方法論記事

ローズベンガルを用いた光線力学療法の in vitro 応用のための革新的LED照明装置の開発

DOI：

10.3791/68462

⸱

2025年9月12日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Inserm, CHU Lille, U1189-ONCO-THAI-Assisted Laser Therapy and Immunotherapy for Oncology, University of Lille, 2CNRS, Inserm, CHU Lille, UMR9020-U1277-CANTHER-Cancer Heterogeneity Plasticity and Resistance to Therapies, University of Lille

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この原稿は、ローズベンガルを介した光線力学療法を in vitroで研究するための、斬新で革新的な3Dプリント照明装置を紹介しています。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この記事では、ローズベンガル(RB)を介したPDTの有効性を in vitroで評価するための新しい光線力学療法(PDT)デバイスについて説明します。CELL-LED-550/3と呼ばれるこの装置は、2つの3Dプリント部品で構成されており、1つは1つのLEDから550nmの緑色の光を生成し(光源部分)、もう1つはこの光を96ウェルの細胞培養プレート(配光部分)に分配します。光源部分は3つの異なるモードを持つドライバーによって制御され、配光器部分は井戸の底面外面に3つの異なる放射照度レベル(0.02 mW/cm2、0.23 mW/cm2、または0.62 mW/cm2)を供給できます。配光部分は、井戸を個別に同時に照らすように設計されています。CELL-LED-550/3 デバイスの関連性を実証するために、HepG2 肝細胞癌細胞に対する RB 媒介 PDT による細胞死を誘導するその能力が評価されました。まず、HepG2細胞を、約550 nmで吸収ピーク(最も高いもの)を持つ光増感剤であるローズベンガルの濃度を上げて2時間処理しました。次に、処理された細胞を、0.3 J/cm2、0.6 J/cm2、および1.2 J/cm2 の光線量で最大放射照度レベルに設定したCELL-LED-550/3デバイスを使用して照射しました(それぞれ、照明時間は8分4秒、16分と8秒、および32分と16秒)。最後に、PDT 後 24 時間で Cell-Titer Glo を使用して生存率を測定しました。実験結果は、CELL-LED-550/3デバイスを使用したRBを介したPDTが、ローズベンガルの濃度と投与された光の線量の両方に依存する方法で、HepG2細胞の生存率の低下を誘導できることを示しています。この記事で紹介した概念実証に基づいて、CELL-LED-550/3デバイスは、RBを介したPDTの研究にさらなるツールを追加します。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

2020年には90万5,000人以上の新規症例と83万人の死亡者が発生し、原発性肝臓がんは世界で7番目に多いがんであり、がん関連死の原因の第2位です1。原発性肝がんの中では、肝細胞がん(HCC)が最も一般的な形態であり、症例の約90%を占めています2。慢性肝疾患が検出されておらず、サーベイランスのコンプライアンスが不十分であるため、HCC 患者のわずか 25% が疾患の初期段階で診断されます3。これらの早期診断された患者は通常、治癒を目的とした肝切除、肝移植、または局所切除療法によって治療され、5 年生存率が 70% を超える良好な予後を示します 4,5。残りの 75% の患者 (中期または後期診断の HCC 患者) については、標的療法、免疫療法、併用療法などの革新的な治療法が生存利益をもたらしますが6、予後は非常に悪いままです: 5 年生存率は実際にはこのグループの患者では 30% を超えず、転移性患者のサブグループでは 2% に低下します6.したがって、中期または進行期の HCC 患者の治療結果を改善し、生存期間を延長するには、代替治療の選択肢を模索することが重要です。皮膚科で広く実践されている抗がん療法である光線力学療法(PDT) 7 は、適切な代替候補となる可能性があります。

PDTは、光増感剤(PS)、可視光の適切な波長、および分子状酸素の使用を組み合わせて細胞傷害性活性酸素種(ROS)を生成する光化学処理です8。PDTの抗がん効果は、3つのROS誘発メカニズム9に由来します:最初に、悪性細胞に対する直接的な細胞毒性効果10、次に腫瘍組織の低酸素症、栄養の剥奪と退行を誘発する腫瘍血管系の損傷11、そして最後に、損傷または死にかけている腫瘍細胞からの危険信号と腫瘍抗原の放出による炎症反応の誘導12.30年以上にわたり、PDTは、さまざまな種類や形態のがんを治療する可能性を評価することを目的とした集中的な研究の対象となってきました13,14,15,16,17,18。これらの調査19、20、21 から証明されたその有効性に基づいて、PDT は現在、非黒色腫皮膚がんの治療のために皮膚科で使用されています7。他の適応症については、近年臨床研究の数が増加しており、単独で、または標準治療と組み合わせて使用されるPDTを臨床現場に導入するための多大な努力が実証されています22,23,24。

PDT25には、さまざまな光増感剤が存在します。その中で、ローズベンガル(RB)は、喉頭腫瘍細胞26、黒色腫細胞27、乳がん細胞28、および前立腺癌組織29に対する効率的な光線力学的剤として作用することが示されています29。この記事で紹介する研究は、RBを介したPDTがHCC細胞に対しても有効であるかどうかを評価する必要性に基づいています。

このような評価には、96ウェル細胞培養プレートの550nm照明専用の緑色LEDベースのデバイスの事前開発が必要でした。このデバイス30のために、2つの部分から設計が実装されました:光源部分は単一のLEDから550nmの緑色光を生成し、一方、配光器部分は、光ファイバーバンドルを使用して、この光を個別に96ウェルに分配し、LEDから離れた場所に分配します。この2部構成の設計は、第一に、LED内で発生する制御不能な熱によって発生する可能性のある有害な熱効果から細胞を防ぎ、第二に、電子部品(LEDを含む)を備えた光源部分を外部に保ちながら、細胞培養インキュベーター内の細胞を照らすことを可能にします。これらの革新的な機能により、いわゆるCELL-LED-550/3デバイスは、マルチウェルプレート照明用に特別に設計されたすでに公開されているLEDベースのシステムよりも大きな利点があります31、32、33、34、35。

この記事では、CELL-LED-550/3デバイスについて最初に詳しく説明します。次に、概念実証として、細胞生存率研究は、2D HCC細胞培養モデル(HepG2)30でCELL-LED-550 / 3を使用したRB媒介PDTの有効性を実証します。したがって、CELL-LED-550/3デバイスは、安価で持ち運びに便利なだけでなく、RBを介したPDT実験にも特に関連するツールです。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究で使用した試薬と機器の詳細は 、材料表に記載されています。

1. デバイス構築

注:CELL-LED-550/3デバイスの2つの部品は別々に製造されており、最後のステップとしてのみ接続されます。

  1. 光源部の構造
    1. 550 nm 3 W LED が取り付けられているプリント基板 (PCB) の裏側に、適切なサイズのファンヒートシンクアセンブリを取り付けます。
    2. LEDを透明なPMMA(ポリメタクリレートメチル)コリメートレンズで覆い、最初に光ビームを均質化し、次にビーム角度を120°から10°に減らします。このような削減により、配光部に供給される光の量を増やすことができます。
    3. LEDをトライモード調光で電流ドライバに接続することで、異なる放射照度レベルを提供できます。
    4. ハウジング、ハウジングの前面、ハウジングの閉鎖を3Dプリントで別々に構築します( 図1の赤いボックス)。
    5. ドライバと、レンズとファンヒートシンクアセンブリの両方が装備されているLEDを、ハウジング内の専用の場所( 図1の青いボックス)に取り付けます。
    6. 電源ジャックとロッカースイッチをハウジングクロージャーの専用の場所に取り付けます( 図1の青いボックス)。
    7. ドライバとファンヒートシンクアセンブリをロッカースイッチを介して電源ジャックに接続します。
    8. ハウジング、ハウジングクロージャー、およびハウジングフロントを組み立てます。
    9. LEDがハウジング前面の円筒形の開口部の軸に揃っていることを確認します。
      注意: ハウジング前面の円筒形の開口部は、光源部分(メスコネクタ)と配光部(オスコネクタ)の光接続を目的としています。

figure-protocol-1
図1: 光源部分の正面(A)、背面(B)、分解図(C)の立体図。Lefebvre, A. et al.30 から改作。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

  1. 配光部の構造
    1. 3D プリントでは、ハウジングの下部クロージャー、ハウジング、上部のクロージャーを別々に構築します (一緒になって中空のボックスを形成します) ( 図 2 の赤いボックス)。
    2. 96ウェルスペーサーを白い3Dプリント( 図2の赤いボックス)で構築し、1.2.1で説明した中空のボックスに正確に収まるようにします。白色は、光の反射を最大化し、配光を最適化することを目的としています。
      注:96ウェルスペーサーに存在する円形開口部の直径と中心間隔は、生物学的アッセイに使用される96ウェルプレートのウェルの直径と中心間隔と等しくなければなりません。
    3. 中空ボックスの上部クロージャーに96個の小さな穴を開けて、96ウェルスペーサーの96個の円形開口部の中心に揃えるようにし、後者を上部クロージャーに配置します。
    4. 直径0.5mmのプラスチック光ファイバーを、上部クロージャーの96個の小さな穴のそれぞれに下から上に挿入します。
    5. 上部クロージャーの下部にポリエステル樹脂を塗布し、96本の光ファイバーを上部部に接着します。
    6. 樹脂が乾いたら、光ファイバーの遠位端が上部クロージャーの上部に調整されるまで研磨します。
    7. 手順1.2.1で説明した中空ボックス内の光ファイバーを、箱から約2メートル伸びるシースで保護された単一の束に集めます。
      メモ: ボックスの高さは、光ファイバーの曲がりや光の減衰を防ぐのに十分である必要があります。
    8. ファイバー束がハウジングの専用開口部を通過するように中空ボックスを組み立てます。
    9. 光ファイバーの近位端を3Dプリントされたオスコネクタにセットし、光源部分(メスコネクタ)に接続できるようにします。
      注意: このコネクタは、この接着剤が引き起こす可能性のある光の減衰を防ぐために、接着剤を必要としません。
    10. 96ウェルスペーサーを中空ボックスに置きます。
    11. 透明なPMMAプレート(底面)と傷防止マイラーシート(上面)の間にトレーシングペーパーを挿入してスクリーンを作成し、各光ファイバー遠位端に送達された細いビームを、生物学的アッセイに使用される96ウェルプレートのウェル直径と同じくらい大きなビームに拡散させます。
    12. 3Dプリントでスクリーンフレーム( 図2の赤いボックス)を構築し、その中央の開口部が生物学的アッセイに使用される96ウェルプレートのサイズに正確にフィットするようにし、それによってウェルが96ウェルスペーサーの円形の開口部と完全に揃うようにします。
    13. スクリーンフレームで96ウェルスペーサーの上部にスクリーンを固定します。

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図2: 配光器部分の3次元図。Lefebvre, A. et al.30 から改作。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

  1. 光源部と配光部の組立
    1. 配光部のオスコネクタを光源部のメスコネクタに差し込みます。
      注: オス コネクタをメス コネクタに接続すると、光源部分から供給される光ビームは、配光部の受光素子の表面積より少し多くカバーし、96 本の光ファイバーへの光の供給を確実にする必要があります。

2. 生物学的アッセイ

  1. 細胞培養プロセス
    1. 10%の熱不活化ウシ血清と1%のストレプトマイシンとペニシリンを添加したRPMI 1640培地で肝癌細胞株HepG2を培養します。
    2. HepG2細胞を含む培養フラスコを5%CO2 細胞培養インキュベーターで37°Cに維持します。
    3. フラスコから培地を吸引し、以前に37°Cに加熱したRPMI 1640培地と交換することにより、培地を3日ごとに交換します。
    4. 顕微鏡を使用して、培養フラスコ内の細胞が80%〜90%の合流に達するまで合流を確認します。
  2. 播種プロセス
    1. 細胞をインキュベーターから取り出し、事前に洗浄された微生物安全ステーションの下に置きます。
    2. 培地を培養フラスコから取り出します。
    3. 培養フラスコをリン酸緩衝液で洗浄します。
    4. 3 mLのトリプシン(0.25%、0.53 mM)を細胞に塗布し、培養フラスコを37°Cのインキュベーターに5分間入れて細胞を分離します。
    5. 5分後、7 mLの培地で培養フラスコからトリプシンを回収し、培地+トリプシン+細胞の溶液全体を15 mLチューブで回収します。
    6. セルカウンターを使用して細胞をカウントします。これを行うには、細胞を含む溶液20 μLを取り、チューブに入れます。20 μLのトリパンブルー溶液を加え、セル+トリパンブルー溶液を計数スライドに置き、セルカウンターに挿入します。
    7. 細胞をカウントしたら、培地で希釈して150,000細胞/ mL溶液を取得し、1.5x104 細胞/ウェルの速度で透明な平底の白い96ウェルプレートに細胞を播種します。白色は、井戸内の光の反射と分布を最大化することを目的としています。
      注:ウェルあたりの細胞数は、使用する細胞株に応じて調整する必要があります。播種する適切な数の細胞を見つけるために、事前の密度テストが必要になる場合があります。
    8. 生存率読み取り時間ごとに2枚のプレートを準備します。1 つのプレートが点灯し、もう 1 つのプレートは暗いままになります。
    9. 細胞の付着を可能にするために、処理前にプレートを24時間インキュベートします。
  3. ローズベンガルトリートメント
    1. ローズベンガル粉末を10%生理食塩水に再構成することにより、ローズベンガルのストック溶液を調製します。この溶液は、その安定性によるローズベンガルの劣化を避けるために、細胞処理の直前に調製する必要があります。
    2. 以前に調製したローズベンガル原液を細胞培養培地で希釈することにより、濃度を増加(0 μM、5 μM、10 μM、25 μM、50 μM、75 μM、100 μM)で調製します。
    3. 溶液が調製されたら、細胞を含むプレートから培地を取り出し、100 μlのローズベンガル処理溶液を加えます。
    4. ローズベンガル処理で細胞を2時間インキュベートして、ローズベンガルの内在化を可能にします。
      注:ローズベンガル溶液のインキュベーション時間は、使用する細胞株によって異なる場合があります。ローズベンガルの取り込みの速度論は、研究する各細胞株の適切なインキュベーション時間を見つけるために、蛍光測定によって微調整する必要がある場合があります。
    5. 2時間後、ローズベンガル溶液を取り出し、細胞をPBSで2回洗浄し、100 μL/ウェルのローズベンガルフリー培地を加えます。
      注:高濃度のローズベンガルには、PBSによる追加の洗浄が必要になる場合があります。セルが正しく洗浄されていることを目視でチェックすることができます。十分にすすぎると、細胞の外にローズベンガルが存在するため、PBSはピンク色を帯びることはありません。
    6. マイクロプレートをアルミホイルで覆い、光にさらされないように保護します。PDTアッセイのためにプレートの半分を照らします(ステップ2.4を参照)。非照明プレートは、PDT 結果 (暗い状態) の制御データを提供します。また、非光活性化ローズベンガルが細胞生存率に及ぼす影響に関するデータも提供します。他のマイクロプレートは、デバイス内の光への曝露に使用されます (PDT 条件)。
  4. CELL-LED-550/3デバイスの操作手順
    1. 配光板のオスコネクタを光源のメスコネクタに接続します。次に、光源をコンセントに差し込みます。
    2. インキュベーターから2つのマイクロプレート(PDT +ダーク状態)を取り出し、PDT条件のアルミニウムを取り除き、このプレートを配光器に置きます。
    3. ドライバーの調光器を最大レベルに設定して、LEDから供給される電力を最大化し、96ウェルで0.62 mW / cm2 の平均放射照度を取得します。
      注:ドライバーの調光器は、生物学的アッセイに最適な値(利用可能な3つの値のうち)に設定する必要があります。ドライバーの調光器が何であれ、供給される放射照度が低いため、安全メガネを使用する必要はありません。
    4. セルに所望の光量に達するまでプレートを照らします。目的の光線量を得るには、次の式を参照して、時間と放射照度の2つのパラメータを調整できます。
      光線量(J / cm2 )=放射照度(W / cm2)×時間(式1)。
      放射照度は、ドライバー調光器を調整して、それぞれ0.02mW/cm2、0.23mW/cm2、または0.62mW/cm2を得ることで変調できます。選択した放射照度から、式1を使用して、目標光量を達成するために必要な照明時間を計算できます。
    5. 希望の光量に達したら、デバイスの電源を切ります。PDTマイクロプレートをアルミニウムに交換し、生存率試験が実行されるまで、コントロールプレートと一緒にインキュベーターに戻します。
    6. オプション:必要に応じて、上記と同じ手順を使用して、他のプレートを照らします。
  5. 細胞生存率アッセイ
    1. PDTアッセイの後、照射されたプレートをインキュベーターに24時間放置してから、照射された細胞の生存率を測定することによってPDTが照射した細胞に及ぼす影響を測定します。インキュベーション時間を変えて、細胞に対するPDTの多かれ少なかれ長期的な影響を研究することができます。PDT後のインキュベーション時間ごとに、非照明プレート(暗条件)を同じ期間インキュベートする必要があります。
    2. インキュベーション期間の後、1つの照明プレートと1つの非照明プレートを取り、細胞生存率アッセイキットから100 μLの試薬を各ウェルに加え、ミトコンドリア代謝と細胞によるATP産生に基づいて細胞生存率を測定します。
    3. 細胞生存率測定の前に、マルチプレートを暗所で10分間インキュベートします。
    4. 10分間のインキュベーション後、マルチモーダルリーダーを使用して各ウェルで放出される発光を読み取ります。放出される発光は、細胞生存率アッセイ溶液の添加時の生細胞によるATPの産生に比例します。
    5. 未処理(NT)条件の発光値を100%の生存率と見なし、処理条件の発光値をNT条件に正規化して、各処理によって誘導される生存率のパーセンテージを求めます。
    6. PDT治療後の読み取り時間ごとに同じ細胞生存率読み取りプロトコルを繰り返します(例:治療後24時間、48時間、および72時間)。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

図3に示すように、CELL-LED-550/3デバイスは、550nmの緑色光で96ウェルプレートの下から均質な照明を可能にします。

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図3: 室内照明がオン(A)またはオフ(B)に切り替わったときの96ウェルプレートの例示照明中のCELL-LED-550/3デバイスの写真。Lefebvre, A. et al.30 から改作。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

各ウェルは、光ファイバーの束を使用して、単一のLED(最大2メートル)から離れて個別に照らされます(図4)。

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図4: 単一のLEDから離れた96ウェルプレートのウェルを個別に照らすことができる光ファイバーバンドル。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

CELL-LED-550/3 デバイスの有効性を確立するために、HepG2 肝癌細胞株で RB を介した PDT を誘導するその能力が評価されました。細胞は、照明前の2時間、0〜100μMの範囲のローズベンガルの濃度を増加させて処理しました。このような濃度範囲の使用は、緑色の光にさらされたときにHepG2細胞を殺すローズベンガルの有効用量(EC50)を決定することを目的としていました。HEPG2細胞における細胞死の誘導に対するCELL-LED-550/3デバイスによって供給される光線量の影響も研究されました。これを行うために、細胞を0.62 mW / cm2 の強度で8分9秒、16分18秒、または32分36秒の光にさらして、それぞれ0.30 J / cm2、0.60 J / cm2、および1.22 J / cm2の光線量を取得しました。

まず、ローズベンガル(光条件、 図5)がない場合の照明のみは、受けた光の線量に関係なく、HepG2細胞の生存率に影響を与えないことが観察されました。また、光がない場合(RB条件、 図5)ベンガルローズ単独では、テストされた条件のいずれについても細胞生存率の変化を誘発しなかったことも観察されました。対照的に、結果は、CELL-LED-550/3を使用したRB媒介PDTがHepG2細胞を殺すことができることを示しています。さらに、光量の増加と相関して有効性の増加が観察され、最大有効濃度(EC50)は、0.30 J/cm2の光量で34.3 μM、0.60 J/cm2の線量で26.6 μM、1.2 J/cm2の線量で6.8 μMでした。

これらの結果は、RBを介したPDTに対するこの新しいPDTデバイスの有効性を裏付けました(図5)。

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図5: HepG2細胞株の生存率に対するデバイスの有効性。HepG2 の処理後 24 時間の生存率の割合。NT、未処理;RB、光増感剤のみ(0 μM、5 μM、10 μM、25 μM、50 μM、75 μM、および100 μM);光、0.30 J/cm2、0.60 J/cm2、 および 1.22 J/cm2 の照明。PDT、RB処理による照明。結果は、NTのパーセンテージで表される3つの独立した実験のSEM±平均として表示されます。二元配置分散分析検定が実行され、 p ≤ 0.01 (**)。 p ≤ 0.0001 (****) は統計的に有意であると見なされ、p ≥ 0.05 は有意ではないと見なされます (NS)。Lefebvre, A. et al.30 から改作。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この記事では、RBを介したPDT専用の革新的な照明デバイスをin vitroで開発するためのプロトコルと、CELL-LED-550/3デバイスの概念実証を実装するためのプロトコルの両方について説明します。

CELL-LED-550/3は2つの部分で構成され、それぞれに特定の機能があります。光源部分と呼ばれる最初の部分の目的は、単一の LED から、2 番目の部分の光ファイバー束の直径よりも大きい直径の均質な緑色の光ビームを生成することです。この後者は配光部と呼ばれ、光源部から供給される光を光ファイバー束を介して、LEDから離れた96ウェルプレートのウェルに個別に分配することを目的としています。LEDから最大2.5mの距離で、LED内で発生する制御不能な熱によって発生する可能性のある有害な熱効果のリスクなしに、セルを必要なだけ点灯させることができます。

この機能は、96ウェルプレート照明31、32、33、34、35、36用に特別に設計された他のLEDベースのシステムに対するCELL-LED-550/3の最初の重要な利点を提供します。実際、他のすべてのシステムでは、LEDをセルからわずか数センチメートル下(通常は5cm未満)に配置する必要がありますが、これはセルに対するLED関連の有害な熱効果のリスクを排除するには不十分です。このようなリスクを制限するために、これらの他のシステムのほとんど(残念ながら、一部は含まれていません)は、セルに非常(過度に)近い位置に配置されることがあるLED冷却システム32,34,35を含み、結果として生じる熱変動によって逆効果の影響を受ける可能性があります。CELL-LED-550/3デバイスを2つの部分に分けて設計することで、他のほとんどの既存のLEDベースのシステム31,32,33,35,36に比べて別の重要な利点が得られます:これにより、デバイスにリスクを負うことなく、細胞培養インキュベーター内の細胞を照らすことができます。電子部品を含まない配光部分は実際にインキュベーター内に設置できますが、湿気の多い環境に敏感な電子部品を含む光源部分は、腐食や故障のリスクを防ぐために屋外に保管されます。電子部品を含むいくつかの既存のLEDベースのシステムは、インキュベーター内の照明を可能にしますが、そのような使用は、第一に、設計者/製造業者によって推奨されておらず、第二に、使用後に「適切な」乾燥が必要です33,34。インキュベーター内の細胞を照らし、プロトコル中に細胞を同じ生理学的条件(温度、湿度、およびCO2濃度)下に維持する能力は、特に長い照明時間を必要とするプロトコルの場合、PDT後の細胞生存率の評価における潜在的なバイアスを回避するために重要です。また、CELL-LED-550/3デバイスには、96個のウェルすべてを個別に同時に照らすための単一のLEDが含まれていることも強調する必要があります。この独創的で革新的な機能は、他の上記のLEDベースのシステム31、32、33、34、35、36では利用できない。これらのシステムのほとんどは、96個のLEDを含み、各ウェルの下に1つのLEDが配置されているため、96個の個別のビーム31、33、34、36を供給し、残りのシステムは、ウェルプレートから数センチメートルに配置された6〜25個のLEDから、ウェルの全部または一部をカバーするグローバルビーム31、32、35を提供する.文献に基づくと、CELL-LED-550/3 が光ファイバー束を使用して行うように、単一の LED から 96 個の個別のビームを生成することは、これまで提案されたことがありません。

光源部分には、2つの主要な基準に従って選択された550nm 3 W LEDが含まれています。まず、LEDの発光スペクトル(したがってその中心波長)は、RB光増感剤の吸収スペクトルと重なる必要があります。このようなオーバーラップは、選択した LED (中心波長: 554.4 nm;FWHM:106.4 nm;どちらもLefebvre et al.30で説明されている方法論に従って推定されています)(図6)は、RBの光活性化、ひいてはRBを介したPDTの誘導に不可欠です。次に、LEDの光パワーは5W未満である必要があります。この出力制限は、光源部分に含まれるコリメートレンズの許容出力と、配光器部分に含まれる光ファイバー束の許容出力によって課されます。

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図6: 水中でのローズベンガルの吸収スペクトル。水中のローズベンガルの最大正規化吸収スペクトルは左軸に従ってプロットされ、CELL-LED-550/3の平均スペクトル放射照度は右軸に従ってスケーリングされます。平均スペクトル放射照度のプロファイルは、メーカーの Web サイトで入手可能な LED のプロファイルと一致しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

デバイスの 2 つの部分間の光結合は重要な要素です。この結合は、一方では、3 W LED から発せられる光を最大限狭いビームに集め、他方ではこのビームを光ファイバー束に注入することを目的としています。最初の目的については、PCB(プリント基板)実装LED専用に設計された焦点距離の短い非球面コリメートレンズにより、120度のLEDビームを空間的に均一な分布の10度の狭いビームに集中させることができます。さらに、得られたビームは正方形の LED チップの画像を投影し、最初のビームで得られたものと比較して鮮明さが向上し、光学収差が低減されます。この細いビームを光ファイバー束に注入するには、4つの重要な点に対処する必要があります。まず、直径96 mmの0.5 mmのPMMA(ポリメタクリレートメチル)光ファイバー(開口数:0.2)の近位端を自家製のコネクタに集めて、側面5 mmの正方形の受光面を形成します(図7)。光の損失を制限するために、ビームによるLEDチップの正方形の突起に沿った正方形の形状が、コネクタの通常の丸いものよりも好まれました。第二に、自家製コネクタは接着剤を必要としないように設計されており、光の吸収を制限し、材料の過熱/炭化を防ぐために、透き通った樹脂を使用して 3D プリントされています。第三に、コネクタの受光面と最終面は、最大の光が通過するように研磨ホイールを使用して研磨されました。第四に、そして最後に、レンズと正方形の受光面の間の距離を理論的に決定し、正方形の LED 投影の最も均質な中央部分が受光面よりも少し重なるように光学ベンチで調整しました。

このような結合により、10度の狭いビームで1.25Wの電力が得られ、96本の光ファイバの束で伝送される総電力は0.12Wになります(LEDライトに適したフォトダイオードセンサー(OPHIR)が使用されました)。

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図7: 96本の光ファイバーを自家製コネクタに集めて得られた正方形の受光面。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

CELL-LED-550/3は、ウェルの底面外面に0.62 mW/cm2 (標準偏差:0.09 mW/cm2)(図8)の平均放射照度を提供します。上記の結合効率を考慮したこの平均値は、Lefebvreおよびal.30で詳細に説明されている方法論に従って、経時的に安定していることが推定され、証明されました(変動係数は0.6%未満)。このような低い放射照度(96ウェルプレート照明用に特別に設計された上記の他のLEDベースのシステムによって提供される放射照度よりも低い)により、照明だけではHepG2細胞の生存率に影響を与えないことが証明されていますが、RBを介したPDTでは非常に高い効率に達しています。効率を確保するためにより高い放射照度を必要とするPDTプロトコルでは、複数のLEDを使用することができ、したがって、各光ファイバーに注入される光パワーが数十ミリワットの許容電力を超えない限り、複数の光源部品を実装できます。

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図8: プレートの96ウェルに供給される放射照度の分布を表すヒストグラム。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

光源部分のLEDのみを別の適切なものに置き換えることで、別のCELL-LEDデバイスを得ることができます。LED は、可視範囲 (光ファイバー束の仕様による) で (上記の理由により) 5 W 未満の光パワーを放出する場合、適切であるとみなされます。このようなLEDはかなりの数存在するため、多種多様なCELL-LEDデバイスを開発することができ、それによって多くのPDTプロトコルを in vitroで評価することができます。PDTプロトコルが与えられた場合、考慮される光増感剤の吸収スペクトルと最良のオーバーラップを提供するLEDは、すべての適切なLEDの中で明らかに優先されるはずです。LEDを交換する場合は、ファンヒートシンクアセンブリに特に注意を払う必要があります。実際、このアセンブリは、LEDとドライバーの両方の過熱とその後の劣化を防ぐために、適切なサイズにする必要があります。さらに、LEDの変更には、新しい光学的および熱的特性評価が必要になります。

単一のLEDを単純に置き換えることでほとんどの光増感剤を光活性化できる可能性と、インキュベーター内の細胞を照らす可能性の両方が、既存のものと比較してこのデバイスに真の付加価値を提供します。

開示事項

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著者は利益相反を宣言しません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、私たちの研究を支援してくれたフランスのリール中央病院とINSERMに感謝したいと思います。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
550 NM 3 プリント基板に取り付けられたW LED オスラムオスターKP CSLPM1。F1
75 cm2 培養細胞フラスコザルシュテット3911002
プラスチック光ファイバー100本(直径0.5mm)の束アルセンシエルLEDファイバー05EGMグローエンドPMMA 0.5径 - Lng 200メートル    http://arcenciel-led.fr/accueil/193-fibre-optique-end-glow-05mm-prix-au-m.html
セルカウンターサーモフィッシャーAMQAF2000オプションで、マイクロコスコープでカウントできます
細胞培養インキュベーターPHCI(ダッチャー)MCO-170AICUVD-PE
細胞力価GloプロメガG7571
透明PMMAコリメートレンズグレックストア14mmレンズ10度;Aliexpress - 14 mm対応DELコリメートレンズ
カラーファブ ブラックカラーファブ SKU 020014FDA食品接触コンプライアンス
カラーファブ ホワイトカラーファブ SKU 020013FDA食品接触コンプライアンス
トライモード調光付き電流ドライバ(CDMドライバ)CDMドライバBD392200 mA
エポキシ樹脂 Cléオパトレクリスタルダイヤモンドクリスタルダイヤモンド 150mL
ファンヒートシンクアセンブリボイド
HepG2細胞ATCCのHB-8065
マルチモーダルリーダー(CLARIOstar Plus)BMGラボテック430-2927
リン酸緩衝液サーモフィッシャー20012-068
PMMA(ポリメタクリレートメチル)光ファイバ(開口数:0.2)広州Mayki照明株式会社
電源ジャックRSプロ907-5680
RMPI1640サーモフィッシャー21875-091
ロッカースイッチ RSプロ419-744
ローズベンゲールサーモフィッシャー / メルクA17053.14 / 330000-1G
傷防止マイラーシートRSプロ電話番号:785-0802
鞘オープロテクト&オスラッシュ;8,5 mm / &オスラッシュ;外線 11 mmPPポリプロピルène UVプルーフブラック波形シースが割れていない
SVFのユーロビオCVF SVF00-01
トレーシングペーパーカンソン79368730
透明PMMAプレートRSプロ電話番号:284-6269
トリパンブルーサーモフィッシャー15250061
トリプシンサーモフィッシャー25200-072
アルティメーカー 2+アルティメーカー
白い透明底96ウェルプレートダッチャー655098

参考文献

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