負傷したゼブラフィッシュ幼生における持続性 緑膿菌 感染のモデル化

緑膿菌は、嚢胞性線維症(CF)および創傷^1,2の患者の慢性コロニー形成に関与するグラム陰性病原性細菌です。緑膿菌は、エスカピー病原体のグループに属し、世界保健機関(WHO)によって新しい治療法の重要な優先事項として認識されています³。慢性細菌感染症は、適応性薬剤耐性が適応性を持つため、抗生物質による治療が困難ですが、これはバイオフィルム生活習慣、増殖抑制、^{代謝活性の低下4}、細胞内ライフサイクル⁵など、複数の要因に関連しています。In vivoモデルは、緑膿菌の慢性感染症をよりよく理解し、治療するために不可欠です。

緑膿菌の病原性を評価するためにいくつかのin vivoモデルが使用されてきましたが、持続的なコロニー形成を模倣し、慢性感染症に対する治療の有効性をテストすることを許可されたモデルはほとんどありません⁶。緑膿菌の慢性病因を研究するための動物モデルは、主に寒天ビーズに埋め込まれた細菌の肺への投与に依存しています⁷。マウスの慢性皮膚感染モデルも開発されています⁸。ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、多くの利点(中程度の倫理問題、低コスト、高産卵)を持ち、薬物試験のための魅力的なin vivo脊椎動物モデルであり、^{胚の透明性}9により、緑膿菌と宿主細胞の高解像度のリアルタイム可視化も可能にします。

レビューで報告されているように、以前の研究では、緑膿菌の 実験室株(PAO1、PA14、およびPAK)が主にゼブラフィッシュ感染モデルで使用され、急性感染を引き起こしました⁹。私たちは最近、尾鰭切断胚を 緑膿菌 PAO1株に浸すことに基づく創傷感染プロトコルを開発しましたが、これは急性感染^{を引き起こしました10}。損傷した胚の浸漬による感染は、 緑膿菌の自然感染様式を反映しており、マイクロインジェクションよりも再現性があり、容易な感染様式です。

私たちの目標は、ゼブラフィッシュにおける緑膿菌の持続的な感染のプロトコルを確立することでした。この目的のために、私たちの戦略は、ゼブラフィッシュモデル^11,12ではほとんど考慮されていない緑膿菌の臨床株を、創傷感染経路と組み合わせて使用することでした。ここでは、P. aeruginosa CF臨床分離株による創傷感染に基づいて、ゼブラフィッシュ胚の持続的なコロニー形成をモデル化するために開発したプロトコルについて説明します。この新しいin vivoモデルは、私たちの期待に応え、ここと関連論文¹³で説明されているように、持続的なコロニー形成の文脈で治療薬の有効性を評価する新しい機会を提供します。

本研究で説明したすべてのゼブラフィッシュ実験は、実験動物の取り扱いに関する欧州連合のガイドラインに従った3R(Replacement, Reduction and Refinement)の原則に従ってモンペリエ大学で実施され、Direction Sanitaire et Vétérinaire de l'HéraultおよびComité d'Ethique pour l'utilisation d'animaux à des fins scientifiquesの参照CEEA-LR-B4-172-37によって承認されました。すべての感染実験は、受精後5日までの胚で行われました。 ABまたはゴールデンラインズフィッシュからの成魚ゼブラフィッシュ(Danio rerio)の繁殖は、EU動物保護指令2010/63/EUで規定された国際ガイドラインに準拠しています。モンペリエ大学のゼブラフィッシュ施設で、標準条件を12時間12分のライト:ダークサイクル、3.5Lポリカーボネートタンク(水槽あたり最大22匹)に設定したもので、塩分濃度4%/400μSの導電率と水温28°Cの再循環システムに接続されています。 魚には1日2回、魚の餌を与えました。

1. 溶液の調製

1. ゼブラフィッシュの胚を成長させるために、メチレンブルーの有無にかかわらず、魚水用の1倍ワーキング溶液を調製します( 表1を参照)。
2. 表1に記載されているように、20倍ストック(0.4%)と1倍ワーキングトリカイン麻酔薬溶液を調製します。ストック溶液の凍結と融解を繰り返さないように、20x Tricaineの10 mLアリコートを調製し、-20°Cで保存してください。
3. 1x リン酸緩衝生理食塩水(PBS; 表 1)。

2.GFPを構成的に発現する蛍光緑膿菌の接種物の調製  

注: 緑膿菌 のすべての作業は、バイオセーフティキャビネットでBSL-2の予防措置を受けて行われます。 緑膿菌 株は、GFPのような蛍光レポーターを構成的に発現するように遺伝子改変されるべきである(ここで使用され、¹³で述べられているように)。プラスミドコード蛍光レポーターの場合、プラスミドの損失を避けるために、染色体コード蛍光レポーターを含む株の使用を強く推奨します。

1. 感染の2日前に、-80°CからGFPを発現する遺伝子組み換え 緑膿菌 のストックをLB寒天プレート(表1)にストリークアウトし、37°Cで一晩インキュベートします。
2. 蛍光顕微鏡(倍率6倍)を用いてコロニーの蛍光を確認し、1mLのLBブロス(表1)にGFP⁺P.緑膿菌コロニーを接種し、振とう(180rpm)しながら37°Cで一晩増殖させます。
3. 感染の日に、緑 膿菌の 上記の一晩培養物を1:20で5mLの新鮮なLBブロスに希釈します。37°Cで振とう(180rpm)しながら、培養物がOD₆₀₀ = 0.8に達するまで細菌を増殖させます。これには約2〜3時間かかります。
4. 細菌培養物を室温(RT)で3584 x gで10分間遠心分離します。上清を取り除き、ペレットをメチレンブルーを含まない4mLの魚水に再懸濁します。
5. 魚水での培養量を7 x 10⁷ から1 x 10⁸ CFU / mLに適合させます。これは、約0.15のOD₆₀₀ に相当します(各ひずみに適合)。
6. 接種物を定量するには、細菌懸濁液の段階希釈を行い、LB寒天プレートで^10-4 希釈の20μLをプレート化し、37°Cで一晩インキュベートします。
7. 蛍光顕微鏡でGFP⁺ コロニーをカウントし、接種のCFUを決定します。

3. ゼブラフィッシュの胚の採取と調製

1. 細菌浸漬実験の3日前に、ゼブラフィッシュの繁殖ペアを設定します。繁殖用のオスとメスを交配水槽に入れます。
2. 翌朝、受精後の卵子を細かいメッシュのストレーナーで採取します。集めた卵をメチレンブルーの魚水が入ったシャーレに入れます。
3. 汚染を避けるために、ペトリ皿に漂白剤を1滴加えます。5分後、魚の水をメチレンブルーに変えて漂白剤を取り除きます。
4. 胚の発育に異常がある卵子(未受精卵は1細胞卵期に似ています)または死んだ卵子(白い外観)を捨てます。
5. 感染の朝(2 dpf)に、実体顕微鏡(倍率11倍)で2つの非常に薄い鉗子で胚を脱毛します。胚をつまむことなく鉗子を使用して絨毛膜を引き裂き、胚を解放します。
6. デコレーションされた胚を、メチレンブルーの魚が入ったシャーレに入れます。感染するまで28°Cでディッシュをインキュベートします。

4. 胚の損傷

1. 損傷の約5分前に、細胞培養皿(35 mm x 10 mm)で、0.02%トリカインを含むメチレンブルーを含まない魚水中でゼブラフィッシュ胚を麻酔します。胚はもはや動かず、刺激に反応しません。
2. 2本の箸の上に25Gの針を乗せると、針の取り扱いが楽になります。
3. 実体顕微鏡下で、異常な発育または死んだ胚を切除します。皿の円運動を使用して、中央にすべての胚を集めます。
4. 2本の針を垂直位置(頭を下にして尾を上にして)で胚を1つずつ分離し、左の針を尾に置いてまっすぐに保ちます。右の針で脊索の端でフィンを切ります。一度にカットします。切断と細菌溶液への浸漬の間に10分を超えないようにしてください。

5. 傷ついた胚の感染

1. 生物学的安全キャビネットタイプIIの下で、ボルテックスし、 緑膿菌溶液 を約1 x 10⁷ CFU/mLで6ウェルプレートに加えます。
2. 損傷した胚を使い捨てのパスツールガラスピペットで採取し、微生物安全ポストの下の細菌溶液に加えます。プレートを28°Cで1.5時間インキュベートします。
   注:感染した幼虫が大量に必要な場合は、約50匹の幼虫のグループを作り、傷口を作り、それらを浸し、次のグループに対して繰り返します。
3. 感染後、以下に説明するように、胚を微生物学的安全ポストの下で洗浄します。
   1. ガラスピペットで胚をメチレンブルーを含まない10mLの魚水に洗浄し、できるだけ液体を加えずに室温で30分間移します。
   2. ガラスピペットを使用して感染した胚を再度移し、メチレンブルーを含まない4mLの魚水に数分間2回目の洗浄を行います。
   3. 24個の感染した胚を、メチレンブルーを含まない1mLの魚水を入れたマルチウェルプレートに個別に移植します。
4. プレートを28°Cのインキュベーター内のプラスチックボックスに入れます。 箱を加湿します(広告でamp 例:amp ペーパータオルなど)蒸発を抑えます。

6. 感染した胚の生存

1. 胚の生存研究では、感染後18時間、24時間後、および48時間後(hpi)に実体顕微鏡で生存率を確認します。胚は、心臓と血液の循環が止まると死んだと見なされます。
2. Kaplan-Meier階段のグラフィック表現(GraphPad Prism 8.3.0)を使用して死亡率/生存率を表し、ログランクまたはその他の適切な統計テストでデータを分析します。

7. 感染した胚の細菌負荷のカウント(図1)

1. 1.5 hpi、つまり感染直後、および5つの胚/時点での24、48、および72 hpiの各洗浄後の4つの異なる時点で感染した胚からCFU測定を行います。微生物安全ポストの下ですべての手順を実行します。
2. 感染した幼虫ごとに、95 μLの1x PBSを含む1.5 mLの微量遠心チューブを準備します。幼虫の体積は約5μLです。
3. メチレンブルーを含まない4mLの魚水を入れた6ウェルプレートに幼虫を移し、洗浄を行い、浮き沈み細菌を除去します。
4. 各胚をPBSを含む微量遠心チューブに入れ、液体をできるだけ加えません。PBSの表面にある幼虫が入ったガラスピペットに触れるだけで、液体を追加せずに幼虫が微量遠心チューブに沈むことができます。
5. 微量遠心チューブの側面にある乳棒を使用して、胚を個別に粉砕します。乳棒をチューブの中に入れておきます。無傷の胚が残っていない場合の終点を決定します。
6. 乳棒を持ち上げ、100μLのPBS-Triton 2%を加えて、乳棒に付着した残留細菌を洗い流します(最終濃度は1%)。渦を巻いて10分待ちます。同時に5つ以上の胚を処理しないでください。
7. 各胚について、希釈していないライセート10 μLをLB寒天プレートに3回滴下します。マルチチャンネルピペットを使用して、^10-3 希釈に達するまで、96ウェルプレートでライセートの段階希釈を行います。LB寒天プレート上の未希釈液の隣に希釈液^10-1、^10-2、および^10-3 を3倍、10μL滴下し、プレートを37°Cで一晩インキュベートします。
8. 顕微鏡下で各希釈の蛍光コロニーをカウントし、感染した胚あたりのCFUを計算します。

図1:ゼブラフィッシュの胚における細菌の病原性と残留性を評価するための実験タイムライン。 略語:CFU =コロニー形成単位、hpi =感染後数時間。図面は BioRender.com で作成されました。^{フィギュアは13}から変更されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

8. 持続感染に対する治療の試験(図2)

1. 緑膿菌株の最小阻害濃度(MIC)の40倍の抗生物質溶液を調製します。実験の前に、選択した濃度の抗生物質が胚に対して毒性がないことを確認してください。
2. 手順 7.1 と 7.2 に従います。抗生物質を含む魚水1mLを24ウェルプレートに入れ、抗生物質なしでコントロールを行います。
3. 1回の治療ごとに5つの胚を洗浄ステップから24ウェルプレートに移し、液体をできるだけ加えません。
4. 抗生物質と室温で30分間インキュベートします。手順 7.3 に戻ります。治療後の細菌量を定量化します。

図2:感染した胚に対する抗生物質治療の有効性を評価するために使用された実験的手順。 略語:ATB 30' = 30分間の抗生物質治療、CFU = コロニー形成単位、hpi = 感染後数時間。図面は BioRender.com で作成されました。^{フィギュアは13}から変更されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ゼブラフィッシュ胚は、緑膿菌CF分離株による持続感染をモニタリングするための適切なモデルです
我々は、損傷した胚の浸漬モードを用いて、3つのCF分離株(A6520、B6513、およびC6490)9の病原性をin vivoで評価した。また、マウスの気道14,15における長期のコロニー形成で知られる、十分に特徴付けられた後期CF分離株であるRP73の挙動も評価しました。4つのCF分離株はすべて、参照株PAO1(図3Aおよび図3B)と比較すると、非常に減衰していました。

細菌の除去と持続性を区別するために、胚あたりの細菌量を3日間(最大72 hpi)にわたって定量化しました。 緑膿菌 を容易にカウントするために、染色体に統合された GFP 遺伝子を保有し、構成的発現を持つ緑色蛍光株を使用して、感染中のGFPシグナル損失のリスクを回避しました。参照PAO1株に感染した生存胚では、時間の経過とともに細菌負荷の継続的な減少が観察され、持続する細菌はほとんどありませんでした。A6520およびC6490分離株では、ほとんどの胚が3日後に細菌を排除しました(図3C)。対照的に、B6513株とRP73株では、細菌負荷は重要なままで、1.5 hpiから18 hpiの間で最初に低下した後、18 hpiから65 hpiの間で比較的一定でした(図3C)。したがって、分離株B6513およびRP73は、このモデルで持続的な感染を発症し、それにより細菌は生きている宿主で18 hpi後に生存することができる。

持続性 緑膿菌は 、抗生物質治療に対する適応耐性を示します
分離株B6513に感染した胚に対して、1.5、24、および48 hpiで30分間のトブラマイシン処理(40x MIC、40 μg/mL)を適用することにより、抗生物質の有効性を調査しました(図2)。感染開始直後にトブラマイシンを投与すると、細菌量の急激な減少が観察されました(1.5 hpi; 図 4A)。しかし、トブラマイシンは、24 hpiまたは48 hpi(図4A)で使用した場合、すなわち、胚に持続的な感染が確立された場合、有意な効果を示さなかった。

抗生物質は真核細胞に浸透する能力が異なり、その活性は培養食細胞の細胞内緑膿菌に対して異なる16。このモデルでは、細胞内ニッチが治療の失敗を引き起こす可能性があるかどうかを評価するために、トブラマイシン17とは対照的に、宿主細胞透過性であることが知られているフルオロキノロン、オフロキサシンのin vivo活性をテストしました。24 hpiおよび48 hpiの残留性細菌は、感染開始後非常に早期に処理された細菌と比較して、オフロキサシン(40x MIC、20 μg/mLで使用)に対してある程度の耐性を示しました(図4B)。ただし、トブラマイシンとは対照的に、オフロキサシンは持続期(24 hpiおよび48 hpi)で有効性を保持しました。.

図3:嚢胞性線維症(CF)分離株は、ゼブラフィッシュの胚に持続的な感染を確立することができます。 (A)および(B)示された 緑膿菌 株を7.2 x 107 から1.2 x 108 CFU/mLの範囲の細菌濃度で浸漬することにより、感染後の胚生存。生存率は感染後>40時間監視されました(n = 3、合計60匹の幼虫)。ログランク検定:* p < 0.05、** p < 0.01、**** p < 0.0001。(C)胚あたりの細菌負荷の経時的な進化(72 hpiまで)。蛍光(GFP+) 緑膿菌 分離株を浸漬して感染させた後、示された時点で胚を粉砕し、CFUカウント(n = 3、15幼虫)のためにプレーティングしました。バーは最小値と最大値を表します。GraphPad Prism 8.3.0を使用して、統計テストを実行し、グラフを作成しました。フィギュアは13から変更されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:抗生物質は、感染したゼブラフィッシュの持続性 緑膿菌 に対する有効性が低下しています。 略語:ns =重要ではない、hpi =感染後時間、ATB =抗生物質 (A)感染後時間(n = 3〜4、15〜21幼虫)に対する株B6513に対するトブラマイシンの有効性。1.5、24、または48 hpiでコロニーを形成した胚を、示された抗生物質チャレンジにさらしたか、またはコントロール条件のために水中でインキュベートした。この30分間の治療後、胚あたりの細菌量が両方のグループで測定されました。マン・ホイットニー検定: ** p < 0.01、*** p < 0.001、および **** p < 0.0001。バーは最小値と最大値を表します。(B)真核細胞に高効率で侵入することが知られている抗生物質17であるオフロキサシンのB6513株に対する有効性((A)と同じ解析)。GraphPad Prism 8.3.0を使用して、統計テストを実行し、グラフを作成しました。フィギュアは13から変更されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:溶液の調製。

著者は、競合する利益を宣言しません。