Method Article

マウス網膜におけるグリア相互作用を研究するための ex vivo 外植片モデル

DOI:

10.3791/68482

⸱

July 15th, 2025

 ,  , 
1Department of Ophthalmology, Schepens Eye Research Institute of Massachusetts Eye and Ear, Harvard Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、マウスの眼から網膜を分離し、 ex vivo での長時間の実験を行うための詳細な方法論を提供します。このプロトコルは、生体組織中に網膜グリア をin situ に保つことによって得られる研究手段を利用したい研究者にとって、この技術的に要求の厳しいアプローチを利用できるようにすることを強調しています。

Abstract

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緑内障におけるグリアの役割はますます目立つ研究トピックですが、これらの支持細胞の集団、つまりアストロサイトとミクログリアが網膜神経節細胞の生存にどのように影響するかについては、多くのことがわかっています。in vivoモデルとin vitroモデルではある程度の知見が得られますが、前者では末梢免疫応答の影響、後者では細胞単離と培養によって誘発される生理機能の変化など、どちらのアプローチにも大きな制限があります。これらの交絡因子を最小限に抑えるために、アストロサイト、ミクログリア、およびその他の網膜細胞タイプを少なくとも3日間in situで維持できるex vivo網膜外植片システムを開発し、in vivoモデルで通常実現可能なよりも高いスループットで標的を絞った調査を可能にしました。重要なことに、このアプローチは、生きている動物では困難または実行不可能な方法論に非常に適していますが、無傷の神経組織の一般的な下流アッセイとの互換性を保ちます。ここでは、無傷の網膜外植片の単離と培養に適したプロトコルと、ex vivo網膜のグリア細胞と網膜神経節細胞が受けた変化を文書化した免疫蛍光顕微鏡の代表的な結果を示します。

Introduction

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光感受性網膜は、目の奥にある中枢神経系(CNS)の延長線上にあり、視力には不可欠ですが、急性の損傷と慢性疾患の両方に脆弱です。他の中枢神経系領域と同様に、成体網膜のニューロンは失われても置換されず、視覚情報を集約して脳に中継する網膜神経節細胞(RGC)は、緑内障における機能障害や死に対して特に脆弱であり、不可逆的な視力喪失をもたらす1,2。緑内障は世界中で失明の主な原因となっています3が、罹患した個人に壊滅的な影響を与え、社会に全体的なコストがかかるにもかかわらず、病気の初期段階がRGCの損失にどのように寄与するかについては、多くのことが不明なままです4。グリアの役割は、緑内障の病態生理学における主要な研究領域であり、これらの非ニューロン支持細胞はRGCの生存に不可欠であり5、しかし、有益な行動6を減少させる可能性のある疾患の表現型の変化を受けるか、または有害な表現型7の採用を促進する可能性があります。グリアという用語は、CNS全体にわたるさまざまな特殊な細胞型を包....

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Protocol

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動物が関わるすべての手順は、シェペンス眼科研究所の動物施設管理・使用委員会(IACUC)によって承認されました(プロトコル#2022N000030、2025年3月4日承認)。動物は、眼科および視覚研究における動物の使用に関する視覚および眼科研究学会(ARVO)の声明に従って取り扱われました。

注: 図1 は、除核マウスの眼から生きた網膜を分離するための主要なステップを示しています。

figure-protocol-1
図1:除核したマウスの眼から生きた網膜を分離するための主要なステップを図式化 したものです。主要なステップの対応するステップ番号は、円で囲まれています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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Results

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巨視的なスケールでは、外植された網膜は、1日と3日の両方の時点で基本的に変化しませんが、後者になると比較的壊れやすくなり、固定やその他の実験的エンドポイントの前に慎重な取り扱いが必要になります。網膜は比較的平らで、折り畳みがなく(これにより酸素と栄養素の拡散が局所的に妨げられる可能性があります)、気液界面と細胞培養インサートの間の培地に懸濁する必要があります。3日目までに、懸濁した組織の下のインサートの底にかすかな縞が形成されることがあります。明視野位相差顕微鏡による検査では、特に24時間から72時間の時点で、細胞の破片、おそらく変性光受容体の外側の部分が適度に排出されていることが示唆されています。これは、光受容体の脆弱性と、網膜単離中に大部分が失われるRPE基質への依存性を考えると、驚くべきことではありません。ただし、メディア自体が曇っているように見える場合は、微生物汚染の可能性を調査する必要があります。最初の単離プロセスで網膜をバイオセーフティキャビネットの外側で扱ったにもかかわらず、どのサンプルでも微生物汚染を検出することができず、滅菌バッファーの使用、ペニシリン(100 U/mL)とストレプトマイシン(100 μg/mL)の培養.......

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Discussion

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レチナール外植片などの器官型培養32のアプローチは、細胞培養の実験的柔軟性と迅速なターンアラウンドタイムを利用しながら、in vivo研究のin situコンテキストの多くを保持し、細胞タイプ間の複雑な相互作用を調査するための強力な手段となっています。このプロトコルは、目に関する豊富な経験があり、固定網膜の操作に慣れているが新しい網膜ではない研究者のためのエントリーポイントとして提示します。そのため、私たちは、分離と取り扱いに関連する技術的な課題とばらつきを減らすことに注力してきましたが、これは私たちの経験から、一貫したサンプルを確実に生成するための大きな障壁であることが明らかになりました。しかし、眼は構造と組織で構成される複雑な器官であり、その構造と組織の性質は機能的にほぼ同じであり、マウスの眼のコンパクトな性質は、損傷なしに網膜を抽出するという課題をさらに悪化させます。したがって、単離中に網膜への過剰な構造的または代謝的損傷を回避し、高品質の組織を確実に得るためには、ある程度の柔軟性.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は何も開示していません。

Acknowledgements

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M.A.M. は、NIH/NEI R01EY035312、Glaucoma Research Foundation Catalyst for a Cure Award、Melza M. and Frank Theodore Barr Foundation、Robert M. Sinskey, MD, Foundation、Ruettgers Family Charitable Foundation、B.L. Manger Foundationの支援を受けました。P.F.C.はNIH/NEI 2T32EY007145によってサポートされました。この作業は、NIH Core Grant for Vision Research P30 EY003176によっても実現されました。 図 1 は Biorender で生成したものです。著者らは、原稿に対するフィードバックを提供してくださったNasir Uddin博士と、支援とサポートを提供してくださったQiurong Zhu博士に感謝します。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
#11 メスの刃Bard-Parker3,71,311
1 mL ピペット ('Pipetman P1000')GilsonF144059M
100 mm ペトリ皿Falcon351029
16% パラホルムアルデヒドTed Pella Inc18,505固定用 4% に希釈
24 ウェルプレートFalcon353047固定、ブロッキング、抗体インキュベーション
35 mm ペトリ皿Falcon351008
6 ウェル プレートおよびインサート キットGreiner bio-one657641
Alexa Fluor 488-Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 711-545-1521:800 希釈
Alexa Fluor 594 ロバ抗ラット IgG (H+L) 高度に交差吸着されたInvitrogenA-212091:800 希釈
Alexa Fluor 594-F(ab')2 ロバ抗マウス IgG (H+L) ジャクソン免疫研究所 715-586-1501:800 希釈
Alexa Fluor 647-ロバ抗モルモット IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 706-605-1481:800 希釈
Alexa Fluor 647-F(ab')2 ロバ抗チキン IgY (IgG) (H+L) ジャクソン免疫研究所 703-606-1551:800希釈
付き鉗子('5/45')FST / Dumont11251-35
抗Brn3a抗体(マウス)ChemiconMAB15851:200希釈抗
CD206抗体(ラット)BioradMCA22351:200希釈
GFAP抗体(ニワトリ)Abcamab46741:1000希釈抗
Iba1抗体(ウサギ)富士フイルム和光ピュアケミカル株式会社019-197411:500希釈抗
Tmem119抗体(モルモット)シナプスシステム400 0041:500希釈
B-27、50xGibco(サーモフィッシャー)17504044
鈍い湾曲鉗子('Extra Fine Graefe)FST11152-10
シ血清アルブミンマアルドリッチA9647ブロッキングおよび抗体インキュベーションに 1% w/v を使用
キット (0.2 & micro;m aPESメンブレン、150 mLボトルトップフィルター) フィッシャーサイエンティフィFB12566508
ファインブラシ、サイズ 3/0プリンストン アート & ブラシ カンパニー06435-1030
GlutaMaxGibco (サーモフィッシャー)35050061
ラボワイプ (Kim ワイプ) KIMTECH34155
N-2、100xGibco (Thermofisher)17502048
Neurobasal-A 培地、フェノールレッドGibco (Thermofisher) を除いたもの (Thermofisher)12349015
ノーマル ロバ血清Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 017-000-121ブロッキングおよび抗体インキュベーションに10%で使用
ニシリン-ストレプトマイシンGibco(Thermofisher)15140122
ペットチップ、1000&マイクロ;LTipOne1126-7810
スプリングハサミ ('Cohan-Vannas')FST15000-11
滅菌水 ('Dnase, Rnase free')Invitrogen10977-015
滅菌ろ過 PBSGibco10010-023
ストレート鉗子 ('mini')FST / Dumont11200-14
トランスファーピペット、5.8 mLフィッシャーサイエンティフィ13-711-9AMMD
Triton X-100サーモサイエンティフィックケミカルズA16046。APブロッキングおよび抗体インキュベーションに0.5%で使用
角度抗ズウシグ フィルターック ペピック

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Quigley, H. A. Understanding glaucomatous optic neuropathy: the synergy between clinical observation and investigation. Annu Rev Vis Sci. 2, 235-254 (2016).
  2. Alqawlaq, S., Flanagan, J. G., Sivak, J. M.

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