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方法論記事

血液汚染のないマウス鼻洗浄液コレクション

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DOI:

10.3791/68451

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2025年7月11日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Kindai University Faculty of Medicine, 2Department of Arts and Sciences, Kindai University Faculty of Medicine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本プロトコルは、マウスの鼻洗浄液(NLF)の血液汚染を回避するための新しい方法を説明しています。この方法により、血液汚染のないNLF収集が保証されるため、免疫成分やさまざまな呼吸器病原体をより正確に検出できます。

要約

鼻洗浄液(NLF)や鼻腔ぬぐい液などの上気道サンプルは、呼吸器疾患を引き起こす可能性のあるウイルスや細菌などの病原体を検出するのに役立ちます。NLFは、粘膜ワクチン接種後の免疫グロブリン(Ig)Aの誘導を評価する際に、呼吸器系の細胞および体液性成分を調べるために使用されてきました。実験的なげっ歯類では、NLFサンプルは経咽頭経路または経気管経路のいずれかで収集できます。咽頭横断経路は、気管横断経路よりもNLFサンプルの収集において効率的であると報告されていますが、咽頭経路によって収集されたNLFサンプルはしばしば血液で汚染されており、元のNLFサンプルの細胞内容物および体液性内容物のレベルに影響を与えていました。そこで、本研究では、血液汚染を最小限にするための実験マウスにおける新しいNLF採取法の確立を目指した。簡単に言えば、マウスの下顎が分離される前に、血液を吸収するために綿球を口に入れました。出血が止まったら、マイクロピペットをチョアナに挿入し、200μLのリン酸緩衝生理食塩水で2回洗い流してNLFサンプルを採取しました(最終容量:400μL/マウス)。血液汚染を検出するために、ヘモグロビンを検出するシンプルで感度の高い法医学ルミノール検査が使用されました。ルミノール試験では、従来の方法(コットンボールなし)で採取したNLFサンプルでは血液汚染が検出できたが、新しい方法(コットンボールを使用)で採取したNLFサンプルでは血液汚染が検出されなかったことが示された。血液の汚染により、NLFサンプル中のIgAおよびIgGの総濃度は、従来の方法の方が新しい方法よりも高かった。血液には、NLFよりもはるかに高いレベルのIgAおよびIgGが含まれていることが知られています。したがって、このユニークな方法は、血液汚染を防ぐために実験マウスからNLFサンプルを採取するためのシンプルで高感度な方法として使用できます。

概要

臨床研究と基礎研究の両方において、結果を評価するためには、適切なサンプル採取方法が最も重要です。鼻洗浄は、気道1,2,3の細胞および体液性成分を分析するために使用される灌漑技術です。臨床的には、鼻洗浄液(NLF)はバイオマーカー発見のための効果的な非侵襲的サンプルとして使用されており、副鼻腔炎、嚢胞性線維症、および一般的な呼吸器疾患を含むさまざまな呼吸器疾患での使用を支持するいくつかの研究があります4,5,6,7。実験動物では、NLFはインフルエンザ、コロナウイルス病-2019(COVID-19)、アレルギー性疾患3,8,9などの呼吸器疾患モデルの研究にも使用されています。この方法は、アレルゲン、喘息、および呼吸器感染症に対する応答の指標としてしばしば調べられる多形核細胞やサイトカインなどの主要な炎症性バイオマーカーを決定するために広く使用されています10,11,12。最近では、潜在的な経鼻ワクチン候補の有効性と安全性を調査するために、NLFサンプルはしばしば実験動物から収集され、NLFサンプル中の病原体と免疫グロブリン(Ig)のレベルが指標として定量化されています13。

実験用マウスでは、経咽頭法または経気管法を使用してNLFを収集できます。経咽頭法では、口蓋咽頭領域を含むマウスの頭部を喉頭から分離し、その後、咽頭開口部からカテーテルを挿入してchoanaにカテーテルを挿入し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を注入し、鼻孔からNLFを採取した14。経気管法は、頭部を切断することなく気管から気道にアクセスできるようになり、鼻孔からNLFを採取することで、血液汚染のリスクを最小限に抑えました。これら2つの主要な方法は、実験マウスでのNLF収集に採用されていますが、従来の方法にはそれぞれ制限があります。経気管法は、経気管洗浄液が口腔内に漏れるため、経咽頭法よりもNLFの量が少ないことが実証されています。以前の研究では、PBSの注射後、NLFで回収された体液量は、経気管法と経咽頭法でそれぞれ70%〜80%と90%〜100%であったことが示されました14。経咽頭法は、経気管法よりも大量のNLFでより優れていると考えられるが、処置中の血液汚染はある程度避けられなかった14,15。同様に、いくつかの研究では、NLFサンプルがしばしば高レベルの血清タンパク質16,17,18で汚染されていることが報告されています。これは、呼吸器疾患のNLF特異的バイオマーカーの検出と定量を妨げる可能性があります19。これは、血液にはNLFよりも大量のIgAとIgGが含まれているため、NLFサンプル中のIg、特にIgAとIgGの濃度にも影響を与える可能性があります。

これらの課題に対処するために、この研究は、実験マウスからNLFサンプルを収集し、サンプル収量を最大化し、血液汚染を最小限に抑えるための、ユニークでシンプルで信頼性の高い経咽頭法を確立することを目指しました。実験の過程で、マウスの口にコットンボールを入れて血液汚染を抑制し、その後PBSを注入して鼻孔からNLFサンプルを採取しました。NLFの血液汚染レベルは、NLFサンプル中のヘモグロビン(Hb)レベルの半定量を可能にする法医学技術であるルミノールベースの化学発光を使用して決定されました。新しい方法で収集されたNLF中のルミノール反応は陰性でした。したがって、現在の新しい方法では、抗体酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、サイトカインプロファイル、免疫学的および医学的バイオマーカー測定、マウス呼吸器疾患モデルなど、さまざまな生物学的実験のNLFサンプル品質を向上させることができます。

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プロトコル

すべての実験手順は、近畿大学医学部の動物施設管理および使用委員会(IACUC)によって承認され、国立衛生研究所(NIH)によって概説された基準に従って実施されました20。この研究では、生後4か月の雄C57BL/6マウスを使用しました。本研究で使用した試薬および機器に関する情報は、 材料表に記載されています。

1. NLFコレクション

  1. 5%イソフルラン21 でマウスを安楽死させます 施設で承認されたプロトコルに従って。
  2. マウスを手術用プレートに仰向けに置き、4本の手足すべてを固定して固定します。
  3. 1mLの注射器を使用して心臓から血液を採取します。
  4. ハサミを使って腹腔を開き、内臓と横隔膜を露出させます。
  5. ハサミで横隔膜と肋骨を切開し、右心房が見えるようにします。
  6. ハサミを使用して右心房に穴を開け、さらに血液を取り除きます。
  7. 舌を引っ張りながら、3つのコットンボールを動物の口に入れます。
  8. 頭を上げながらハサミで下顎を分離し(ノーズアップポジション)、NLFの血液汚染を抑制します。
  9. 血液汚染を避けるために、コットンボールを新しいものと交換してください。
  10. 出血が止まったら、200μLの滅菌PBSをチョアナに注入し、鼻孔から排出されたNLFを1.5mLチューブに回収します。
  11. 手順1.10をもう一度繰り返します。

2. ルミノール化学発光による血液汚染の検出

  1. 1.5 mLチューブを使用して、1 mgのルミノールと5 mgの過酸化ナトリウム(Na2O2)を1 mLの滅菌水に溶解し、ストック溶液を作製します。
    注:最終濃度は1 mg / mLルミノールと5 mg / mL Na2O2です。
  2. チューブをアルミホイルで覆い、使用するまで4°Cで保管します。
  3. ストック溶液を脱イオン水で10倍に希釈して、作業溶液を作ります。
    注:最終濃度は0.1 mg / mLルミノールと0.5 mg / mL Na2O2です。
  4. NLFサンプルの2μLを96ウェルプレートのウェルにピペットで移します。
  5. 希釈したルミノール溶液100μLを各ウェルに加えます。
  6. 96ウェルプレートを短時間振とうして、サンプルをルミノール溶液と混合します。
  7. 暗闇でルミノール化学発光を直接観察します。
  8. 必要に応じて、ルミノメーターを使用してHb濃度を半定量化します。

3. ELISAによるIgAおよびIgGの定量

  1. 96ウェルプレートのウェルに、100 μL/ウェルの全抗マウスIgA抗体(20 ng/well;200 ng/mL)またはIgG抗体(10 ng/well;100 ng/mL)をコーティングします( 材料表を参照)。
  2. プレートを密封し、4°Cで一晩インキュベートします。
  3. プレートを300 μL/ウェルのPBS中に0.05% Tween 20を含む洗浄バッファーで毎回3回洗浄し、プレートをペーパータオルで拭き取ります。
  4. 10%ウシ胎児血清(FBS)とPBS中の0.2%Tween 20を含むアッセイ希釈液200μLを各ウェルに加えます。
  5. プレートを室温(RT)で60分間インキュベートします。
  6. アッセイ希釈液を吸引し、プレートをペーパータオルで拭き取ります。
  7. アッセイ希釈液で 100 ng/mL のマウス IgA または IgG 標準試料を調製し、50 ng/mL、25 ng/mL、12.5 ng/mL、6.25 ng/mL、3.13 ng/mL、1.56 ng/mL、0.78 ng/mL の 2 倍段階希釈を行います。
    注:各標準試料の必要容量は、ウェルあたり100 μLです。
  8. アッセイ希釈液でサンプルを適切な希釈液(血清(104 〜106)、NLF(10、50、200、500)、BALF(101 〜104))で希釈します。
    注:各サンプルの必要容量は、ウェルあたり100μLです。
  9. 100 μL の IgA または IgG 標準試料とサンプルを適切なウェルに加えます。
  10. プレートをRTで75分間インキュベートします。
  11. プレートを毎回300μL /ウェルの洗浄バッファーで3回洗浄し、プレートをペーパータオルで拭き取ります。
  12. ペルオキシダーゼ標識抗マウスF(ab')2 抗体( 材料表を参照)をアッセイ希釈液で適切な希釈度(104倍希釈)で希釈します。
    注:必要な容量はウェルあたり100μLです。
  13. 希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスF(ab')2 抗体100 μLを各ウェルに加えます。
  14. プレートをRTで75分間インキュベートします。
  15. プレートを毎回300μL/ウェルの洗浄バッファーで5回洗浄し、プレートをペーパータワーで拭き取ります。
  16. テトラメチルベンジジン(TMB)と過酸化水素を含む基質溶液100 μLを各ウェルに加えます。
  17. プレートをRTで5分間インキュベートします。
  18. 各ウェルに50 μLの停止溶液、2 N硫酸(2N H2SO4)を加えます。
  19. マイクロプレートリーダーを使用して450nmでの吸光度を測定します。
  20. 標準曲線を利用して、各サンプル中のIgAおよびIgGの濃度を決定します。

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結果

従来の方法または新しい方法を使用して、NLFサンプルをC57BL / 6マウスから咽頭横断経路を通じて収集しました。 図1に示すように、従来の方法で収集されたNLFサンプルはわずかにピンクがかった色でした(図1A)。新しい方法で収集されたNLFサンプルは明確でした(図1B)。この差は、従来の方法ではNLF試料中の血液汚染によるものと考えられるため、NLF試料中の血液汚染をルミノール反応を用いて検討した。 図2に示すように、従来法で採取したNLF試料中の化学発光は陽性であり、血液汚染が示唆されました(図2A)。一方、新しい方法で収集されたNLFサンプルの化学発光は陰性でした(図2B)。マウスのもっともらしい出血傾向を否定するために、気管支肺胞洗浄液(BALF)も標準的な経気管法を使用し...

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ディスカッション

鼻洗浄は、インフルエンザやCOVID-19などの呼吸器疾患における生化学的、細胞学的、生物学的情報を取得するための貴重な技術です23。さまざまな浸潤細胞を同定するだけでなく、ELISA、イムノブロット、定量的ポリメラーゼ連鎖反応などのさまざまな方法を使用して、NLFサンプルから気道の非細胞組成を調べることができます1,19,24。ここでは、従来の方法と新しい方法の2つの異なるNLF収集方法を使用して比較研究が行われました。現在の研究では、血液汚染がNLFのIgAおよびIgG濃度に影響を与える可能性があることが示されました。血液汚染は下顎の分離中に発生した可能性が高いため、簡単な新しい方法が確立されました。マウスの口には、血液を吸収して口へのサンプルの流れを阻害するために3つのコットンボールが置かれたため、NLFの血液汚染は見られませんでし...

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開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

近畿大学医学部微生物学教室 大村誠一博士、Cong Thanh Nguyen医学博士、森口浩太医学博士、士郎玲央奈医学博士、Sandesh Rimal医学博士、BIKEN革新的ワクチン研究アライアンス研究所 ウイルスワクチングループ 海老名弘隆博士、岡村真也博士、吉岡康夫博士に感謝いたします。 大阪大学、有益なディスカッションをしてくれました。また、近畿大学生命科学研究所の皆様には、優れた技術協力をいただき、感謝申し上げます。本研究は、文部科学省の支援を受けて、文部科学省(文部科学省、2021-2025年度)奨学金(I.A.)、日本学術振興会科学研究費補助金(科学研究費)JP23K06493(F.S.)、JP21K07287/JP24K10500(A.-M.P.)、JP22K18378/JP24K10163(I.T.)、近畿大学研究振興費KD2406(F.S.)、KD2506(I.T.)の支援を受けて行われました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
動物固定針夏目製作所株式会社、東京都、日本KN-358-A動物固定針でマウスを固定しました。ステンレススチール;全長、23 mm;針先、15 mm。
BD OptEIATM TMB 基質試薬セットBD Biosciences、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国555214100 &mu を追加しました。ウェルあたりの TMB 基質溶液の L。
ベルジャーNANA 麻酔にベルジャーを使用しました。
透明な平底免疫非滅菌 96 ウェル プレート ThermoFisher Scientific、ニューヨーク州ロチェスター、米国442404素結合免疫吸着アッセイには、MaxiSorp表面処理を施した透明な平底免疫非滅菌96ウェルプレートを使用しました。
綿球Sansho Co., Ltd., Tokyo, Japan94-1951血液汚染を避けるために綿球を使用しました。綿球の直径は7mmでした。
ウシ胎児血清Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA172012-500 MLッセイ希釈液にウシ胎児血清を10%添加しました。
鉗子(研究実験用マイクロピンセット、先端を曲げたSansho Co., Ltd., Tokyo, Japan91-1506解剖に鉗子を使用しました。モデル、HSC 551-10;全長105mm。
鉗子(精密ピンセット)Sansho Co., Ltd., Tokyo, Japan91-2772鉗子を解剖に使用しました。モデル、HSC 607-12;全長、120 mm。先端の直径は0.3mmです。
ヤギ抗マウス IgA-UNLBSouthernBiotech、アラバマ州バーミンガム、米国1040-01透明な平底免疫非滅菌 96 ウェル プレートを 100 & mu でコーティングしました。総免疫グロブリン A の L/ウェル (20 ng/ウェル)。
イソフルラン Viatris Inc.、Canonsburg、ペンシルベニア州、米国NA酔にはイソフルランを使用しました。
ルミノール レクト試薬セット富士フイルム和光ピュアケミカル株式会社, 大阪, 日本124-06511ルミノール反応試薬セットを使用して、NLF サンプル中のヘモグロビンを検出しました。
マイクロチューブトソン株式会社、東京都、日本131-7155CNLFおよびBALFの収集には、マイクロチューブ(ロックキャップ付き1.5mLマイクロチューブ、丸底、ソフトタッチキャップ)を使用しました。
Milli-Q waterMerck KGaA、ダルムシュタット、ドイツMilli-Q Direct 8MilliQ 水を使用してルミノール整流溶液を作成しました。
Mini-Shaker PSU-2TBiosan Ltd.、リガ、ラトビアPSU-2TMini-Shaler PSU-2T を使用して 96 ウェルプレートをシェイクしました。
マウス系統CLEA Japan, Inc., Tokyo,Japan NA後 4 か月の C57BL/6 雄マウスを使用しました。
Nunc MicroWell 96ウェル、Nunclon Delta処理、平底マイクロプレートThermo Fisher Scientific Nunc A/S .Kamstrupvej、ロスキレ、デンマーク136101ルミノール試験には、NuncTMMicroWellTM 96 ウェル、Nunclon Delta 処理、平底マイクロプレートを使用しました。
ペルオキシダーゼ結合 AffiniPure F(ab')2 フラグメントヤギ抗マウス IgG、F(ab')2 フラグメント特異的 (ヒト、ウシ、およびウマの血清タンパク質に対する最小限の交差反応)Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.、ウェストグローブ、ペンシルバニア州、米国115-036-072100 &mu を追加しました。ペルオキシダーゼ結合AffiniPure F(ab')2フラグメントヤギ抗マウスIgG、F(ab')2フラグメント特異的、各ウェルへの検出抗体(10,000倍希釈)として。
酸緩衝生理食塩水Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USAD8537-500MLNLFおよびBALFの収集には、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムを使用せずに修飾、液体、滅菌ろ過、細胞カルチュアに適しています)を使用しました。
ピペット ワトソン株式会社、東京、日本NA200-&muを使用しました。L鼻洗浄用ピペット。
ピペットチップワトソン株式会社、東京、日本NA200-&mu を使用しました。L型マルチフィット・ピペットチップ 鼻洗浄用。
ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート(トゥイーン20)富士フイルム和光ピュアケミカル株式会社、大阪、日本167-11515バッファーに0.05%のトゥイーン20を、アッセイ希釈液に0.2%のトゥイーン20を添加しました。
精製ヤギ抗マウス IgG (最小 x 反応性) 抗体BioLegend、カリフォルニア州サンディエゴ、米国405301透明な平底免疫非滅菌 96 ウェル プレートを 100 & mu でコーティングしました。総免疫グロブリンGのL /ウェル(10 ng /ウェル)。
小型ハサミ、両尖山椒株式会社、東京都、日本91-7005にはハサミを使用しました。モデル、S-4A;全長115mm。
和光純化学工業株式会社、東京都、日本192-0475550 &反応を停止するために各ウェルに2N硫酸のL。
Surflo静脈カテーテル テルモコーポレーション、東京、日本 SR-FS2032サーフロ静脈カテーテルを使用し、気管支肺胞洗浄のために気管にPBSを注入しました。カテーテル、20G;カテーテルの長さ、32 mm;カテーテル内径、0.80 mm;カテーテル外径、1.1 mm;内針、22G。
外科用ストレートハサミSansho Co., Ltd., Tokyo, Japan91-7004解剖にはハサミを使用しました。モデル、S-3B;全長120mm。
サージルカルプレート夏目製作所株式会社、東京、日本KN-321-Bにはコルク板を使用しました。深さ、20 cm;幅、15cm;高さ3cm。
Synergy H1 ハイブリッド マルチモード マイクロプレート リーダー Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USANAナジーH1ハイブリッドマルチモードマイクロプレートリーダーを使用して、サンプルの吸光度を450 nmで測定しました。
リンジモ株式会社、東京、日本 SS-01T心臓からの採血には1mLの注射器を使用しました。
スレッド 日朝工業株式会社 東京 日本NA手術中に適切な位置決めが確保されるように、カテーテルを糸で結びました。
酵ア) 麻ワ 生リン洗浄解剖硫酸 解剖シシテル

参考文献

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