このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

リアルタイム蛍光PCRによる 結核菌 感染と薬剤耐性の迅速診断

771 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/68445

⸱

2025年7月15日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Fifth Division Hospital of Xinjiang Production and Construction Corps, 2Laboratory Medicine, Guangdong Provincial People's Hospital (Guangdong Academy of Medical Sciences), Southern Medical University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、リアルタイム蛍光定量PCR(qPCR)技術を使用して 結核菌 とその薬剤耐性を検出するためのプロトコルを紹介します。

要約

結核(TB)は、脆弱な人々に不釣り合いに影響を及ぼしている主要な健康問題です。薬剤耐性結核の出現と蔓延は、世界の公衆衛生に深刻な脅威をもたらしています。塗抹顕微鏡や培養など、 結核菌 (MTB)の従来の診断法には大きな限界があり、臨床治療が遅れることがよくあります。この課題に対処するために、リアルタイム蛍光PCRに基づく効率的な診断スキームが開発されました。試験サンプルから高品質のMTB核酸を抽出でき、主要な耐性部位で耐性の状態を特定できます。従来の方法と比較して、このアプローチでは検出時間がわずか数時間に大幅に短縮され、患者の初回訪問後すぐに感染状態と耐性状態を判断できます。検出感度は85%を超え、特異度は95%に達します。この非侵襲的な技術は、患者の不快感を最小限に抑えるだけでなく、低コストで高効率であるため、草の根医療機関での正確な診断をサポートします。全体として、このアプローチは結核診断の大幅な改善を表しています。

概要

結核(TB)は、 結核菌 (MTB)によって引き起こされる慢性感染症で、世界の死因トップ10に入っています1。薬剤耐性結核(DR-TB)は、結核対策の取り組みにとって大きな課題となっています。中国疾病管理予防センター(China CDC)が発行した「結核のないコミュニティ構築のための行動計画(2022-2027)」では、細菌学的に確認されたすべての肺結核患者を対象に、早期の薬剤耐性スクリーニングの必要性を強調しています2。DR-TBの検出能力を強化し、診断期間を短縮し、DR-TB症例の特定を最大化し、標準化された治療と管理を確保し、必要な感染制御対策を実施するための新しい分子診断技術の採用を提唱しています3。さらに、DR-TBの予防と管理の強化に関する通知(2023年第4号)は、高度な診断技術の全国的な推進を義務付けています。また、細菌学的に確認されたすべての結核患者に対して、ユニバーサルスクリーニングの達成、診断の標準化の改善、医療へのアクセス性の向上のために、タイムリーな耐性スクリーニングを強く求めています4。

DR-TBとは、少なくとも1種類の抗結核薬に耐性のある結核患者を指します。現在の分類には、リファンピシン耐性(RR)、単耐性、多剤耐性、多剤耐性(MDR)、前広域薬剤耐性(pre-XDR)、および広範囲薬剤耐性(XDR)結核が含まれます。DR-TBの疫学に関する世界的なメタアナリシスでは、MDR-TBが11.6%、イソニアジド耐性が15.7%、リファンピシン耐性が9.4%、モノレジスタンスが11.8%と、驚くべき耐性率であることが明らかになりました。これらのデータは、DR-TB5 の重大さと複雑さを浮き彫りにしています。

リファンピシンとイソニアジドは、結核治療の基礎となる薬です。しかし、世界保健機関(WHO)は、リファンピシン耐性の迅速な診断技術は利用可能である一方で、イソニアジド耐性に対する類似のツールが不足していると指摘しています。このギャップは、多剤耐性結核(MDR-TB)のタイムリーな診断を妨げます。「リファンピシン耐性結核」の暫定的な定義は、この診断上の限界を反映しており、他の薬剤に対する耐性を迅速に検出する能力が不十分であることを強調しています6,7。WHOは、イソニアジド耐性結核の症例はリファンピシン耐性の症例の2倍であると推定しています。リファンピシン耐性スクリーニングのみに依存すると、イソニアジド単耐性結核 (Hr-TB) を見落とすリスクがあります8。標準レジメンで治療された未検出の心肺結核患者は、治療の失敗、再発、および多剤耐性結核9への進行のリスクが高くなります。エタンブトール耐性も懸念されます。結核および多剤耐性結核治療の重要な薬剤として、中国の2017年のDR-TBベースライン調査では、エタンブトール耐性率が新規症例で4.9%、再治療症例で17.2%と報告されています10。

現在、残存結核の薬剤耐性の検出については、人工培養が一部の研究室ではまだ好ましい方法ですが、リアルタイム蛍光PCR技術は、結核の薬剤耐性を検出するための従来の方法よりも優れています:検出と定量化:リアルタイム蛍光PCRは、蛍光信号のリアルタイムモニタリングを通じて正確な定量分析を提供しますが、従来の方法はこの精度を欠いています。従来の実験方法は、時間と労力がかかり、訓練を受けた人員が必要であり、非常に主観的です。それどころか、リアルタイムPCRは、蛍光プローブとシグナルをコンピューターで捕捉し、人為的ミスを最小限に抑えます。従来のデータ解析法はより主観的ですが、リアルタイムPCRは増幅曲線や標準曲線などの解析方法により、正確で客観的な解析を実現します。これらの進歩により、リアルタイム蛍光PCRは結核の薬剤耐性を検出するための好ましい方法となっています11。

要約すると、薬剤耐性結核(DR-TB)は世界的な危機として浮上しています。主要な薬剤であるイソニアジド、リファンピシン、エタンブトールへの耐性は、結核対策の取り組みをさらに複雑にしています。薬剤耐性をタイムリーかつ正確に検出することは、カスタマイズされた治療レジメンを導き、治療の成功を改善し、DR-TBの脅威を軽減するために重要です。

診断上の課題に対処するために、この研究では、 結核菌 を特定し、喀痰サンプルを使用して3.5時間以内に薬剤耐性変異を検出できるキットを利用しました。これは、リアルタイム蛍光qPCRのサポートによって達成されました。この方法はシンプルで費用対効果が高く、正確であるため、DR-TBとの闘いにおいて貴重なツールとなっています。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

この研究は、新疆生産建設隊の第5師団病院の倫理委員会によって承認されています。倫理番号はLLWYH2025001であり、倫理的な対立はありません。試薬および使用した機器は 、材料表に記載されています。

1.サンプル収集

  1. 世界保健機関(WHO)が推奨する国際的に標準化されたスクリューキャップ式喀痰ボトル、または密封されたプラスチックの箱やパラフィン紙の箱を使用して、喀痰のサンプルを採取します。
  2. 喀痰容器に患者名、番号(新規患者の場合は外来患者番号、経過観察患者の登録番号)、検査項目、容器シーケンス番号1、2、3(1=同日即時喀痰、2=夜間喀痰、3=翌日朝痰)をラベル付けします。喀痰のない患者の場合は、エアロゾル誘発性 ?? 吐集を通じてサンプルを採取します。.
    注:スタッフは、収集された喀痰サンプルの品質を評価する必要があります。サンプル量は通常、3〜5mLに維持する必要があります。適格なサンプルには、乾燥した喀痰、茶色の血で汚れた喀痰、少量の新鮮な血液を含む喀痰、または粘液性痰が含まれます。唾液などの不適格なサンプルは、さらなるガイダンスの後、テストのために再提出する必要があります。

2. 喀痰の前処理

  1. 採取した喀痰の量に基づいて、4%NaOH溶液の1〜2倍の容量を喀痰容器に加えます。内容物を振って2分間混ぜます。
  2. 容器を室温のバイオセーフティキャビネットに15分間置き、この期間中に数回振って、痰が完全に液化するようにします。
    注:NaOHは腐食性があるため、取り扱いには注意してください。痰が完全に液化していない場合は、振とう時間を長くします。このステップは、実験全体を通して特に重要です。

3. 試薬調製(PCR前領域)

  1. 試薬の調製:指定されたPCR前領域で試薬を調製します。凍結試薬を室温で解凍します。5〜10秒間の渦。室温で3000 × g で5〜10秒間遠心分離します。
    注:この試薬はデュアルシステム(A / B)であり、別途調製する必要があります。
  2. PCRマスターミックス調製
    1. ミックスA:1.5 mLの微量遠心チューブに、(n + 3)×19.6 μLのRIF PCR Mix Aと(n + 3)×0.4 μLの結核酵素を組み合わせます。5〜10秒間の渦。室温で3000 × g で5〜10秒間遠心分離します(PCR Mix A:60 μL)。
    2. ミックスB:別の1.5 mL微量遠心チューブで、(n + 3)×19.6 μLのRIF PCR Mix Bと(n + 3)0.4 μLの結核酵素を組み合わせ×。上記のようにボルテックスおよび遠心分離します(PCR Mix B:60 μL)。
  3. 保管と使用:調製したマスターミックスを≤-18°Cで保存します。 すぐに使用しない場合は、4時間以内に使用してください。
    注:同じプロトコルがEMB試薬とINH試薬に適用されます。
  4. PCRマスターミックスの分注:20 μLのPCR Mix AとMix Bを別々のPCR薄肉反応チューブに分注します。密封されたバッグに分注されたチューブを抽出エリアに移します。

4. 核酸抽出とサンプルローディング(抽出エリア)

  1. 1.2 mLの完全液化した喀痰を15,058 × g で室温で5分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットを保持します。オプション:装置が許す場合は、分解したサンプル全体を遠心分離します。
  2. ペレットを生理食塩水1.2mLに再懸濁し、ボルテックスで15,058 × g で室温で5分間遠心分離します。この洗浄手順を3回繰り返します。
  3. 250 μL TB抽出バッファーをペレットに加えます。ボルテックスし、99°Cで10分間熱溶解します。室温まで冷まします。15,058 × g で室温で1分間遠心分離し、上清(抽出サンプル)を回収します。
    注:粘性サンプルの場合は、液化バッファーの容量を増やすか、ボルテックス時間を延長します。サンプルがDNA抽出のみを目的としている場合は、液化時間を長くして完全な消化を確保してください。
  4. マイクロピペットを使用して、抽出したサンプル5 μLまたは陰性/陽性コントロールを各PCR薄肉反応チューブに加えます。チューブはすぐに密封し、適切にラベルを貼ってください。
  5. ボルテックスでPCRチューブを5〜10秒間充填し、短時間(5〜10秒)遠心分離します。チューブをPCR増幅領域に移します。

5. PCR増幅(増幅領域)

注:リファンピシン、エタンブトール、およびイソニアジド耐性検出のプログラムは、Hongshiサーマルサイクラー(表1、 表2、および 表3)で設定されました。サイクリング条件が含まれています。

  1. ロードしたPCR薄肉反応チューブをサーマルサイクラーに入れて増幅します。
  2. サイクラーインターフェースにアクセスします。 Experiment Wizard をクリックし、実験タイプとして Standard Melt Curve を選択します( 図1を参照)。
  3. プレートエディターをクリックし、隣接する2つのブランクウェルを水平方向に選択し、右側のパネルから対応する薬剤テンプレートを割り当てて1つの検体を定義します(図2を参照)。
  4. ネガティブ/ポジティブコントロールとサンプル情報を設定します。 [開始 ]をクリックしてプログラムを開始します。上映時間は2時間22分です。
  5. 完了したら、PCR薄肉反応チューブ(密封)を密封されたバッグに移します。クロージャーを固定し、バイオハザード廃棄物として処理します。
  6. Thermal Cyclerの Analyze をクリックして、データを処理します。
    注:この方法の検出限界は次のとおりです:複合グループ:10細菌/ mL;リファンピシン:20,000バクテリア/ mL;イソニアジド:10,000バクテリア/ mL;エタンブトール:10,000バクテリア/ mL。(検出限界(LoD)データは、試薬の取扱説明書に記載されている765例の臨床例の統計解析から導き出されています。

6. 結果の解釈

  1. 試験サンプルとポジティブコントロールの融解温度(Tm)の差を比較することにより、突然変異を特定します。
    注:野生型(薬剤感受性):サンプルのTm値は、4つのチャンネルすべてでポジティブコントロールと一致します(偏差≤1°C)。変異体(薬剤耐性):任意のチャネルのTm値は、ポジティブコントロール(ΔTm ≥2 °C)よりも≥2°C低くなっています。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

この研究では、リアルタイムの蛍光PCRと融解曲線分析を利用して、17人の結核患者の喀痰サンプルを検査しました。さらに、30人の患者が リファンピシン 耐性試験を受け、20人が イソニアジド と エタンブトールに対する耐性について試験されました。リアルタイム蛍光PCR法は、 結核菌 複合体に対して88.2%の陽性検出率を示しました。

耐性率はリファンピシンで13.3%、イソニアジドで15.0%であり、一部の患者では薬剤耐性の可能性があることを示しています。かなりの割合のサンプル(リファンピシンで 26.7%、イソニアジドで 20.0%)は検出されませんでしたが、これはおそらく細菌負荷が低いか、分析法感度の問題が原因です。 エタンブトール 耐性は5.0%と比較的低かったが、サンプルの45.0%が検出されなかったため、このエタンブトール耐性検出方法には限界があることが明...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

薬剤耐性結核菌複合体(MTBC)株が世界規模で出現したことで、結核患者の治療は著しく複雑化しています。特に、多剤耐性結核(MDR)および広範囲薬剤耐性結核(XDR)は、結核対策に手強い課題をもたらします12。薬剤耐性の迅速な検出は、適切な治療レジメンを設計し、治療の失敗を防ぎ、耐性株のさらなる拡散を抑制するために重要である13,14。リアルタイム蛍光PCRなどの核酸増幅技術(NAAT)ベースの検出法は、その堅牢な安定性と検出時間の短縮により、結核診断で広く受け入れられています15。しかし、結核診断のための検証済みのNAAT法として認められるためには、アッセイは高い信頼性、感度、特異性、およびアクセシビリティを実証しなければならない16。ほとんどのPCRベースの結核検出方法は、肺および肺外検体中の...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者は、利益相反を宣言しません。

謝辞

この研究は、Corps Tuberculosis Projectからの特別助成金によって資金提供されました。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
高速遠心分離機
溶解バッファーXiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.24110701
結核菌エタンブトール耐性変異検出キットXiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.24030801
結核菌イソニアジド耐性変異検出キットXiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.24011101
結核菌リファンピシン耐性変異検出 KiXiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.24031001
SLAN-96PリアルタイムPCRシステム宏石医療技術有限公司SLAN-96P
喀痰処理ソリューションXiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.24110701
TopPetteピペッター
上海

参考文献

  1. Salari, N., et al. Global prevalence of drug-resistant tuberculosis: A systematic review and meta-analysis. Infect Dis Poverty. 12 (1), 57(2023).
  2. Cai, X., Xu, X., He, G., Jiang, X., Wu, L. Drug resistance in drug-resistant tuberculosis patients with and without diabetes mellitus: A comparative analysis. BMC Infect Dis. 24 (1), 807(2024).
  3. Egan, K. A., et al. Compensatory evolution in NusG improves fitness of drug-resistant M. tuberculosis. Nature. 628 (8006), 186-194 (2024).
  4. Sulis, G., Pai, M. Isoniazid-resistant tuberculosis: A problem we can no longer ignore. PLoS Med. 17 (1), e1003023(2020).
  5. Perumal, R., et al. Regimens for drug-resistant tuberculosis. N Engl J Med. 388 (2), 189(2023).
  6. Menzies, D., et al. Effect of duration and intermittency of rifampin on tuberculosis treatment outcomes: A systematic review and meta-analysis. PLoS Med. 6 (9), e1000146(2009).
  7. Turkova, A., et al. Shorter treatment for nonsevere tuberculosis in African and Indian children. N Engl J Med. 386 (10), 911-922 (2022).
  8. Diagnosis of tuberculosis and detection of drug-resistance: rapid communication. , World Health Organization. https://www.who.int/publications/i/item/B09111 (2024).
  9. Xiang, X., et al. Mycobacterial ethambutol responsive genes and implications in antibiotics resistance. J Drug Target. 29 (3), 284-293 (2021).
  10. Deshpande, A., Likhar, R., Khan, T., Omri, A. Decoding drug resistance in Mycobacterium tuberculosis complex: Genetic insights and future challenges. Expert Rev Anti Infect Ther. 22 (7), 511-527 (2024).
  11. Sun, Q., et al. Mutations within embCAB are associated with variable level of ethambutol resistance in Mycobacterium tuberculosis isolates from China. Antimicrob Agents Chemother. 62 (1), e01279-e01317 (2017).
  12. Noordhoek, G. T., et al. Sensitivity and specificity of PCR for detection of Mycobacterium tuberculosis: A blind comparison study among seven laboratories. J Clin Microbiol. 32, 277-284 (1994).
  13. Lee, H., et al. Assessment of the quantitative ability of AdvanSure TB/NTM real-time PCR in respiratory specimens by comparison with phenotypic methods. Ann Lab Med. 34, 51-55 (2014).
  14. Murphy, S. G., et al. Direct detection of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis using targeted next generation sequencing. Front Public Health. 11, 1206056(2023).
  15. Araya, B. T., et al. Performance of the Abbott RealTime MTB and RIF/INH resistance assays for the detection of Mycobacterium tuberculosis and resistance markers in sputum specimens. PLoS One. 16, e0251602(2021).
  16. Motta, I., et al. Recent advances in the treatment of tuberculosis. Clin Microbiol Infect. 30 (9), 1107-1114 (2024).
  17. Zhang, X., et al. A new method for the detection of Mycobacterium tuberculosis based on the CRISPR/Cas system. BMC Infect Dis. 23 (1), 680(2023).
  18. Sam, I. K., et al. TB-QUICK: CRISPR-Cas12b-assisted rapid and sensitive detection of Mycobacterium tuberculosis. J Infect. 83 (1), 54-60 (2021).
  19. Park, Y. K., et al. Correlation of the phenotypic ethambutol susceptibility of Mycobacterium tuberculosis with embB gene mutations in Korea. J Med Microbiol. 61 (4), 529-534 (2012).
  20. Global tuberculosis report. , World Health Organization. https://www.who.int/teams/global-programme-on-tuberculosis-and-lung-health/tb-reports/global-tuberculosis-report-2023 (2023).
  21. Parsa, S., et al. Detection of isoniazid and rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from sputum samples by high-resolution melting analysis. Curr Microbiol. 79 (9), 257(2022).
  22. Plinke, C., et al. embCAB sequence variation among ethambutol-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates without embB306 mutation. J Antimicrob Chemother. 65 (7), 1359-1367 (2010).
  23. Xie, L., et al. Accurate and affordable detection of rifampicin and isoniazid resistance in tuberculosis sputum specimens by multiplex PCR-multiple probes melting analysis. Infection. 52 (6), 2371-2398 (2024).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

さらに記事を探す

結核診断薬剤耐性結核リアルタイムPCR核酸抽出耐性検出塗抹鏡検培養法診断感度

この記事は公開されました

動画は近日公開

お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。