現在、慢性細菌感染症に対する薬物スクリーニングに適した in vivo モデルが不足しています。ここでは、ゼブラフィッシュの幼生に持続的な感染を引き起こす ための緑膿菌 臨床分離株による創傷感染のプロトコルについて説明します。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
訂正のお知らせ
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
サマリー
要約
緑膿菌は、特に慢性創傷感染症および慢性肺感染症(特に嚢胞性線維症(CF)患者)における主要なヒト病原体です。慢性細菌感染症は抗生物質治療に抵抗性であり、効率的な治療法を開発するために薬物スクリーニングに適したin vivo慢性感染モデルが緊急に必要とされています。ここでは、ゼブラフィッシュの幼生に持続的な創傷感染を引き起こすための、緑色蛍光タンパク質(GFP)を構成的に発現するCF患者からの緑膿菌臨床分離株による感染のプロトコルについて説明します。尾びれを損傷した胚を細菌懸濁液に1.5時間浸漬し、洗浄し、細菌量を3日間監視します。細菌負荷は、溶解した感染幼虫からの蛍光コロニー形成単位(CFU)をカウントすることにより、毎日定量化され、持続的な感染が可能になりました。さらに、持続性緑膿菌は抗生物質治療に抵抗性でした。緑膿菌の持続性感染のこの新しいin vivoモデルは、慢性感染症に対する革新的な治療法の有効性を評価する機会を提供します。
概要
緑膿菌は、嚢胞性線維症(CF)および創傷1,2の患者の慢性コロニー形成に関与するグラム陰性病原性細菌です。緑膿菌は、エスカピー病原体のグループに属し、世界保健機関(WHO)によって新しい治療法の重要な優先事項として認識されています3。慢性細菌感染症は、適応性薬剤耐性が適応性を持つため、抗生物質による治療が困難ですが、これはバイオフィルム生活習慣、増殖抑制、代謝活性の低下4、細胞内ライフサイクル5など、複数の要因に関連しています。In vivoモデルは、緑膿菌の慢性感染症をよりよく理解し、治療するために不可欠です。
緑膿菌の病原性を評価するためにいくつかのin vivoモデルが使用されてきましたが、持続的なコロニー形成を模倣し、慢性感染症に対する治療の有効性をテストすることを許可されたモデルはほとんどありません6。緑膿菌の慢性病因を研究するための動物モデルは、主に寒天ビーズに埋め込ま....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
本研究で説明したすべてのゼブラフィッシュ実験は、実験動物の取り扱いに関する欧州連合のガイドラインに従った3R(Replacement, Reduction and Refinement)の原則に従ってモンペリエ大学で実施され、Direction Sanitaire et Vétérinaire de l'HéraultおよびComité d'Ethique pour l'utilisation d'animaux à des fins scientifiquesの参照CEEA-LR-B4-172-37によって承認されました。すべての感染実験は、受精後5日までの胚で行われました。 ABまたはゴールデンラインズフィッシュからの成魚ゼブラフィッシュ(Danio rerio)の繁殖は、EU動物保護指令2010/63/EUで規定された国際ガイドラインに準拠しています。モンペリエ大学のゼブラフィッシュ施設で、標準条件を12時間12分のライト:ダークサイクル、3.5Lポリカーボネートタンク(水槽あたり最大22匹)に設定したもので、塩分濃度4%/400μSの導電率と水温28°Cの再循環システムに接続されています。 魚には1日2回、魚の餌を与えました。
1. 溶液の調製
- ゼブラフィッシュの胚を成長させるために、メチレンブルーの有無にかかわらず、魚水用の1倍ワーキング溶液を調製します( ....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
ゼブラフィッシュ胚は、緑膿菌CF分離株による持続感染をモニタリングするための適切なモデルです
我々は、損傷した胚の浸漬モードを用いて、3つのCF分離株(A6520、B6513、およびC6490)9の病原性をin vivoで評価した。また、マウスの気道14,15における長期のコロニー形成で知られる、十分に特徴付けられた後期CF分離株であるRP73の挙動も評価しました。4つのCF分離株はすべて、参照株PAO1(図3Aおよび図3B)と比較すると、非常に減衰していました。
細菌の除去と持続性を区別するために、胚あたりの細菌量を3日間(最大72 hpi)にわたって定量.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
in vivoでの細菌性慢性感染のモデル化は、病因を理解し、治療効果を評価するために不可欠です。本研究では、緑膿菌に対する薬剤の試験に適したゼブラフィッシュの持続性創傷感染モデルを確立した。これは、慢性細菌感染症に対する薬物スクリーニングに適したin vivoモデルが不足しているという現在の方法論のギャップを埋めるものです。特に、このモデルは慢性化の主要な特徴、すなわち適応型抗生物質耐性を模倣しており、最適化された化合物/抗生物質の検索を可能にします。ゼブラフィッシュにおける緑膿菌の持続性感染のこのモデルは、独自の方法論に基づいています:(i)マウスに慢性肺炎を発症すると報告された分離株を含む、CF患者からの緑膿菌分離株の分析14、(ii)細菌負荷のカウントを含む感染後の長期間(3日間)にわたる分析、および(iii)感染の創傷モード。
私たちは、創傷治癒と細菌の水浸漬を通じて、ゼ.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
著者は、競合する利益を宣言しません。
謝辞
方法論の設定に大きく貢献し、関連記事13で説明されているように、図3に示す結果を生成したStéphane Pont(LPHI、モンペリエ)に感謝します。臨床株A6520、B6513、C6490を提供してくださったP. Plésiat氏(フランス国立抗菌薬耐性リファレンスセンター、ブザンソン、フランス)、およびRP73株を提供してくださったA. Bragonzi氏(イタリア、ミラノ)に感謝します。LPHIの水生モデル施設ZEFIXを提供してくれたC.ゴンザレスとV.グーリアンに感謝します。この研究は、Vaincre La Mucoviscidose(RF20200502703、RF20210502864、RF20220503060)とAssociation Gregory Lemarchalの支援を受けました。この水生施設は、欧州共同体のH2020プログラム[Marie-Curie Innovative Training Network Inflanet: Grant Agreement n° 955576]の支援を受けています。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| エチル-3-アミノ安息香酸メタンスルホン酸塩 | シグマ | E50521 | |
| ピストンペレット | エッペンドルフ、ダッチャー | 33522 | |
| 海塩 | インスタントオーシャン、アクアリウムシステム | 218035 | |
| トライトン | ユーロメデックス | 2000-B |
参考文献
- Garcia-Clemente, M., et al. Impact of Pseudomonas aeruginosa Infection on Patients with Chronic Inflammatory Airway Diseases. J Clin Med. 9 (12), 3800(2020).
- Serra, R., et al. Chronic wound infections: the r....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
訂正
Formal Correction: Erratum: Modeling Persistent Pseudomonas aeruginosa Infection in Wounded Zebrafish Larvae
Posted by JoVE Editors on 7/21/2025. Citeable Link.
This corrects the article 10.3791/68464
タグ
