は、感染のリスクを減らすためにUW溶液に抗生物質を追加します。UWソリューションを24時間ごとに交換することを検討してください。

3. 生体外 移植片の調製

注意: 開いた氷の容器を準備します。バックテーブルの準備は、すべて氷の上で行われました。

  1. PVカフのハンドルを血管クランプで固定し、蚊の鉗子を使用して安定させます。PVを袖口にそっと通し、ねじれが発生しないようにします。PVをカフの上に折り、7-0縫合糸で固定します(図3)。
  2. IHIVCカフについて上記の手順(手順3.1)を繰り返します。
  3. 2mLのUW溶液で嚢胞性管を介して胆管を灌流します。.続いて、嚢胞管を結紮します。
  4. PVカフを通して8〜10mLの冷生理食塩水で肝臓移植片を洗い流し、冷蔵保存後に残留UW溶液を除去します。
  5. 取り付けられたカフと肝臓の右下葉との間のIHIVCの周りに単一の7-0シルク縫合糸を配置します。
  6. 肝臓を回転させて、その優れた側面を露出させます。順位 8-0SHIVCの両側の角に縫合糸を留まし、外側から内側に挿入します。

4. 受取人の操作

  1. 最初のステップについては、ドナー操作プロトコルを参照し、手順2.1を繰り返します。
  2. レシピエントの肝臓分離
    1. 剣状突起から恥骨結合への正中線切開を行います。蚊の鉗子を使用して剣状突起を頭蓋状に引っ込め、5 mLの注射器を下に置き、SHIVCを上昇させます。両側の肋骨弓を横方向に引っ込めます。
    2. ステップ2.2.2で説明されているように、靭帯と血管の管理を実行します。
    3. 手順 2.2.3 の説明に従って IHIVC を分離します。
    4. 肝臓と後腹膜の間の靭帯の付着を切断します。鈍い鉗子をSHIVCの後ろに慎重に通し、その周りに7-0シルク縫合糸を配置します。
    5. 7-0シルク縫合糸でCBDを近位に結紮し、結紮糸の上を横断します。綿の先端を使用して、胆管をPVから優しく分離します。
    6. ライゲーション間でGDAとPHAを横断します。CHA の終点に Y 字型の分岐点を作成します。後で使用するために、PHA結紮糸に2cmの長さの縫合糸を残します。
    7. PVの左右の分岐を解放します。その後の操作のために、各枝に5cm、7-0ステー縫合糸を配置します。
  3. レシピエントの肝臓の除去
    1. 0.5 L / minの気流でイソフルラン濃度を0.5%に下げます。
      注:イソフルラン気化器を調整することにより、1秒あたり約1回の呼吸数を維持します。.無肝期を通じて麻酔の深さを継続的に評価し、術中の意識や過度の麻酔が呼吸抑制につながるのを防ぎます。
    2. IHIVCを右腎静脈の上でクランプし、続いてPVを幽門静脈の上でクランプします。2 mLのシリンジを使用して1.5 mLの生理食塩水を右PVに10秒で注入し、肝臓から血液を洗い流します。
    3. SHIVCの周りに配置された7-0シルク縫合糸を引っ張ってダイヤフラムを静かに引っ込めてから、ブルドッグclを適用しますampダイヤフラムの一部を含むSHIVCに。
    4. 肝臓のすぐ上でSHIVCを切除します。7-0ステー縫合糸を両方のPVブランチに固定し、これらの結紮糸の上でPVをトランセクトします。IHIVCを肝実質の近くで切除します。残っている靭帯の付着物を切断して、肝臓を速やかに取り除きます。
  4. SHIVCの再構築
    1. 肝臓移植片を腹腔内に同所的に配置します。付属の8-0を活用縫合糸は、レシピエントのSHIVCの両角にステー縫合糸を配置し、内側から外側に挿入し、結び目で固定します。
    2. 血管クリップを使用して、右縫合糸の緩い端を横方向にそっと引っ張り、SHIVCを位置合わせします。
    3. 左隅から始めて、8〜10回の連続ステッチで後壁を縫合します。同じ縫合糸を使用して右から左に移動しながら、10〜12針で前壁を閉じます。前壁の閉鎖を完了する前に、SHIVCキャビティを洗い流して空気を排出し、空気塞栓症を防ぎます(図4)。
  5. PVの再構築
    1. 両方の分岐部に配置された5cmのステー縫合糸を使用してPVを持ち上げ、血管クランプで緩やかに上向きの牽引を加えます。PVブランチの中点に切開を行います。
    2. PVルーメンをヘパリン化生理食塩水(300 IU / mL)で洗い流し、カフをPVに挿入して7-0シルク縫合糸で固定します。
    3. PVとSHIVCのクランプを順次解除して、グラフト灌流を再確立し、無肝期を終了します(図5)。
  6. IHIVC吻合は、PV手順と同様に行います。最初にドナー側の周りの7-0縫合糸をリリースし、次にレシピエント側からクランプを取り外します。
  7. 肝動脈再建術
    1. 微小血管クリップを適用して、レシピエントのCHA内の血流を閉塞します。
    2. 受信者の CHA の末端にある Y 構成の分岐部に小さな切開を作成します。CHA内腔をヘパリン化生理食塩水(300IU/mL)で洗い流し、ステントをCHAに挿入して7-0シルク縫合糸で固定します。
    3. ドナー側とレシピエント側の両方でステイ縫合糸を結び、ステントの変位を防ぎます。微小血管クリップを放して、動脈の流れを回復します(図6)。
  8. 胆管再建:
    1. レシピエントのCBDの前壁に小さな切開を行います。胆管ステントをレシピエントのCBDの内腔に挿入し、7-0シルク縫合糸で固定します。
    2. ステントの変位を防ぐために、ドナー側とレシピエント側の両方でステイ縫合糸を結びます(図7)。
  9. 再建手順の完了後、連続ランニング3-0縫合糸を使用して腹部切開を2層に閉じます(図8)。

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結果

手術の平均所要時間は、ドナー手術が平均24.8±2.3分、バックテーブル手術が15.4±1.3分、レシピエント手術が52.7±5.1分、無肝期が14.2±1.5分であった。

冷たいUW溶液で24時間保存した肝移植片のレシピエントは、移植前に冬眠状態にあった(n = 8)かそうでないか(n = 4)かに関係なく、移植後7日で100%の生存率を示しました(図9)。7日目には血管閉塞は観察されませんでした。すべての肝動脈は、ステント技術によって灌流されたままでした。対照的に、他のSDラットから肝移植を受けたすべてのSDラットは、同じく冷UW溶液中で24時間保存され、移植後12時間以内に死亡した(n = 9)。

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ディスカッション

鎌田のダブルカフ技術2を基盤に、DGSで初めての同所性肝移植モデルを確立することに成功しました。DGSと従来のラットモデルとの間には解剖学的な違いがあるため、材料の準備、外科的処置、および術後管理における特定の考慮事項が不可欠です。

冬眠や脂肪の蓄積などの要因は、150 gから400 gの範囲の成人DGSの体重の大幅な個人差に寄与し、男性と女性の間に顕著な違いがあります。したがって、寄付者と受領者を慎重に選択することが重要です。理想的には、レシピエントの体重はドナーよりわずかに多く、体重差は50 gを超えないようにする必要があります。

DGSの血管の直径も、サイズと性別によって大きく異なります。PVおよびIHIVC吻合の最適な選択のためには、5-Fから8-Fの範囲のカフの術前準備が推奨されます。手動吻合もIHIVC再建の実行可能なオプションです。特に、DGSの肝動脈は一般的なSDラットのそれよりも比較的厚いため...

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開示事項

著者は、宣言する利益相反を持っていません。

謝辞

この研究は、非感染性慢性疾患-国家科学技術メジャープロジェクト(2023ZD0507600)および中国国家自然科学基金会(82371794および82170671)の支援を受けました。この作品は、浙江大学教育基金会、学者Shusen Lanjuan Talent Foundationによっても後援されました。また、ウィスコンシン大学オシュコシュ校のダナ・K・メリマン教授には、13列の地上リスの繁殖に取り組み、実験室での冬眠げっ歯類モデルの育種に関する有益な洞察と経験を惜しみなく共有してくださったことに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
針付き3-0縫合金環医療製品有限公司R315皮膚の閉鎖のために
7-0シルク縫合ブレイントリー、サイ社SUT-S103
7歳児 イントロデューサーシース 北京デマックス医療技術有限公司DQ07083818SIHIVC用のカフ
8-0針を使った縫合金環医療製品有限公司H821SHIVCの吻合のために
8歳女性 イントロデューサーシース 北京デマックス医療技術有限公司DQ08083818SIHIVC用のカフ
麻酔装置RWDライフサイエンス社R500
ブラッドストップ焼灼寧波順葉医療有限公司BDD-YE-DT-1
ブルドッグクランプ(やや湾曲)金中医療製品株式会社XEC120シヴォルム
ブプレノルフィン天津製薬研究所製薬株式会社H12020275鎮痛剤
セフロキシムナトリウムEsseti FarmaceuticiS.r.lH20160013抗生物質
綿棒福清健康統合医療20230R
湾曲型マイクロ鉗子RWDライフサイエンス社F11031-11手術用工具
曲面マイクロシザーズ66 ビジョンテック株式会社54108B手術用工具
ガーゼ綿棒玉北医療資材有限公司21080274
ヘパリンナトリウム注射華北製薬株式会社2101131-2
注入ポンプホウクメッド株式会社HK-400
イソフルランRWDライフサイエンス社21070201
マイクロニードルホルダーワールド・プレシジョン・インスツルメンツ株式会社555408NT手術用工具
マイクロ容器クリップRWDライフサイエンス社R31005-06PVとIHIVC
マイクロベッセルクリップアプリケーターRWDライフサイエンス社R34001-14手術用工具
ニードルホルダーRWDライフサイエンス社F31025-13腹部閉鎖
生理食塩水浙江天瑞製薬有限公司716092103
ストレートマイクロピンセットRWDライフサイエンス社F11029-11手術用工具
外科用顕微鏡ライカM650
手術用プラットフォーム該当なし該当なしカスタム、磁気式
組織鉗子RWDライフサイエンス社F12002-12手術用工具
ティッシュシザーRWDライフサイエンス社S12003-09手術用工具
UWの解法臓器回収システムSPS-1オルガンの調水と保管 

参考文献

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