単核懸濁液のためのマウス嗅覚上皮の迅速な解剖と解離

サマリー

この記事では、単核RNAシーケンシングを目的としたマウス嗅覚上皮の解剖と解離のための合理化されたプロトコルを提供します。

要約

マウスの嗅上皮は嗅覚系の最初の入り口であり、嗅覚ニューロン、その再生前駆細胞、支持細胞など、さまざまな種類の細胞を収容しています。嗅覚ニューロンは化学臭気物質を神経信号に伝達しますが、これらの細胞がどのように発達して代謝回転し、嗅球とシナプスを作り、匂い受容体を調節するかの根底にあるメカニズムは、依然として集中的に研究されている分野です。鼻腔の背側に位置する嗅覚上皮は、鼻甲介として知られる複雑な骨構造に付着しています。この解剖学的構造は、特に生存可能な単一細胞懸濁液の調製という文脈において、その抽出と解離に特有の課題をもたらします。単一細胞懸濁プロトコルには、細胞生存率にストレスを与えたり、ライブラリー調製を遅らせたりする可能性のある準備ステップ(パパイン解離、FACSなど)が含まれることが多いため、組織抽出時間を最小限に抑えることが重要です。この記事では、嗅覚上皮を迅速に解剖するための合理化された方法と、高品質の単核懸濁液を生成するためのプロトコルを紹介します。

概要

マウスの嗅上皮 (OE) は嗅覚系の重要な構成要素であり、匂い信号を検出して中枢神経系に伝達する役割を果たします。その最も表層には、嗅覚感覚ニューロンの匂いを検出する繊毛が含まれており、これらは粘液の層で覆われ、支持する^{支柱細胞と}ミクロビラー細胞に囲まれています^1,2。OSNは双極性であり、繊毛を頂端に伸ばして粘液層内に格子を形成し、軸索を骨の篩状板を基底に通って嗅球内の糸球体に合体します。これらの糸球体は、OSNと下流ニューロンの間のシナプスの部位です。根底にあるOSNである球形基底細胞と呼ばれるニューロンの前駆細胞は、空気中の毒素、病原体、身体的外傷などの環境的侮辱に直接さらされた後、^OSNが死ぬにつれて常にOSNを補充します3。球形基底細胞は、鼻甲介と呼ばれる骨突起の基底層に最も基底に位置し、付着する多能性水平基底細胞^4,5の予備プールに由来します。鼻甲介は曲がりくねっているため、OEを分離して均質化することが困難になります。さらに、OE は頭蓋骨の骨に囲まれているため、その領域へのアクセスが困難であり、従来は時間のかかる処置が必要でした。

以前の研究では、骨^6,7,8,9,10から嗅覚上皮を放出するために、拡張されたパパインインキュベーションに依存しており、これにより単一細胞懸濁液の下流処理がさらに遅れる可能性があります。OSN軸索のせん断はアポトーシス¹¹を引き起こすため、組織抽出からcDNAライブラリー調製までの時間を最小限に抑えることが不可欠です。さらに、OEの構造と嗅球へのその投影は、単一細胞RNAシーケンシングを成功させるための無傷の細胞の抽出を複雑にします。幸いなことに、単核RNAシーケンシング(snRNA-seq)は、特に単一細胞解離が困難または実用的でない組織において、細胞型分布を維持しながら細胞をプロファイリングするための強力なツールとして浮上しています^12,13。

多くの^{研究6、7、8、10、14、15}がマウスOEの単一細胞配列決定を実施していますが、OEの脆弱性と頭蓋骨のさまざまな骨による包み込みを考慮すると、一貫性のある便利な組織収集に最適化された詳細な解剖手順を提供するものはありません。さらに、既存の解剖ガイド¹⁶は、速度ではなく解剖学的構造の保存に焦点を当てており、解剖時間が長くなる可能性がある。RNA分解を最小限に抑え、調製された核の品質を最大化するには、適切な組織調製が不可欠であるため^17,18、^{さまざまな}下流アプリケーションで使用するために、マウスOEの迅速な解剖および単核懸濁液への均質化のための最適化されたプロトコルが保証されます。

このプロトコル(図1)は、これらの課題を克服するために設計された合理化された方法を提示し、マウスOEの迅速な解剖と核を単離する目的での組織の効率的な解離を可能にします。このアプローチは、高品質の単核シーケンシング¹⁹を促進し、嗅覚生物学の分子基盤を調査するための信頼性の高い技術を提供します。

図1:C57BL / 6マウス頭蓋骨の関連する縫合糸と骨の解剖学的構造、および嗅覚上皮の代表的な断面。 (A)頭蓋骨の縫合糸は色分けされています。縫合糸は頭蓋骨の片側に色分けされていますが、もう片側は参照用にマークされていないままです(左)。それに応じて色分けされた縫合糸の名前(右)。(B)頭蓋骨の骨は色分けされています。骨は頭蓋骨の片側に色分けされていますが、もう片側は参照用にマークされていません(左)。それに応じて色分けされたボーンの名前(右)。(C)OEの中央部分の断面(この記事で説明する方法を使用して解剖)で、鼻甲介は片側に色分けされ、参照用にマークされていない左側(左)。視覚化された鼻甲介の名前(右)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

プロトコル

この研究のすべての動物実験は、ベイラー医科大学 IACUC によって承認され、それに従って実施されました。雌のC57BL/6J(JAX:000664)マウスを使用した。試薬と機器の詳細は 、材料表に記載されています。

1.嗅覚上皮剥離

1. まず、任意の好ましい方法を使用してマウスを深く麻酔します(施設で承認されたプロトコルに従ってください)。つま先をしっかりとつまんで麻酔の手術面を確認し、少なくとも 10 mL の氷冷 1x PBS の経心臓灌流を進めます。皮膚を取り除いて頭蓋骨を露出させます(図2A)。
   注:本体からのヘッドの取り外しはオプションです。頭を切除する場合は、首を切る前に頭蓋骨の周りの皮膚やその他の軟部組織を切除することをお勧めします。
2. 先端が鋭い細いハサミを使用して、1つのハサミの先端を後眼窩に、もう1つの外耳道に隣接して、扁平上皮骨から頬骨弓を両側に切断するために2つの切開を行います( 図2Bの緑色の線)。
3. 前頭骨の最前方に沿って眼窩から眼窩へと浅い切開を行います。前頭骨の背側表面(~1〜2 mmの深さ)のみを切開し、眼窩を構成する下にある構造や骨を切断しないように注意します( 図2Bの青い線)。
   注:眼窩間の浅い切開を実現するには、はさみを頭蓋骨に対して垂直に持ち、鋭い先端のみを使用して切断します。
4. ステップ1.3で前頭骨に行われた眼窩間切開に達するまで、大孔から矢状縫合糸と前頭間縫合糸を通って頭蓋骨の正中線に沿って切断します( 図2Bの赤い線)。
5. 頭蓋骨の正中線に沿って行われた切開部に鉗子を挿入し、頭蓋骨の半球の一方の半球を横方向にしっかりと引っ張ります。この動作により、眼窩の骨(前頭、上顎、涙)も除去され、嗅鼻甲介の外側が露出します(図2D)。
   メモ: この時点から、OE を誤って損傷しないように注意してください。
6. 鼻骨と切歯を持ち、鉗子を使用して反対側の頭蓋骨蓋を外します。脳(嗅球を含む)を引き裂くときに、骨の半球で脳を取り除きます(図1E)。このステップの後に残る唯一の目に見える骨構造は、頭蓋骨の基部とOEを取り巻く骨です(図2F)。
7. 一対の骨ニッパーまたはロンジャーを使用して、切歯の付け根まで残っている前頭骨と前上顎(切歯)骨を取り除きます(図2G)。
8. 骨ニッパーを使用して前頭鼻縫合糸に沿って切断し、篩状板から鼻骨を解放し、下にある露出したOEを損傷したり、篩状板を骨折させたりしないように細心の注意を払います。
9. 鉗子を使用して鼻骨を篩状プレートから持ち上げ、OEを露出させます(図2H)。残存する前上顎骨が背側OEを覆い隠している場合は、続行する前にそれを除去します( 図1Iの黒い円)。
10. 先端の細い鉗子を使用して、鼻中隔の背側を篩状プレートとの接合部でそっと固定し、後方に引っ張ります(図2J、K)。最小限の抵抗で、主要な嗅覚上皮は完全に無傷の構造として解放されます(図2L)。
11. OE解離を直ちに進めるか、後で処理するために組織をスナップフリーズします。

図2:嗅覚上皮の迅速な解剖のための技術。 (A)周囲の軟部組織の除去に続くマウスヘッド。(B)頭蓋円蓋切開用の色分けされたガイド。(C)頭蓋円蓋切開後の外観。(D)嗅上皮に隣接する眼窩の部分とともに、頭蓋円蓋の第1半球の除去。(E)脳とともに頭蓋円蓋の反対側部分の除去。(F)脳と頭蓋骨の除去後の頭。(G) 前頭上顎縫合糸での切開後の、最前方の前頭骨および後部前上顎骨の除去。(H)鼻骨の除去。(I)黒い円は、オプションで除去できる残存前上顎骨の領域を強調表示します。(J)無傷の嗅上皮を除去するための鉗子の配置。(K)後方に引っ張って嗅覚上皮を解放します。(L)嗅覚上皮の全放出。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

2. 嗅覚上皮解離と単核単離

1. サンプルごとに 1 本の C チューブと 2 本の 15 mL コニカルチューブを氷上に置きます。
2. 既製の核抽出バッファーにRNAse阻害剤(最終濃度0.2 U/μLまで)を添加して、溶解バッファーを調製します。
3. 各15 mLのコニカルチューブに4 mLの1%BSAを加え、短時間ボルテックスし、余分なものを廃棄します。これにより、15 mLのコニカルチューブのそれぞれがBSAでコーティングされ、チューブへの核の接着が最小限に抑えられます。
4. 1つのOE全体に対して、2 mLの氷冷溶解バッファーを各Cチューブに加えます。
5. OEサンプルをCチューブに追加します。#2鉗子を使用して、各サンプルをそれぞれのCチューブにかざし、先端の細いハサミを使用して細かく切ります。
6. 各サンプルを含むCチューブを逆さまにして、自動組織解離器ブロックに置きます。解離器画面では、各ブロックに対応する四角形が 「自由」 から 「選択」に変わります。
7. フォルダアイコンを押して、 Miltenyi フォルダに切り替わります。矢印を使用して、 4C_nuclei_1 プログラム(解離器内にプリロードされたプログラム)までスクロールします。[ OK ] を押してプログラムを各ブロックに適用し、[開始] を押してサイクルを開始します。サイクル完了後 すぐに 解離器からCチューブを取り外します。
   注:可能であれば、解離サイクルの間、Cチューブを氷のように冷たく保ちます。サイクル完了直後に解離剤からサンプルを取り出し、核の過剰溶解を避けるためにプロトコルの次のステップに進むことが重要です。
8. ピペットを使用して、Cチューブから均質化された懸濁液を吸引し、70 μmのストレーナーを通して最初のBSAコーティングされたコニカルチューブにろ過します。Cチューブの底に蓄積した骨片を吸引しないでください。
9. ストレーナーを1 mLの氷冷1x PBSですすぎ、完全にろ過します。
10. ろ過した懸濁液を500 × g でスイングバケット遠心分離機で4°Cで5分間遠心分離します。
11. ペレットを乱さないように注意しながら、上清を穏やかに吸引して廃棄します。穏やかなピペッティングにより、核ペレットを1 mLの氷冷1x PBSに完全に再懸濁します。
12. 再懸濁した核を30μmのストレーナーに通し、2番目のBSAコーティングされた円錐形チューブに通します。核の濃度は、血球計算盤または自動セルカウンターを使用して定量できます。
13. 選択したダウンストリームプロトコル(FACSの有無にかかわらず)を直ちに実行して、サンプルの完全性を維持し、劣化を防ぎます(図3)。
    注: シームレスかつタイムリーに完了するために、ユーザーはこのプロトコル全体の練習実行を実行することを強くお勧めします。

図3:嗅覚上皮解離と単核単離ワークフロー。 解剖後、嗅覚上皮は機械的および化学的に解離されます。次に、ライセートを70μmのストレーナーでろ過し、1x PBSですすぎ、500 × g で5分間遠心分離します。ペレットは、30 μmのストレーナーでろ過される前に、1x PBSに再懸濁されます。得られた核懸濁液は、さまざまな下流のシーケンシングアプリケーションに利用できます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

結果

解剖と分析のための解剖学的背景を提供するために、C57BL/6マウス頭蓋骨の縫合糸と骨、ならびに嗅覚上皮(OE)の中央部分を視覚化し、色分けしました(図1)。各画像の片面には、関連する縫合糸、骨、鼻甲介を強調するために注釈が付けられ、もう片面は参照用にマークが付けられていませんでした。OE断面は確立されたプロトコル²⁰に従って調製され、鼻甲介の同定は以前の解剖学的特徴付け²¹に基づいていた。

フローサイトメトリーは核単離後に必須ではありませんが、この原稿に記載されている方法で生成された核の品質を示すために、イメージングフローサイトメトリーからの代表的なデータが生成されました。単一原子核を識別するためのゲート(図4A)と高品質の原子核の量(低偏心、高真円度)(図4B)を示しています。単一事象の大部分は核(53.6...

ディスカッション

ここで説明する手順により、心臓内 1x PBS 灌流後の無傷の OE を一貫して除去できます。これは、以前の方法¹⁶ と比較して速度の顕著な改善を表しており、脳の除去中に発生する軸索切開²後にOSNが変性し始めることを考えると特に重要です。

前頭骨、前上顎骨、鼻骨を慎重に除去することは、無傷の OE を一貫して抽出するために非常に重要です。さらに、鉗子で OE を除去する最終ステップでは、鼻中隔の一部が付着したままになることがあります。鼻中隔にはかなりの数の呼吸器上皮細胞²²が含まれていることを考えると、その後の分析における非嗅覚細胞型の包含を最小限に抑えるために、OEからの鼻中隔の分離が推奨される。さらに、この手順は均質化プロトコルと並行して提示されますが、最初の1x PBS灌流後に1x PBS中に10 mLの4%PFAを使用した追加の経心臓灌流によって、さまざまな免疫組...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
15 mL遠心分離管	セルトリート	229411
ボーンニッパー	ファインサイエンスツール	16102-11
ボンミニチュアアイリスはさみ	ミルテックス	18-1392
ウシ血清アルブミン溶液	シグマ・アルドリッチ	A1595
デュモン #3 鉗子	ファインサイエンスツール	11231-30
メスC57BL/6Jマウス	ジャクソン研究所	JAX:000664
gentleMACS Cチューブ	ミルテニー・バイオテック	130-093-237
gentleMACS オクト解離器	ミルテニー・バイオテック	130-096-427
MACS スマートストレーナー 30 um	ミルテニー・バイオテック	130-098-458
MACS スマートストレーナー 70 um	ミルテニー・バイオテック	130-098-462
マイクロフリードマン・ピアソン・ロンジャーズ	ファインサイエンスツール	16220-14
核抽出バッファー	ミルテニー・バイオテック	130-128-024
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、カルシウムおよびマグネシウムを含まない 1x、PH 7.4 ±0.1	コーニング	21-040-CV
プロテクターRNAse阻害剤	ミリポアシグマ	3335402001
Sorvall Legend XTR冷凍遠心分離機	サーモサイエンティフィック	50119927-5