方法論記事

Ookluc: Plasmodium berghei 系統による感染阻止化合物の同定

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DOI：

10.3791/68466

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2025年7月11日

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1Department of Parasitology, Institute of Biomedical Sciences, University of São Paulo

この記事について

サマリー

マラリア原虫の性的発達は、蚊の中腸で起こります。寄生虫の性段階を標的にすることは、感染をブロックするための有望な戦略です。私たちは、受精卵形成後にナノルシフェラーゼを発現するトランスジェニックP.bergheiであるOoklucを開発し、伝達阻害化合物のハイスループットスクリーニングを可能にしました。この記事では、Ooklucを使用したスクリーニングの方法について詳しく説明します。

要約

マラリアは依然として世界の健康上の課題です。2023年には、世界中で2億6,300万人の症例と597,000人の死亡が報告されました。寄生虫のライフサイクルは複雑であり、病気を効果的に制御するには、重要な発達段階での的を絞った介入が必要です。感染阻止(TB)戦略は、ワクチンや薬を通じて蚊の媒介蚊または寄生虫の性段階を標的とすることにより、 マラリア原虫 の感染を阻止することを目的としています。結核の介入は、ヒト宿主の配偶子細胞や、配偶子、接合子、卵子、オーシストなど、蚊の中腸の他の形態に焦点を当てることができます。

新しい結核アプローチの開発は、大きな課題に直面しています。寄生虫の性病期の研究は本質的に困難であり、配偶子細胞化合物のハイスループットスクリーニング(HTS)は主に熱帯熱マラリア原虫の培養物に依存しています。しかし、その後の性期に対する介入を評価するための堅牢なin vitroツールは依然として限られています。結核化合物の発見を加速するために、私たちのグループは、マラリア原虫感染のマウスモデルであるP.bergheiを使用して、配偶子細胞の活性化と受精のための新しいHTSアッセイを開発しました。トランスジェニック寄生虫であるOoklucは、接合子形成後にのみナノルシフェラーゼを発現し、Ookinete発生中にピーク発光します。この発光ベースのアッセイは、配偶子から接合子および接合子からオオキネテへの分化を定量的に読み出し、発光の増加がオオキネテの形成と直接相関します。このビデオ記事では、Ooklucを使用してマラリア結核化合物をスクリーニングする方法を紹介しています。

概要

マラリアは、人類の歴史を深く形作ってきた古代の病気です。2023年だけでも、85の流行国で2億6,300万人の症例が報告され、597,000人が死亡しました1。この病気は、アピコンプレックス門に属するマラリア原虫属の原生動物寄生虫によって引き起こされます。ヒトに感染する5種(熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫)、熱帯熱マラリア原虫(熱帯熱マラリア原虫)のうち、熱帯熱マラリア原虫(熱帯熱マラリア原虫)が大半を占めています。熱帯熱マラリア原虫は重度のマラリアと関連しており、アフリカで優勢であるのに対し、三日熱マラリア原虫は地理的に最も広く分布しており、南アメリカとアジアでより多く見られます2。

マラリア原虫のライフサイクルは複雑で、2つの宿主にまたがる複数の発生段階が関与しているため、固有地域での伝播と持続が促進されます3。このサイクルの重要なステップは、人間から蚊媒介蚊への移行であり、蚊を介入の重要なターゲットにしています。感染はヒト宿主内で始まり、メロゾイトが男性と女性の配偶子に分化するにつれて、マラリア原虫の性的段階が発達します。蚊が摂取すると、環境の合図が配偶子の活性化と配偶子の形成を引き起こし、中腸内腔での受精につながります。得られた接合子は運動性オオキネテに分化し、中腸上皮に積極的に侵入し、基底椎弓板内のオーシストに発達します。オーシストの内部では、何千ものスポロゾイトが生成され、その後血リンパ液に放出され、唾液腺に移動することができます。そこでは、スポロゾイトが腺房細胞に侵入して腺内腔に移動し、蚊が次の血液の食事をとるまでそこに留まり、寄生虫を人間の皮膚に感染させます4。

利用可能な薬剤の限界と抗マラリア薬に対する耐性の増加を考えると、新しい感染阻止(TB)戦略の探索は非常に重要です5。蚊の感染、手動の顕微鏡分析、放射性ヒポキサンチンの取り込みなどの従来のスクリーニング方法は、労働集約的で標準化が難しく、ハイスループットアプリケーションには適していません6,7。蛍光ベースの検出(DNA染色やGFPレポーターなど)を使用した最近のアプローチでは、効率が向上していますが、寄生虫の性段階を標的とする化合物の評価には大きな課題が残っています6,7,8。

これらの課題に対処するために、ナノルシフェラーゼ(nLuc)を発現するトランスジェニック P.berghei 系統、 Ooklucと呼ばれる8が開発されました。このシステムでは、 nLuc 遺伝子は、接合子で活性化されるookinete特異的 P.berghei Circumsporozoite-and TRAP-related protein(CTRP) プロモーターの制御下に置かれ、配偶子の活性化から約6時間後にnLucの産生が始まり、変換アッセイ8の24時間後にピークに達します。この設計により、受精直後の寄生虫の生存率の発光ベースの自動定量が可能になり、直接的なベクター操作が不要になり、数千の化合物のハイスループットスクリーニングが容易になります8。

nLucの発現はオオキネテの生存率に関係なく起こるため、オオキネテの形態形成など、後期に特異的に影響を与える化合物の検出は限られていますが、オオクックは、活性酸素種の産生を誘導する薬剤など、蚊の配偶子形成、性組換え、または寄生虫の生存を標的とする結核化合物の同定に非常に効果的です。以前の研究では、マラリア原虫の性期9、10、11、12、13、14、15を阻害することが知られている化合物を成功裏に特定することにより、このシステムを検証しています。したがって、Ooklucは、マラリア原虫の性病期のハイスループットスクリーニングのための堅牢で革新的なプラットフォームであり、新規結核化合物の発見を促進し、今後数年間のマラリア撲滅に向けた取り組みを進めます8。このプロトコルでは、薬物スクリーニングと阻害濃度50%(IC50)測定のためのOoklucシステムの適用について概説しています。

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プロトコル

すべての動物実験は、倫理ガイドラインに厳密に従って実施され、サンパウロ大学生物医科学研究所の動物使用に関する倫理委員会(CEUA-ICB/USP)によって承認されました。動物は、この委員会によって確立された基準に従って収容され、維持されました。遺伝子組み換え マラリア原虫 の実験、および-80°Cでの凍結保存は、サンパウロ大学生物医科学研究所の施設バイオセーフティ委員会(CIBio-ICB/USP)が定めた規制に準拠して実施されました。この研究では、3〜5週齢の合計3匹の雌BALB/cマウス(2匹が感染し、1匹が非感染)が使用されました。

1. 材料・試薬

  1. RPMI 1640に0.025 M HEPES、ペニシリン-ストレプトマイシン-ネオマイシン(PSN)、50 mg/Lヒポキサンチン、および100 μMキサンツレン酸を添加して、オオキネテ培地を調製します。pHを8.3 8,16に調整します。
  2. ルシフェラーゼアッセイシステム内に用意されている50容量の溶解バッファーと1容量の基質を混合することにより、発光アッセイ用の作業溶液を調製します。
  3. インキュベーターを21°Cに設定します。

2.感染と寄生血液の収集

  1. 2 匹の雌 BALB/c マウス (4-6 週齢) に、腹腔内 (IP) 注射により 150 μL の凍結保存された Ookluc 株を感染させます (0 日目)。
    注:このプロトコルでは、BALB/cマウスがすぐに入手可能で、動物施設で広く使用されているため、BALB/cマウスの使用をお勧めします。ただし、 P. berghei 感染に感受性があり、配偶子細胞形成をサポートする野生型マウス系統は、使用に適しているはずです。
  2. 3日目から、ギエムサ染色された血液塗抹標本の顕微鏡検査により、寄生虫血症と配偶子細胞症を評価します。
  3. 寄生虫症と配偶子細胞症がそれぞれ約5%と0.5%に達したら(通常は4日目)、ヘパリン注射器を使用して心臓穿刺で血液を採取し、感染した両方のマウスから血液をプールします。.
    注:これは P. berghei のトランスジェニック系統ですが、その成長と配偶子細胞のプロファイルは、ANKA株で観察されたものと似ています。この文脈では、総寄生虫症に対する配子細胞の割合は約10倍低くなります。
    注:理想的には、寄生血液の収集前に化合物プレート(下記参照)を調製するため、血液は収集後すぐにプレートにピペットで移動します。マウスの血液を別の部屋で採取しなければならない場合、または他の理由ですぐにコンパウンドプレートにピペットで移動できない場合は、採取した血液を37°Cで30分以内に保たなければなりません。

3. コンバージョンアッセイ - 96ウェルプレートでのスクリーニング

注:一貫した結果を得るためには、実験全体を異なる日に3回繰り返して、結果を確認する必要があります。

  1. ookinete培地を希釈剤として使用して化合物サンプルを調製します(最終濃度10μM)。コンパウンドストックを1 mMに希釈し、1 mMストックをOokinete Mediumで1:100 v:v:vに希釈して作業サンプルを調製します。1つのアッセイを重複して調製するには、最終容量の200 μLの作業サンプルを調製します。
  2. 化合物を水以外の溶媒で希釈する場合は、試験サンプルと同じ割合でオオキネテ培地で希釈した溶媒を含む対照サンプルを含めて、観察された阻害が溶媒ではなく化合物に起因することを確認します。
    注:例として、90種類の化合物をスクリーニングします。
  3. 2つの96ウェルプレートを使用して、図 1に示すように、各ウェルに80μLのサンプルを二重(2つのプレート)で配置します: ポジティブコントロール:80μLのオオキネテ培地; ネガティブコントロール:80μLのオオキネテ培地; 溶媒制御:80 μLのookinete培地と1% DMSOを添加。 サンプル:各化合物10μMを80μL、オオキネテ培地に溶かします。

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図1:コンパウンドスクリーニング用に設計された96ウェルプレートレイアウトの概略図。 プレートレイアウトには、ポジティブコントロール(C+)、ネガティブコントロール(C-)、コントロールプラス希釈溶媒(C+S)、および90種類の試験化合物(S1-S90)が含まれます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

  1. 96ウェルプレートの各ウェルに寄生したマウス血液4 μLを、ネガティブコントロール(C-)を除き、1:20の比率v:vで加えます。ピペッティングにより穏やかに均質化します。
    注:損失を考慮して、各プレートに寄生血液を~400μL必要と計算します。
  2. ネガティブコントロールの場合、非感染マウスの血液を1:20の比率(v:v、血液:サンプル)で追加します。穏やかに均質化します。
  3. 21°Cで6時間または24時間インキュベートします。
    注:nLuc活性は、6時間のインキュベーションで検出可能であり、アッセイ8の24時間でピークに達する。このアッセイでは、形成された接合子は形態形成の完了に関係なくnLucを蓄積するため、オオキネテの形態形成を阻害する化合物のように、接合子形成後に活性を持つ化合物を同定することはできません。したがって、配偶子形成、性組換えを阻害することによりnLuc活性を阻害する、または早期の細胞毒性を持つすべての化合物を検出するには、6時間のインキュベーションで十分です。しかし、通常は24時間のインキュベーションを好んで行い、シグナルとノイズ比が強くなります。

4. 発光アッセイ

  1. インキュベーション期間後、ピペッティングで上下させてサンプルを均質化し、血液と培地の混合を徹底します。
  2. 使用直前に溶解バッファー/ルシフェラーゼ基質混合物を1:50の比率(v:v、基質:溶解バッファー)で調製します。
  3. 基質混合物をサンプルと1:1(v:v)の比率で混合し、気泡を避けるために穏やかに混合します。37°Cで3〜5分間インキュベートします。
    注:この例では、各ウェルに84 μLの基質:溶解バッファーを添加しました。
  4. サンプルを96ウェルの白い平底プレートに移します。プレートリーダーを使用して発光を測定します。次のパラメータ設定を使用します: 発光フィルター:レンズ、測定間隔時間:ウェルあたり1秒。

5. データ解析 - スクリーニング

  1. 発光アッセイ後、表示された生データをメモします(図2)。
    注意: 得られる相対光単位(RLU)は、使用する照度計によって異なります。私たちの場合、ポジティブコントロールのRLU値は、24時間インキュベーションアッセイで10,000〜500,000の範囲でした。インキュベーション時間が短い(6時間)と、RLU値は低くなります。

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図2:化合物スクリーニングのためのコンバージョンアッセイのシミュレーション読み取りから得られた結果。 この画像は、90種類の化合物のパネルの存在下でオオキネテスの変換後に実施されたアッセイからのシミュレートされた発光測定値を示しています。Relative Light Unit の値が小さいほど、オオキネテの形成が減少していることを示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

  1. スプレッドシートを使用して、以下の式を使用して各測定値の平均を計算します。 XX は 1 番目の測定セルのアドレスに、 YY は 2 番目の測定セルのアドレスに置き換えます。すべてのサンプルに対して式を繰り返します。
    =(平均(XX:YY)
  2. データを % 阻害に変換して、結果をより適切に分析します。スプレッドシートでは、次の式を使用します。 A をサンプル RLU 値に、 B を制御 RLU 値に置き換えます。試験したすべての化合物について、この式を繰り返します。
    = 1 - (A/B) x 100
    メモ: データは図 3 のように表示されます。

figure-protocol-3
図3:化合物スクリーニング用のコンバージョンアッセイの模擬読み取りから得られた結果は、各化合物の阻害率として表されます。 上記のように計算された、試験された各化合物の変換の阻害率。強調表示された四角形は、変換の阻害を95%以上促進する化合物を示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

  1. 95%以上の阻害を示す化合物を特定します。
    注:これらの化合物は、10μM濃度で性期に対して高い活性を示します。この例では、性期に対して高い活性を持つ5つの化合物を見つけました。
  2. 同定された化合物について、以下に説明するようにIC50 測定を行う。

6. コンバージョンアッセイ - IC 50の決定

  1. マウスに Ookluc を感染させ、セクション2で説明されているように寄生血液を採取します。
  2. ookinete培地を希釈液として使用してサンプルを調製します。化合物による変換の100%阻害が観察される初期濃度を使用してください。
    注:活性化合物は10μMの濃度のスクリーニングで同定されたため、最初の用量反応曲線の初期濃度として20μMを使用します。正確な用量反応曲線を得るには、アッセイに、変換が100%阻害される初期濃度と、阻害が0%になる最終濃度が含まれることが重要です。このアプローチにより、正確なIC50 計算が保証されます。最初の用量反応曲線は、~100% の阻害で化合物の最低濃度を通知します。このプロトコルでは、 例としてOokluc13を使用して最近特定されたPyAz90を使用します。
  3. 96ウェルプレートに、トリプリケートを追加します( 図4を参照):ポジティブコントロール(C +):80μLのオオキネテ培地;ネガティブコントロール(C-):80μLのオオキネテ培地。サンプル初回希釈 (Cpd D1): 160 μL の化合物を初期濃度のオオキネテ培地で 100% 阻害します。D2 から D12 ウェル: 80 μL のオオキネテ培地。
  4. 80 μL のウェル D1 を D2 にピペットで移し、ウェル D2 を 80 μL のウェル D2 に均質化して D3 にピペットで移入し、2 倍段階希釈を行います。すべてのウェルの総容量が80 μLであることを確認し、ウェルD12から取り出した最後の80 μLを廃棄します。
    注: 図4に示すように、すべてのサンプルに対して少なくとも3回の反復で実験を実行します。結果の信頼性と再現性を確保するために、新たに感染した動物を使用して、毎回3日間にわたって実験全体を繰り返す必要があります。
    注:最初の画面で、結果が変換における溶媒の影響を示さない場合は、これらのコントロールを段階希釈に含める必要はありません。それ以外の場合は、溶媒の段階希釈も含める必要があります。

figure-protocol-4
図4:化合物IC50の測定用に設計された96ウェルプレートレイアウト。 プレートレイアウトには、ポジティブコントロール(C+)、ネガティブコントロール(C-)、および化合物(Cpd)希釈(D1〜D12)が含まれます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

  1. 寄生したマウスの血液を96ウェルプレートに1:20 v:vで加えます。ピペッティングにより穏やかに均質化します。
    注:ネガティブコントロール(C-)を除き、合計4μLの寄生血液が各ウェルに追加されます。損失を考慮して、試験する化合物ごとに~200 μLの寄生血液が必要であると計算します。
  2. ネガティブコントロールウェルでは、非感染マウスの血液を1:20の比率(v:v、血液:サンプル)で添加します。穏やかに均質化します。
  3. 21°Cで6時間または24時間インキュベートします。
  4. セクション4で説明されているように、発光アッセイを実行します。

7. データ分析 - IC 50 の決定

注:IC50 は、生物学的活性/阻害の50%を阻害するために必要な化合物の濃度として定義されます。このアッセイでは、阻害とは、オオキネテ変換の減少を指します。データはシグモイド用量反応曲線として表され、X軸は化合物濃度(対数変換)を表し、Y軸は阻害率を表します。

  1. セクション5のステップ5.3で説明されているように、阻害率を計算します。
  2. ソフトウェアを開き、XYテーブルを作成します。
  3. [Y 軸オプション] を [並べて並べたサブ列に 3 つのレプリケート値を入力する] に設定します。
  4. Xが化合物濃度、Yが阻害率を表すデータを貼り付けます(図5A)。
  5. メニュー・バーで 「分析 」をクリックし、「 非線形回帰(カーブ・フィット)」 を選択し、「 用量反応曲線 - 阻害 」および 「[阻害剤]対正規化反応 -- 変数傾き 」を選択し、「 OK」をクリックします。
  6. 左側のパネルで、データの線量反応曲線を観察します。色の変更やポイント形式など、目的のパーソナライゼーションを適用します。
  7. Nonlinフィット表を見つけて、計算されたIC50および95%信頼区間(95%信頼区間)を見つけます(図5B)。

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図5:PyAz90の線量反応曲線。 阻害率は、対数スケールのPyAz90濃度(μM)の関数として測定されました。シグモイド曲線は、IC50 の決定に使用された近似データを表し、0.013 μM (95% 信頼区間: 0.012-0.014 μM) でした。データ点は、実験反復からの平均の平均±標準誤差を表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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結果

Ookluc寄生虫の作製により、既存のアッセイでは得られない視点から、特に配偶子の活性化、受精、および接合子形成に対する化合物の影響を評価する際に、新しい結核治療薬候補の評価が可能になります8。図 2 および図 3 は、寄生虫の性段階に対して化合物のパネルをハイスループットでスクリーニングするこの分析法の能力を示しており、1 つのアッセイで最も有望な候補の同定を容易にします(図 1)。結果をパーセンテージで表すことで、データの可視化が強化され、どの化合物が次のステージに進むべきかの意思決定をサポートします。Ooklucシステムを使用して、>95%の阻害を示す5つの化合物が同定されました(図3

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ディスカッション

新しい結核化合物の開発に使用されるほとんどのHTS法は、配偶子細胞形成阻害または配偶子殺胞活性に焦点を当てています。現在までに、配偶子細胞の機能、配偶子形成、接合子形成、およびオオキネテ形態形成の評価を可能にするP.bergheiモデルは2つだけ開発されています5。

これらのモデルの1つは、ctrpプロモーター17にリンクされた蛍光レポーターを利用するため、Ooklucと類似している。しかし、Ooklucは、より感度の高いレポーターであるnLucの使用や、レポーター挿入後の最初のモデルで寄生虫ゲノムに残る統合された薬剤耐性マーカーの欠如など、重要な改善点を導入しています。この機能により、Ookluc寄生虫は、新しい結核標的を特定するための逆遺伝学アプローチを含む、追加の遺伝子改変に使用できます。

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開示事項

著者には、開示すべき利益相反はありません。

謝辞

このプロジェクトは、サンパウロ財団(Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo)(FAPESP 2021/06769-0)およびセラピリェイラ研究所(Instituto Serrapilheira)(助成金G-1709-16618)からの助成金によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ジメチルスルホキシド(DMSO)シグマ・アルドリッチD8418
Windows用のGraphPad Prismバージョン10.0.0GraphPad Software、米国マサチューセッツ州ボストン
ブタ腸粘膜からのヘパリンナトリウム塩シグマ・アルドリッチH3393
ヘペス (1 M)サーモサイエンティフィック15630106
ヒポキサンチンシグマ・アルドリッチH9636
マウス------3〜5週齢の雌BALB/cマウス
Nano-GloルシフェラーゼアッセイシステムプロメガN1110
ペニシリン&マイナス;ストレプトマイシン&-マイナス;ネオマイシン溶液安定化シグマ・アルドリッチP4083
POLARStar Omega マイクロプレートリーダー BMGラボテック----
RPMI 1640 ミディアム、グルタマックスサプリメントサーモサイエンティフィック61870036
キサンツレン酸シグマ・アルドリッチD120804

参考文献

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