方法論記事

磁性粒子イメージングを用いた肺線維症のための移植された遠位肺上皮前駆細胞の画像誘導 In vivo 追跡

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DOI：

10.3791/68477

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2025年6月27日

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1Precision Health Program, Michigan State University, 2Department of Radiology, College of Human Medicine, Michigan State University, 3Department of Pediatrics and Human Development, Michigan State University, 4Lyman Briggs College, Michigan State University, 5College of Social Science, Michigan State University, 6Department of Chemistry, Hunter College, 7Corewell Health Medical Group, 8Institute for Quantitative Health Science and Engineering (IQ), Michigan State University, 9Department of Biomedical Engineering, College of Engineering, Michigan State University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

細胞療法は、前駆細胞を使用して損傷した組織を修復し、肺機能を改善することにより、肺線維症に対する有望な介入を提供します。イメージングは細胞統合の追跡において極めて重要な役割を果たすため、ここでは、マウスモデルにおける肺線維症の細胞療法の磁性粒子イメージングガイド下 in vivo 追跡について説明します。

要約

肺線維症(PF)は、肺胞上皮の損傷を繰り返すことを特徴とする進行性の慢性肺疾患で、細胞外マトリックスの過剰な沈着を引き起こし、組織の肥厚、瘢痕化、ガス交換の障害を引き起こし、呼吸機能障害を引き起こします。米国では、年間約50,000人の新規症例が報告されており、患者は気胸、肺高血圧症、呼吸不全、肺がんのリスク増加などの重篤な合併症に直面しています。現在の治療選択肢は有効性が限られており、主に疾患の進行を遅らせることを目的としています。細胞療法は有望な介入として浮上しており、損傷した肺組織を再生し、炎症を調節し、肺機能を改善する可能性を提供しています。しかし、これらの治療法の有効性は、宿主肺内の移植細胞の分布、生存、および統合を監視する能力に大きく依存します。

磁性粒子イメージング(MPI)は、超常磁性酸化鉄ナノ粒子(SPION)をトレーサーとして利用する、新しい非侵襲的な前臨床イメージングモダリティです。MPIは、高感度、特異性、バックグラウンドシグナルがないため、 in vivoで標識細胞をリアルタイムかつ定量的に追跡できます。本研究では、免疫不全マウスの肺に移植したヒト遠位肺上皮前駆細胞のモニタリングにMPIを用いる方法を検討しました。細胞をさまざまなSPION濃度で標識してシグナルを最適化し、免疫染色と鉄定量によって確認しました。気管内注入後、移植された細胞の空間分布を追跡するために、2D MPIスキャンが取得されました。2週間にわたる縦断的イメージングにより、肺組織内の細胞の統合と保持を視覚化することができました。点眼が成功すると、左右の肺の両方にMPI信号が見られ、時間の経過とともに減少しました(~65%)。その後、組織学的検証のためにマウスを犠牲にしました。この研究は、肺線維症における細胞治療の非侵襲的、縦断的追跡のためのMPIの有用性を実証し、手順中に利用される複雑な技術を中心にしています。

概要

細胞療法1,2は、再生の可能性を提供し、組織修復を促進し、炎症を軽減し、白血病やリンパ腫などの慢性疾患の転帰を改善します3,4(造血幹細胞)、変形性関節症5,6(間葉系幹細胞)、1型糖尿病7(膵島細胞移植)、脊髄損傷8,9、神経変性疾患10、11,12(神経幹細胞)、および肺線維症13,14,15,16(肺前駆細胞)。これらの治療法は大きな可能性を秘めていますが、免疫拒絶反応や長期的な有効性などの課題は依然として残っています17,18。肺線維症(PF)は、肺組織の過度の瘢痕化を特徴とする慢性進行性の肺疾患であり、肺機能障害を引き起こします19。PFの細胞療法は、間葉系幹細胞や遠位肺前駆細胞などの再生細胞を罹患した肺に導入することにより、損傷した肺組織を再生し、線維化を軽減することを目的としています20。基底細胞、肺胞II型細胞、気管支肺胞幹細胞、およびその他の多能性前駆細胞などの集団を含む遠位肺前駆細胞は、組織修復を促進し、炎症を軽減し、損傷した肺組織を再生し、正常な肺機能を回復しながら肺の損傷の一部を逆転させる能力を持っています21。.いくつかの前臨床および初期段階の臨床研究では、肺前駆細胞を線維性肺に移植すると、肺胞構造の再生、組織リモデリングの促進、および炎症の軽減に役立つことが示されています13,22,23。さらに、これらの細胞は、線維性環境を調節するさまざまな成長因子やサイトカインを分泌し、修復をさらに促進することができます。肺機能の改善には有望な結果が得られていますが、これらの細胞の効率的な分離、増殖、損傷した肺組織への統合、長期的な安全性の確保、望ましくない副作用の防止など、細胞送達の最適化には課題が残っています。プロトコルを改良し、肺線維症に対する前駆細胞療法の長期的な安全性と有効性を評価するには、継続的な研究が必要です。

肺線維症のために肺に細胞を移植するには、いくつかの技術が必要であり、それぞれが細胞送達、生存、および損傷した肺組織への統合を改善するように設計されています。一般的な方法には、静脈内注射24,25、気管支内送達26,27、および気管内注入28,29,30,31が含まれ、それぞれに特定の利点と課題があります。幹細胞の静脈内投与は、最適でない肺ホーミング、オフターゲット臓器での隔離、注入後の生存率の制限、および免疫原性反応のリスクによって妨げられます。気管支内送達は、より局在化していますが、不均一な細胞分布、潜在的な気道閉塞、炎症反応、および線維性肺構造内の手続き上の課題によって制約されます。同様に、気管内注入は、直接肺沈着を可能にするにもかかわらず、一貫性のない細胞分散、不十分な遠位肺浸透、局所的な刺激、および肺コンパートメント間の用量均一性の変動につながる可能性があります。.これらの技術はすべて、細胞の生存率、統合、および肺組織の再生における有効性を改善することを目的としていますが、最適な技術の選択は、移植される細胞の種類、線維化の段階、患者の全体的な健康状態などの要因によって異なります。

その課題にもかかわらず、気管内点滴は、特に肺線維症の状況において、細胞を直接肺に送達するために最も一般的に使用される方法の1つです。この技術では、細胞は、気管32に挿入されたカテーテルを介して肺に導入される。その後、細胞は肺胞腔に沈着し、損傷した肺組織を修復できる可能性があります。この方法は、 ex vivo 肺灌流などの他の送達アプローチと比較して、低侵襲で比較的簡単に実行できます。細胞が直接肺に沈着するため、効果的な統合と修復の可能性を高めることができます。静脈内注射とは異なり、気管内注入は体循環を回避し、細胞が肝臓や脾臓などの他の臓器に閉じ込められるリスクを減らし、肺でより集中的な治療効果をもたらします。これらの利点にもかかわらず、この方法は、細胞の分布と保持、および肺内での生存率が最適でないという点で依然として課題に直面しており、治療効果が制限される可能性があります。現在進行中の研究は、より効果的な臨床転帰のためにこのアプローチを改良するために取り組んでいます。研究者は、いくつかの要因を評価することにより、気管内注入が彼らのアプリケーションに適しているかどうかを判断できます。これらには、送達される細胞の種類、生存して肺組織に統合する能力、および疾患モデルの重症度(すなわち、肺線維症)が含まれます。

イメージングは、細胞を追跡し、その生存率、分布、および効果を評価し、細胞治療のモニタリングを強化し、治療戦略を最適化するために不可欠なツールである33。研究者は、細胞の分布と保持を追跡するためのイメージングと送達後分析を通じて送達効率を評価してきました。蛍光、磁気共鳴画像法(MRI)、コンピューター断層撮影法(CT)、陽電子放出断層撮影法(PET)、単一光子放出型コンピューター断層撮影法(SPECT)、超音波などのさまざまな技術を使用して、肺線維症の標識幹細胞を追跡しています。しかし、低深度浸透(蛍光)、低感度(MRI)、放射線被ばく(CT、PET、SPECT)、低解像度(超音波)などの制限に直面しています34。イメージングのコントラスト、解像度、生体適合性を最適化することで、これらの課題をある程度克服することができますが、新しいイメージング技術を探求することも、肺の幹細胞を正確に追跡するために不可欠であることが証明されています。近年、磁性粒子イメージング(MPI)は、バックグラウンド干渉のない高感度、リアルタイム、高コントラストの定量的イメージングを提供する、有望な放射線フリーイメージングモダリティとして浮上しています。

MPIは、超常磁性酸化鉄ナノ粒子(SPION)を直接可視化するために使用し、その動作原理は、時間変動磁場35,36にさらされたときのこれらのSPIONの非線形磁化応答に基づいている。電磁石は、この領域内の粒子のみが非線形磁化を示し、振動する磁場によって励起されると信号を生成する無磁場領域(FFR)を作成するために使用されます。一方、このFFRの外側の粒子の磁化は飽和しており、信号生成に関与しません。MPIは、FFRをイメージングボリューム全体に体系的に移動させることにより、ナノ粒子の分布とその後の画像の空間マップを構築します。MPIは、従来のイメージングモダリティ37,38に比べていくつかの利点を提供する。MRIやCTとは異なり、MPIはトレーサーからの信号のみを提供するため、バックグラウンドノイズがゼロで、コントラストが非常に高いです。高い時間分解能でリアルタイムイメージングが可能なため、細胞移動や灌流などの動的プロセスの追跡に最適です。また、MPIは感度が高いため、PETやCTとは異なり、電離放射線を使わずに少量のSPIONを検出することができます。さらに、優れた線形定量も示し、トレーサー濃度の正確な評価を可能にします。全体として、MPIは感度、安全性、定量の長所を兼ね備えており、バイオメディカルイメージングの強力なツールとなっています。MPIは、肺の幹細胞追跡に有望であり、細胞の遊走、保持、および治療効果の正確なモニタリングを可能にします。組織信号の干渉なしに優れたコントラストを提供し、標識幹細胞39,40,41,42の正確な局在化を可能にします。次のセクションでは、これらの研究で実施されたプロトコルを概説し、標識細胞をマウスの肺に送達するための気管内点滴の使用と、MPIによる確認を示します。

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プロトコル

動物を対象とするすべての手順は、ミシガン州立大学の動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されており、人間を対象とする手順は、Corewell Health IRB no. 2017-198によって承認されています。すべての患者は、研究に参加する前に書面によるインフォームドコンセントを提供しました。

肺移植を受けている特発性肺線維症(IPF)患者からのヒト肺外植片サンプルは、Corewell Healthから収集されました。移植手術に先立ち、すべての患者が、低酸素血症、呼吸困難、肺活量の減少を特徴とする特発性肺線維症(IPF)の診断基準を満たしていた43。肺葉の遠位端から採取した組織の病理学的分析により、線維症の存在が確認されました。

雄のNOD/SCIDマウスを8週齢で購入し、1週間順応させた後、処置の12週間前まで老化させた。

1. ヒト気道上皮細胞の単離と拡大

  1. 摘出した肺サンプルを氷上に置いて、解剖中の細胞の完全性を維持します。サンプルに存在する気管支/大きな気道を特定します。小さな気道は、肺サンプルの遠位部分に位置し、大きな気道から最も離れています。滅菌された器具を使用して、肺サンプルの遠位部分を切り出し、組織の消化を助けるために小さな部分に処理します。ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)でサンプルをすすぎ、余分な血液と体液を取り除き、 ストレプトマイセス・グリセウス由来のプロテアーゼ、1x ペニシリン/ストレプトマイシン、DNase I、および1x Gentamicinを50 mLチューブに入れた緩衝液で、小さな気道を含む外植した肺組織を消化します。組織を37°Cの水浴に入れ、約4時間、または組織が十分に消化されるまで揺さぶります。
  2. 50 mLチューブの内容物を滅菌済みの100 μmセルストレーナーに通します。ティッシュをDPBSで3回すすぎ、洗浄液をストレーナーに通します。400 μLにセットしたピペットで細胞懸濁液を50xピペッティングし、400 gで500 × g の遠心分離により細胞をペレット化し、上清を除去し、細胞を1 mLの培養培地に再懸濁します。
  3. 気道上皮増殖培地を含む75 cm2 の培養フラスコに細胞懸濁液を加えます。細胞を37°C、5%CO2 で約2週間培養します。

2. 気道上皮細胞のナノ粒子(酸化鉄トレーサー)による標識

  1. 上皮培養物が80%コンフルエントになったら、最終濃度250 μg/mLの酸化鉄トレーサーで細胞を標識します。上皮細胞のフラスコあたり10 mLの培地に適切な量の酸化鉄トレーサーを加え、48時間インキュベートします。
    注:細胞標識について、異なる濃度の酸化鉄トレーサー(50、100、200、および250μg/mL)を評価し、続いて2D MPIスキャンを行いました(図1A)。この研究では、250 μg/mL の濃度と 50,000 個の移植細胞が確定しました。
  2. 48時間後、細胞をDPBSで3回洗浄し、余分なナノ粒子を除去します。
  3. 細胞剥離試薬を使用して細胞を剥離し、細胞を37°Cで15分間、または細胞がフラスコの表面から浮き上がり始めるまでインキュベートします。
  4. 細胞を1 mLのウシ胎児血清を含む50 mLチューブに集めます。フラスコを5mLのDPBSで3回すすぎ、細胞を含む50mLチューブに洗浄液を加えます。
  5. 細胞を400 × g で5分間遠心分離してペレット化します。上清を取り除き、500 μLに設定したピペットで細胞懸濁液を50回ピペッティングして、細胞を1 mLの培養培地に再懸濁します。
  6. 血球計算盤を使用して細胞濃度を決定し、 in vivo 移植に必要な細胞懸濁液の量を決定します。
  7. 細胞懸濁液100μLを分注し、4%パラホルムアルデヒドに固定します。

3. in vitro 免疫染色と顕微鏡検査

  1. 100 μLの細胞懸濁液をスライドとフィルターが入ったサイトスピンカートリッジにロードし、1,000 rpmで5分間撹拌します。
  2. 疎水性ペンを使用して、スライド上のセルの輪郭を描きます。
  3. スライドをDPBSで2 x 15分間洗浄します。
  4. 0.1% Triton X-100とDPBS溶液で室温で5分間インキュベートすることにより、スライド上の細胞を透過処理します。
  5. 細胞をDPBSで2 x 2分間洗浄します。
  6. 5%ウシ血清アルブミン(BSA)/1%ヤギ血清をDPBS中で2時間ブロックします。
  7. スライドを一次抗体(抗デキストラン)に溶かし、DPBS中の2.5% BSA/0.5%ヤギ血清中で4°Cで一晩インキュベートします。
  8. 一次抗体を取り出し、スライドを1x Tris-Buffered Saline with Tween 20 (TBST) で 5 分 x 3 回洗浄します。
  9. スライドを1:1,000二次抗体(2.5% BSA/0.5% ヤギ血清中)のDPBS溶液で、室温の暗所で1時間インキュベートします。
  10. スライドを1x TBSTで3 x 5分間洗浄します。
  11. 核染色剤4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)をDPBS中濃度1:1,000のスライドに添加し、室温で5分間インキュベートします。
  12. スライドを1x TBSTで2 x 5分間洗浄します。スライドから余分な1x TBSTを取り除きます。
  13. DAPIで封入剤を追加し、気泡が入らないように注意しながらスライドの上にガラスカバースリップを置きます。
  14. スライドがセットされたら、透明なマニキュアを使用してカバーガラスの端を密封します。
  15. スライドを共焦点顕微鏡で画像化します。

4. 気管内注入法による細胞移植

  1. 準備
    1. マウスの体重を量り、各マウスに必要なブレオマイシン(BLM)の用量を計算します。
    2. 1.7 mLの微量遠心チューブに、目的のBLM溶液(滅菌生理食塩水で希釈)を50 μLを超えない容量で調製します。
      注:薬物濃度は実験目標によって異なります。この手順には、0.6 U/kg の BLM を使用しました。
    3. BLM溶液をピペットにロードします。さらに、シリンジに200μLの空気をプリロードして、すべての液体量が気管に排出されるようにします。
      注:BLM処理の72時間後、標識細胞懸濁液は同様の方法で投与されます。
    4. ステップ2.6で得られた細胞数を用いて、投与する細胞懸濁液(50,000個を含む)の量を計算します。
    5. イソフルラン(2.5〜3%)を供給する麻酔ユニットに接続された誘導ボックスにマウスを麻酔し、鎮静するまでマウスを麻酔します。
      注:マウスは、全手順中に2回麻酔されます:(1)BLM投与の日と(2)細胞の気管内注入の日、つまりBLM投与の72時間後。
    6. 図2Aに示すように、光ファイバープローブが喉頭鏡とカテーテルを通過した状態で、ファイバーライト挿管キットをセットアップします。
      注:ファイバーの照らされた端は、カテーテルチューブのすぐ外側(1〜2 mm)に配置する必要があります。
  2. 気管内点滴。
    1. 足の指を後ろ足のどちらかにつまんでペダル反射を確認し、麻酔を確認します。適切な麻酔が確認されたら、マウスの切歯を角度付きのげっ歯類挿管スタンドの仰臥位に吊り下げます(図2B-D)。
    2. 鈍い鉗子を使用して、舌を慎重につかみ、上向きと左向きの動きで、喉頭が適切に視覚化されるように舌を配置します。
    3. 光ファイバープローブをオンにし、口に入って気管に近づきます。喉頭鏡の拡大鏡を使用して、喉頭の視覚化を改善し、気管開口部の声帯を特定します。
    4. カテーテルを気管開口部に挿入し、喉頭鏡を非常に慎重に取り外して引き出します。生理食塩水(20μL)の小さな液滴をカテーテルの上端に置きます。
      注意: 液面は、マウスの呼吸数に合わせて上下に動きます。これにより、カテーテルが誤って食道に配置されるのではなく、気管に配置されていることが確認されます。
    5. 200μLの空気を予め装填したシリンジを取り付け、液滴を内部に押し込みます。細胞懸濁液(≤50μL)をカテーテルに入れ、前回と同様に空気注入シリンジを使用して点滴します。
    6. 点眼した液体が気管から逃げるのを防ぐために、カテーテルを5〜7秒間そのままにしておきます。その後、カテーテルをそっと引き抜きます。
    7. マウスを挿管スタンドの同じ位置に少なくとも30秒間保持します。.
    8. マウスを取り外し、ヒーティングパッドの上に置かれたリカバリーケージに入れます。麻酔から完全に回復するまで監視します。

5. 磁性粒子イメージング

  1. イソフルラン(2〜2.5%)を供給する麻酔ユニットに接続された誘導ボックスにマウスを麻酔して、鎮静するまでマウスを麻酔します。
  2. マウスベッドをMPIスキャナーにセットアップし、麻酔ラインが適切な接続を介してベッドの下を通過するようにします。
  3. マウスを鎮静させている間に、MPIスキャナーをイメージング用に準備します。リンクされたソフトウェアを起動し、 識別のためにProject でフォルダ名を定義し、 Exam名 ドメインでスキャンを定義し、要件に応じてスキャンパラメータを設定します。この手順に従うには、次のスキャンパラメータを使用します: スキャンタイプ:2Dスキャン。スキャンモード:標準;送信チャネル:マルチチャネル(等方性);予測あたりの平均: 2.
  4. ステップ4.2.1で説明されているように、麻酔を確認します。 図2Eに示すように、マウスをMPIベッドにしっかりと置きます。
    注意: スキャン中に麻酔を適切に維持するために、鼻がベッドの内蔵ノーズコーンと適切に位置合わせされていることを確認してください。
    注意: スキャン中の麻酔が不十分な場合、スキャンの実行中にマウスがウェイクアップする可能性があります。
  5. マウスをスキャナーに配置したら、ベッドをボアの内側に押し込み、[ スキャンの開始]をクリックします。
  6. スキャンが完了したら、マウスをMPIベッドから取り出し、加熱パッドの上に置かれたリカバリーケージに入れます。麻酔から完全に回復するまで監視します。
  7. 画像解析ソフトウェアを使用して画像を解析します。

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結果

パイロット研究は6匹のマウスで行われました。これらのうち、研究が完了する前に10日目に死亡したマウスは1匹だけでした。異なる標識濃度に対する2D MPIシグナル強度を、細胞数の関数として評価しました(図1A)。信号強度は酸化鉄トレーサーの濃度に正比例することが観察されました。したがって、250 μg/mL の濃度が最適な標識濃度と見なされ、その後の研究に使用されました。 In vitro 細胞の標識も、免疫染色およびその後の蛍光顕微鏡法を用いて確認されました(図1B)。細胞標識効率はフローサイトメトリーを使用して評価することもでき、これには蛍光色素をナノ粒子に結合させる追加のステップが必要になることに注意することが重要です。このアプローチは現在の研究では利用されていませんが、将来の調査に組み込まれる可能性のある貴重な戦略であることに変わりはありません。

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ディスカッション

マウスへの気管内注入は、物質を直接肺に送達するための精密な技術です。この手順全体にわたる複数の重要なステップでは、細心の注意が必要です。まず、不快感や動きを防ぐために適切な麻酔の深さを確保し、マウスを仰臥位にして首を伸ばし、気管開口部に明確にアクセスできるように気道を整列させます。舌圧子を使用すると、気道を開いたままにするのに役立つ場合があります。カテーテルが慎重に挿入され、物質(幹細胞、薬物、ナノ粒子など)が逆流や誤嚥を避けるためにゆっくりと点眼されていることを確認してください。点眼後、マウスをケージに戻す前に、完全な回復を確認し、苦痛や呼吸器合併症がないか監視してください。イメージング中のその他の注目すべきステップには、MPIスキャナー内のマウスをイメージングフィールドに合わせて適切に配置すること、および磁場強度や高解像度トラッキングのためのスキャンモードなどのパラメータの最適化が含まれます。

さらに、長時間の鎮静による呼吸困難を避けるために、点滴手順とMPIイメージングの間にマウスが麻酔から完全に回復するのを...

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開示事項

著者には、開示すべき利益相反はありません。

謝辞

この研究の資金の一部は、R01HL153165-01A1からX.P.L.への助成金とR21AI159928-01からP.W.への助成金によって提供されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1.7 mL マイクロ遠心管DOT ScientificRN1700-GMT細胞採取とBLM希釈の準備用
Anti-Dextran 抗体STEMCELL Technologies60026一次抗体
BD Luer-Lok シリンジBecton, Dickinson309628気体注入用（気管内投与時）
Cytospin 3Thermo Shandon74010121GB
DNase IMillipore-Sigma10104159001
Dulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS +/-）Gibco14190250
胎児ウシ血清ThermoFisher ScientificA5670701
ゲンタマイシンGibco15750060
ヤギ抗マウスIgG（H+L）クロス吸着二次抗体、Alexa Fluor® 568ThermoFisher ScientificA-11004二次抗体
ヤギ血清Millipore-SigmaG9023
イソフルランCovetrus11695067772気体麻酔
イソフルラン気化器SOMNI ScientificVS6002麻酔装置
MomentumMagnetic Insight Inc前臨床磁性粒子イメージング（MPI）スキャナー
マウス挿管キットOHANOhan-201必要なすべての付属品を含む完全な挿管キット
NOD/SCID マウスJackson LaboratoryRRID:IMSR_JAX:001303免疫不全マウスモデル
ペニシリン/ストレプトマイシンGibco15140122
PneumaCult-Ex Plus 培地STEMCELL Technologies5040
ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPIInvitrogenP36962免疫染色されたスライドの取り付け媒体
Streptomyces griseus 由来のプロテアーゼMillipore-SigmaP5147
外科用キットマウスの舌を保持するために使用される鈍端鉗子
Tween20入りのトリス緩衝生理食塩水（TBST）ThermoFisher Scientific28360
TrypLE Express 酵素ThermoFisher Scientific12604021
VivoTrax PlusMagnetic InsightMIVTP01細胞の標識とその後のMPIのための鉄酸化物トレーサー

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