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方法論記事

マウス網膜におけるグリア相互作用を研究するための ex vivo 外植片モデル

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DOI：

10.3791/68482

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2025年7月15日

 ,  , 
1Department of Ophthalmology, Schepens Eye Research Institute of Massachusetts Eye and Ear, Harvard Medical School

この記事について

サマリー

ここでは、マウスの眼から網膜を分離し、 ex vivo での長時間の実験を行うための詳細な方法論を提供します。このプロトコルは、生体組織中に網膜グリア をin situ に保つことによって得られる研究手段を利用したい研究者にとって、この技術的に要求の厳しいアプローチを利用できるようにすることを強調しています。

要約

緑内障におけるグリアの役割はますます目立つ研究トピックですが、これらの支持細胞の集団、つまりアストロサイトとミクログリアが網膜神経節細胞の生存にどのように影響するかについては、多くのことがわかっています。in vivoモデルとin vitroモデルではある程度の知見が得られますが、前者では末梢免疫応答の影響、後者では細胞単離と培養によって誘発される生理機能の変化など、どちらのアプローチにも大きな制限があります。これらの交絡因子を最小限に抑えるために、アストロサイト、ミクログリア、およびその他の網膜細胞タイプを少なくとも3日間in situで維持できるex vivo網膜外植片システムを開発し、in vivoモデルで通常実現可能なよりも高いスループットで標的を絞った調査を可能にしました。重要なことに、このアプローチは、生きている動物では困難または実行不可能な方法論に非常に適していますが、無傷の神経組織の一般的な下流アッセイとの互換性を保ちます。ここでは、無傷の網膜外植片の単離と培養に適したプロトコルと、ex vivo網膜のグリア細胞と網膜神経節細胞が受けた変化を文書化した免疫蛍光顕微鏡の代表的な結果を示します。

概要

光感受性網膜は、目の奥にある中枢神経系(CNS)の延長線上にあり、視力には不可欠ですが、急性の損傷と慢性疾患の両方に脆弱です。他の中枢神経系領域と同様に、成体網膜のニューロンは失われても置換されず、視覚情報を集約して脳に中継する網膜神経節細胞(RGC)は、緑内障における機能障害や死に対して特に脆弱であり、不可逆的な視力喪失をもたらす1,2。緑内障は世界中で失明の主な原因となっています3が、罹患した個人に壊滅的な影響を与え、社会に全体的なコストがかかるにもかかわらず、病気の初期段階がRGCの損失にどのように寄与するかについては、多くのことが不明なままです4。グリアの役割は、緑内障の病態生理学における主要な研究領域であり、これらの非ニューロン支持細胞はRGCの生存に不可欠であり5、しかし、有益な行動6を減少させる可能性のある疾患の表現型の変化を受けるか、または有害な表現型7の採用を促進する可能性があります。グリアという用語は、CNS全体にわたるさまざまな特殊な細胞型を包含しているが8、これらは大きく2つのカテゴリーに分けることができる - ニューロンと発生系統を共有し、栄養的、エネルギー的、構造的サポートを提供するもの9と、骨髄系起源のものが特殊な免疫監視および応答課題10を実行するもの.両カテゴリーの代表者(前者では星状細胞とミュラー細胞、後者ではミクログリア)が網膜に存在し5、緑内障で大きな変化を遂げ、疾患の進行とRGC生存におけるそれらの役割について重大な疑問を提起する。

これらの疑問に答えようとする努力は、in vivoおよびin vitro研究の両方に課題を提示するレチナールグリアの本質的な特性によって部分的に妨げられています。ニューロンとは異なり、電気的には比較的静かであるため、in vivoでRGCや光受容体の機能評価を可能にするERGのようなアプローチは、グリアの機能や行動の変化を調べるのには適していません。また、緑内障の誘導性12モデルと自然発生13モデルが利用可能ですが、疾患の最も早い時点でのグリアの変化については多くの不明なままです。これは、検出可能なRGC損失に先行する可能性があります。これらのモデルの多くで疾患状態の浸透度が異なることによって問題が悪化します。さらに、臨床的および実験的緑内障の両方からの証拠は、末梢免疫細胞からの寄与を示唆しており、これはミクログリアのものと区別するのが難しい可能性がありますが、それらが疾患の進行に影響を与えるために異なる「方向」に作用する可能性があるという指標にもかかわらず14,15。

in vitroで網膜グリアを研究することにも課題がたくさんあります。アストロサイト16,17およびミクログリア18の脳からの単離と培養は十分に確立されているが、最近の研究では、CNS領域間、特にアストロサイト19における広範なグリアの不均一性が強調されており、ある領域に存在する表現型は、網膜20,21のような別の領域のグリアには存在しない可能性がある.しかし、研究のために網膜アストロサイトとミクログリアを直接単離することは特に困難であり、両方の細胞タイプは比較的まばらであり、それぞれがマウス網膜の推定650万個の細胞の1%未満を占めている22,23,24。さらに、ニューロンとは異なり、グリアは高度に可塑性であり、周囲の劇的な変化に迅速に適応します16,18,25;その結果、in vitroでこれらの細胞で観察される行動は、健康や病気で一般的に見られる表現型パターンではなく、新しい環境への特定の適応を表している可能性があります。in vivo実験とレチナールグリアの初代培養の両方の限界を考慮して、グリア、RGC、および網膜の他の要素をex vivoの文脈でin situ保存する中間的なアプローチ(網膜外植片)を模索しました。in vivoモデルと比較して、このアプローチは、実験時間の経過を短縮し26、網膜グリア27の直接的な実験的操作を可能にし、末梢免疫細胞浸潤14の潜在的に交絡的な影響を回避する。逆に、初代細胞培養とは異なり、細胞外環境の破壊は最小限に抑えられ、グリアは無傷で形態学的に認識可能なままであり、酵素的および機械的破壊後のこれらの細胞を本質的に再増殖および同定することに関連する課題を回避します16,25。

以前に述べた網膜外植片の方法論と比較して、このアプローチは、技術的な信頼性、再現性、およびアクセシビリティ26,28を改善するためのアプローチの「使いやすさ」の最大化に焦点を当てることを強調している。他の研究者との個人的なコミュニケーションの中で、生きた網膜の取り扱いに関連する技術的な課題は、外植片を利用しようとしている多くの人々にとって大きなハードルである一方で、培養中の外植された網膜の維持は、適切な細胞培養施設を持つグループにとって比較的簡単であることがわかりました。したがって、このプロトコルには、網膜分離に関連する学習曲線を短縮し、研究者が実験データの収集をより迅速に開始できるようにすることを目的とした多くのイノベーションが含まれています。最後に、この外植片モデルの可能性に特に重点を置いて、レチナールグリアの挙動を調査し、主に免疫蛍光顕微鏡で特徴付けていますが、他の網膜細胞の種類と構造も大部分保存されており、外植された網膜は幅広い追加の調査技術に従順なままです。

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プロトコル

動物が関わるすべての手順は、シェペンス眼科研究所の動物施設管理・使用委員会(IACUC)によって承認されました(プロトコル#2022N000030、2025年3月4日承認)。動物は、眼科および視覚研究における動物の使用に関する視覚および眼科研究学会(ARVO)の声明に従って取り扱われました。

注: 図1 は、除核マウスの眼から生きた網膜を分離するための主要なステップを示しています。

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図1:除核したマウスの眼から生きた網膜を分離するための主要なステップを図式化 したものです。主要なステップの対応するステップ番号は、円で囲まれています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

1. 事前準備

  1. 1 mLピペットと角度付き鉗子を消毒し、バイオセーフティキャビネットに入れます。これらは、プロトコルのセクション3で必要になります。
  2. トランスファーピペットは、リザーバーの約2cm下、穴が最も広い場所でシャフトを垂直に切断して、ピペットを短くし、開口部を広げることにより、トランスファーピペットを改造します。網膜が引っ掛からないきれいなカットを確保してください。
    注意: このツールは、清潔で使用の合間に滅菌水ですすいでいる場合、再利用するために保管できます。
  3. 47.5 mLのニューロ基礎培地に500 μLのN-2サプリメント、1 mLのB-27サプリメント、500 μLのグルタマックス、および500 μLのペニシリン-ストレプトマイシンミックス(最終濃度100 U / mLのペニシリンと100 mg / mLのストレプトマイシン)を補給することにより、バイオセーフティキャビネットで50 mLの外植片培地を無菌的に調製します。.
    注:分離の各シリーズについて、新鮮な外植片培地を準備します。余ったメディアは、最大1週間4°Cに保持でき、必要に応じてメディア交換に使用できます。開封後、未使用のニューロベース培地は1ヶ月後に交換してください。N-2とB-27は、凍結融解サイクルを避けて、使い捨てのアリコートとして冷凍保存する必要があります。
  4. バイオセーフティキャビネットでは、使用する各ウェルにインサートを追加し、インサートの縁から出る「プロング」を介して取り扱い、培養培地に接触する表面に触れないようにして、培養プレートを無菌的に準備します。
    1. 1 mLの外植片培地をインサートに加え、続いてさらに3 mLをウェル自体に加えます。蒸発を制御するために、未使用のウェルに2〜3mLの滅菌水を追加します。
    2. プレートを5% CO2 で37°Cのインキュベーターに移し、組織単離の約30分前に平衡化します。
  5. フィルタースクエアを調製して、組織の安定化と転写のための基質を作成します。ボトルトップろ過キットからフィルターを取り出し、カミソリまたはメスで材料の周囲を切断します。折りたたんだり裂いたりしてフィルターを損傷したり、怪我をしたりしないように注意してください。
    注意: 頑丈なかみそりを使用して透明なプラスチックリザーバーを取り外し、ネジ付きアダプターがリザーバーと出会う場所でより可鍛性のある不透明なプラスチックを切断すると、抽出プロセスが簡素化されますが、怪我を防ぐために追加の注意を払う必要があります。
    1. フィルターを切断して取り外した後、鉗子を使用してフィルターを抽出します。抽出中および抽出後のフィルターの向きに注意してください。つや消し側(リザーバーに面している)は、ステップ2.16で転写のために網膜を取り付けるために直立している必要があります。
    2. フィルターを約7mm×7mmの小さな正方形にカットします。各網膜外植片には1つの正方形が必要です。正方形を100mmのペトリ皿の滅菌水に少なくとも20分間事前に浸します。
      注:フィルタースクエアは、使用前に最大1週間滅菌水に浸したままにすることができます。フィルターの正方形は浸漬前に高レベルの静電荷を発生する傾向があるため、必要な数の正方形のみを準備してください。残りのドライフィルター材料は、後で使用するために滅菌済みの100mmペトリ皿に無期限に保管できます。

2. 絶縁と実装

  1. 承認された方法でマウスを安楽死させてから、二次的なアプローチで確認します。この研究では、CO2窒息とそれに続く頸椎脱臼を使用しました。湾曲した鈍い先端の鉗子で両目を摘出し、滅菌PBSに入れます。
  2. 100 mmのペトリ皿に滅菌PBSを充填し、双眼解剖スコープのステージに置いて、ワークスペースを準備します。
    1. 幅1cmのラボワイプをカットし、皿に沈めて安定化基材として機能します。
    2. 片方の眼を解剖皿に移し、もう片方の眼をPBSに残し、氷上または4°Cの冷蔵庫に置きます。
      注:網膜は死後間隔の延長に敏感であるため、一度に1匹のマウスを安楽死させることをお勧めします。
  3. 目の位置を固定します。鉗子を使用して、水没したラボワイプに目を操作し、安定化を支援します。
    1. 適切な保持ポイントを特定し、角度のある鉗子でつかみ、目をそっと転がして、側面から、または理想的には下から保持されるようにします。前後軸(つまり、角膜から視神経まで)が水平であることを確認してください。.この向きにより、視認性が向上し、解剖中の眼への圧力が最小限に抑えられます。
      注:可能であれば、眼窩外組織をつかんで目を穿刺したり圧迫したりしないようにし、視神経や脂肪よりも筋肉や結膜を優先します。
  4. 角度のついた鉗子でホールドを維持しながら、目が完全に沈み、しっかりと固定されていることを確認してください。#11メスの先端を平行にし、角膜が強膜に移行する辺縁部の後方に約0.5mmで切開します。
    注:この切開部は、スプリングハサミの1枚の刃の先端に収まる大きさにする必要があります。メスの先端の切れ味は地球をきれいに突き刺すために重要であるため、網膜を2つごとに刃を交換してください。
    1. スプリングハサミの1つのブレードを地球儀の内側に挿入し、目の周りを周囲に切断し始め、必要に応じて鉗子を使用して目の位置を穏やかに変更します。
      注:このカットは、リンバスに対してできるだけまっすぐで平行である必要があります。目の位置を変えるには、はさみを置き、両手で1組の鉗子を使用する必要がある場合があります。露出したら、解剖全体を通して網膜を沈めたままにしてください。
  5. 切り傷が目を囲んだら、前眼部と水晶体を慎重に取り外し、アイカップを上向きに回転させて、目視検査と硝子体の除去を容易にします。視神経の延長部分が付着したままの場合は、これを容易にするためにそれをより短い(1〜2 mm)長さにトリミングします。
  6. 網膜に目に見える損傷がないか調べ、硝子体チャンバーに、前眼部の除去中に侵入した可能性のあるRPEまたは脈絡膜からの色素沈着細胞などの破片がないか検査します。角度のある鉗子を使用して、アイカップをこの位置に固定します。
    注:最適な結果を得るには、硝子体チャンバー内の破片を取り除き、網膜末梢の毛様体の残留硝子体および付着した残骸を最小限に抑える必要があります。これは困難なプロセスになる場合があり、代表的な結果の「機械的損傷の認識とトラブルシューティング」および「代謝性損傷」セクションに追加の注意事項があります。
    1. 改良されたトランスファーピペットを使用して、硝子体チャンバーをPBSで洗い流し、小さな粒子状の破片を取り除き、ピペットの先端を液体の表面の下に保持し、リザーバーバルブ内のPBSを適切な量に維持することで気泡を回避します。
    2. 細かい水彩ブラシで大きな破片を取り除き、網膜表面との接触を最小限に抑えます。必要に応じて、先端の細い鉗子でより永続的な破片を取り除きます。ただし、損傷を防ぐために、金属製のツールチップが網膜に直接接触しないようにしてください。
  7. 目に見える破片を取り除いた後、上記のように、トランスファーピペットからPBSで硝子体チャンバーを繰り返し(3〜5回)洗い流します。これにより、破片の除去後に残る可能性のある緩く付着したガラス質が除去されます。細いブラシを使用して、特に毛様体の要素が残っている場合は周辺部の近くで、チャンバーを静かにプローブします。硝子体は光学的に透明ですが、ブラシ繊維の抵抗として作用し、この方法で検出できます。
    注:網膜上の硝子体の薄い残留層は、隔離や 生体外での網膜の維持に悪影響を与えるようには見えませんが、網膜末梢にかなりの量が存在すると、毛様体からの残留構造としばしば関連し、除去しないと網膜の折り畳みとサンプル損失を引き起こす可能性があります。
    1. 硝子体のかなりのポケットが残っている場合は、ブラシを使用して周辺に向かって緩やかに外側に掃いてそれを取り除き、ブラシの繊維が網膜に接触する場合は、浅い角度からブラシを引きずり、チャンバーから硝子体を引っ張るのではなく、引っ張ります。
      注:硝子体の除去には、肉眼的に見えない可能性のある網膜損傷を避けるために、特に慎重な取り扱いが必要です。この損傷を認識して回避するためのアドバイスは、代表的な結果の「機械的損傷の認識とトラブルシューティング」および「代謝損傷」のセクションにあります。
  8. 硝子体チャンバーから破片が取り除かれ、硝子体が最小限のものだけが残ったら、斜めの鉗子でサンプルを安定させ続けながら、外側の網膜をアイカップから静かに分離します。視神経乳頭の損傷を避け、この構造をそのままにして網膜を固定します。
    1. 一対の鉗子を取り、先端が触れるように閉じた位置に保ち、可能であれば以前の取り扱いからの既存の隙間を使用して、網膜と脈絡膜の間にそっと挿入します。先端ではなく鉗子の平らな腕を使用して、網膜と脈絡膜の間のポケットを拡大し、これらの構造が完全に分離できるようになるまで広げます。
      注:網膜と脈絡膜の間のギャップを広げるために、先端を押すのではなく、横方向の動きを強調します。これらの動きの間に鉗子を穏やかにねじると、鉗子と組織との間の摩擦による純粋なストレスを減らしながら、分離を改善することができます。
  9. 外側の網膜を脈絡膜から分離した後、2組目の鉗子を使用してアイカップ(強膜、脈絡膜など)を下向きに引っ張りながら、サンプルの安定化を続けます。網膜がうまく分離された場合、網膜は視神経頭につながれたままに留まり、アイカップは1対の鉗子で保持できます。網膜がアイカップで圧迫されている場合は、視神経乳頭以外の接続点を優しく探り続けて分離します。.
  10. 網膜を視神経頭に固定した状態で、組織を固定し続け、2番目の鉗子を使用して視神経乳頭の下にアイカップを束ねます。
    1. 網膜と残りの毛様体との間の角度の過剰な硝子体のために、網膜周辺が折り畳まれた位置に固執していないことを確認してください。必要に応じて、トランスファーピペットを使用してチャンバーをPBSで洗い流し、追加の破片を取り除き、ブラシを使用して組織を緩め、組織を過度に引っ張らないように注意しながら、余分な硝子体を取り除きます。
  11. 網膜を両側から露出させた状態で、スプリングハサミを使用して、約90°の間隔で、周辺から視神経頭に向かって直線的に伸びる一連の緩和カットを作成します中心から約1mmで停止します。これにより、網膜内の網膜神経節細胞軸索の切断が最小限に抑えられ、培養外植片の品質が向上します。
  12. 水没した組織を所定の位置に保持しながら、鉗子を使用してラボワイプをそっと取り外し、組織から横方向に引き離してから、皿から取り出します。ワイプへの付着やサンプルの損失を防ぐために、網膜との接触を避けてください。
  13. 次に、組織を保持し続け、スプリングハサミを使用して網膜の真下にある視神経を切断し、アイカップの残りの部分を皿から取り出します。
  14. 網膜が目の他の部分から分離されたら、35 mmのペトリ皿にPBSを入れ、鉗子を使用して、粗いつや消しの面を上にして底にフィルターを正方形に配置します。フィルターに折り目が付くと、網膜を動かすための基材としてのフィルターの使用が妨げられる場合がありますので、ご注意ください。
  15. トランスファーピペットで網膜を優しく吸引し、慎重に35mmのディッシュに移します。ブラシで網膜を操作して、網膜の内面が直立し、組織がフィルター正方形の真上にあることを確認します。
  16. トランスファーピペットで皿からPBSをゆっくりと吸引し、網膜をフィルター上に下げます。必要に応じて、網膜がフィルターに落ち着くまで続行する前に、組織を再調整するために一時停止します。
    注:急速な誤嚥は、網膜の突然の横方向の動きを引き起こし、損傷や組織の喪失を引き起こす可能性があります。網膜全体は、損傷を避けるために正方形に載っている必要があります。ただし、網膜が問題のある位置に落ち着いた場合は、網膜が再懸濁されるまでPBSを皿に戻して、取り付けを再試行できます。
  17. 網膜がフィルターに落ち着いたら、ブラシを使用して、折りたたまれた可能性のある末梢網膜を広げます。網膜がフィルターから動きにくくなるようにPBSのレベルを慎重にバランスを取りながら、サンプルが乾燥しないように十分な量が残っていることを確認し、ブラシが内側の網膜を傷つけることなくスムーズに動くようにします。
  18. もう一度、網膜に破片がないか調べます。損傷を避けるために、トランスファーピペットを使用して直接取り扱わずに網膜を清掃し、組織の約1cm上から網膜にPBSを滴下します。これにより、残っている破片が洗い流されるはずですが、皿にPBSを追加しすぎると、網膜が浮き上がる可能性があります。これが発生した場合は、再度吸引を行い、組織を再マウントします。
    注:「偽」サンプルは、他の場所で説明されているように、固定、ブロッキング/透過化、および抗体染色のために網膜を24ウェルプレートに移すことによって生成することができる21。これらの偽のコントロールは、隔離中に発生する可能性のある網膜の機械的損傷のトラブルシューティングに役立ちます。

3. 培地への移し替えと維持管理

  1. バイオセーフティキャビネットに輸送するために35mmディッシュの蓋を閉め、レディッシュを水平に保ち、フィルターから網膜が外れないようにします。これが発生した場合は、上記のように再マウントします。
  2. 網膜を含む閉じた35mmディッシュをバイオセーフティキャビネットに入れ、消毒または手袋を交換する前に、キャビネット内の機器や表面に触れないように注意してください。
  3. 手袋をエタノールで除染および/または交換し、外植片培地をあらかじめ充填した6ウェルプレートをインキュベーターからバイオセーフティキャビネットに移動します。手順1.1で配置したツールを使用して、バイオセーフティキャビネット内で手順3.4と3.5を実行します。
  4. 網膜が入った35mm皿の蓋を外し、角度のついた鉗子を使用して、網膜に直接触れないようにフィルターを正方形に慎重に持ち上げます。6ウェルプレートの蓋を取り外し、フィルターを適切なウェルのインサートの中央に置き、ゆっくりとメディアに下げます。このステップ中に網膜がフィルターから外れ、気液界面のすぐ下に浮かびます。
  5. 網膜とフィルターが分離したら、フィルターをゆっくりと網膜から離し、メディアから取り除きます。1 mLピペットを使用して、インサートから500 μLの培地を取り出し、インサートの床と空気と液体の界面の間に網膜を閉じ込めて網膜が平らになるようにします。
  6. プレートの蓋を元に戻し、網膜をウェルの中心近くに保つように注意しながら、5%CO2で37°Cのインキュベーターに戻します。1枚のプレートに最大6枚の網膜を収納できます。
    注:外植片を24時間以内で保管する場合は、実験が終了するまでインキュベーターに放置できます。長期間保存する場合は、 in vitro で1日後とその後は交互に50%の培地交換を行うことをお勧めします。

4. 免疫染色のための固定(オプション)

  1. 免疫染色を行う場合は、以下の手順で固定してください。免疫染色は、フラットマウント網膜21について以前に詳述されたパラメータを用いて行うことができるが、外植網膜の固定には特定の考慮が必要である。
  2. 外植片や培地を入れた細胞培養インサートを6ウェル培養プレートから取り出し、インサートがわずかに多孔質で、この下層に少量の固定剤が通過するため、固定後に適切に廃棄できる非多孔質表面(培養プレートのプラスチック蓋など)に置きます。
  3. インサートから培地を静かに取り出し、それぞれに4%パラホルムアルデヒド(PFA)を1 mL加えます。網膜をドラフトで15分間固定し、PFAを除去して施設の方針に従って廃棄します。
    注意:パラホルムアルデヒドは危険であり、発がん性物質として知られているホルムアルデヒドの前駆体です。注意を払い、適切な予防策を講じてドラフトで固定してください。
  4. 網膜をPBSで3回(各5分間)洗浄してPFAを除去し、次に改良されたトランスファーピペットを使用してPBS中の網膜を24ウェルプレート内の個々のウェルに移し、他の場所で説明したようにブロッキング、透過化、および免疫染色を行います21。PFAで汚染されたプラスチック(ピペットチップ、インサート、および固定中に使用される非多孔質表面)は、施設の方針に従って廃棄してください。
    注:トランスファーピペットは、固定および染色された網膜をスライドに移し、取り付けおよびイメージングするために保持することができます。PFAと直接接触するべきではありませんでしたが、生組織と固定組織の取り扱いには異なるトランスファーピペットを使用することをお勧めします。

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結果

巨視的なスケールでは、外植された網膜は、1日と3日の両方の時点で基本的に変化しませんが、後者になると比較的壊れやすくなり、固定やその他の実験的エンドポイントの前に慎重な取り扱いが必要になります。網膜は比較的平らで、折り畳みがなく(これにより酸素と栄養素の拡散が局所的に妨げられる可能性があります)、気液界面と細胞培養インサートの間の培地に懸濁する必要があります。3日目までに、懸濁した組織の下のインサートの底にかすかな縞が形成されることがあります。明視野位相差顕微鏡による検査では、特に24時間から72時間の時点で、細胞の破片、おそらく変性光受容体の外側の部分が適度に排出されていることが示唆されています。これは、光受容体の脆弱性と、網膜単離中に大部分が失われるRPE基質への依存性を考えると、驚くべきことではありません。ただし、メディア自体が曇っているように見える場合は、微生物汚染の可能性を調査する必要があります。最初の単離プロセスで網膜をバイオセーフティキャビネットの外側で扱ったにもかかわらず、どのサンプルでも微生物汚染を検出することができず、滅菌バッファーの使用、ペニシリン(100 U/mL)とストレプトマイシン(100 μg/mL)の培養...

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ディスカッション

レチナール外植片などの器官型培養32のアプローチは、細胞培養の実験的柔軟性と迅速なターンアラウンドタイムを利用しながら、in vivo研究のin situコンテキストの多くを保持し、細胞タイプ間の複雑な相互作用を調査するための強力な手段となっています。このプロトコルは、目に関する豊富な経験があり、固定網膜の操作に慣れているが新しい網膜ではない研究者のためのエントリーポイントとして提示します。そのため、私たちは、分離と取り扱いに関連する技術的な課題とばらつきを減らすことに注力してきましたが、これは私たちの経験から、一貫したサンプルを確実に生成するための大きな障壁であることが明らかになりました。しかし、眼は構造と組織で構成される複雑な器官であり、その構造と組織の性質は機能的にほぼ同じであり、マウスの眼のコンパクトな性質は、損傷なしに網膜を抽出するという課題をさらに悪化させます。したがって、単離中に網膜への過剰な構造的または代謝的損傷を回避し、高品質の組織を確実に得るためには、ある程度の柔軟性...

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開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

M.A.M. は、NIH/NEI R01EY035312、Glaucoma Research Foundation Catalyst for a Cure Award、Melza M. and Frank Theodore Barr Foundation、Robert M. Sinskey, MD, Foundation、Ruettgers Family Charitable Foundation、B.L. Manger Foundationの支援を受けました。P.F.C.はNIH/NEI 2T32EY007145によってサポートされました。この作業は、NIH Core Grant for Vision Research P30 EY003176によっても実現されました。 図 1 は Biorender で生成したものです。著者らは、原稿に対するフィードバックを提供してくださったNasir Uddin博士と、支援とサポートを提供してくださったQiurong Zhu博士に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
#11 メスの刃Bard-Parker3,71,311
1 mL ピペット ('Pipetman P1000')GilsonF144059M
100 mm ペトリ皿Falcon351029
16% パラホルムアルデヒドTed Pella Inc18,505固定用 4% に希釈
24 ウェルプレートFalcon353047固定、ブロッキング、抗体インキュベーション
35 mm ペトリ皿Falcon351008
6 ウェル プレートおよびインサート キットGreiner bio-one657641
Alexa Fluor 488-Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 711-545-1521:800 希釈
Alexa Fluor 594 ロバ抗ラット IgG (H+L) 高度に交差吸着されたInvitrogenA-212091:800 希釈
Alexa Fluor 594-F(ab')2 ロバ抗マウス IgG (H+L) ジャクソン免疫研究所 715-586-1501:800 希釈
Alexa Fluor 647-ロバ抗モルモット IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 706-605-1481:800 希釈
Alexa Fluor 647-F(ab')2 ロバ抗チキン IgY (IgG) (H+L) ジャクソン免疫研究所 703-606-1551:800希釈
付き鉗子('5/45')FST / Dumont11251-35
抗Brn3a抗体(マウス)ChemiconMAB15851:200希釈抗
CD206抗体(ラット)BioradMCA22351:200希釈
GFAP抗体(ニワトリ)Abcamab46741:1000希釈抗
Iba1抗体(ウサギ)富士フイルム和光ピュアケミカル株式会社019-197411:500希釈抗
Tmem119抗体(モルモット)シナプスシステム400 0041:500希釈
B-27、50xGibco(サーモフィッシャー)17504044
鈍い湾曲鉗子('Extra Fine Graefe)FST11152-10
シ血清アルブミンマアルドリッチA9647ブロッキングおよび抗体インキュベーションに 1% w/v を使用
キット (0.2 & micro;m aPESメンブレン、150 mLボトルトップフィルター) フィッシャーサイエンティフィFB12566508
ファインブラシ、サイズ 3/0プリンストン アート & ブラシ カンパニー06435-1030
GlutaMaxGibco (サーモフィッシャー)35050061
ラボワイプ (Kim ワイプ) KIMTECH34155
N-2、100xGibco (Thermofisher)17502048
Neurobasal-A 培地、フェノールレッドGibco (Thermofisher) を除いたもの (Thermofisher)12349015
ノーマル ロバ血清Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 017-000-121ブロッキングおよび抗体インキュベーションに10%で使用
ニシリン-ストレプトマイシンGibco(Thermofisher)15140122
ペットチップ、1000&マイクロ;LTipOne1126-7810
スプリングハサミ ('Cohan-Vannas')FST15000-11
滅菌水 ('Dnase, Rnase free')Invitrogen10977-015
滅菌ろ過 PBSGibco10010-023
ストレート鉗子 ('mini')FST / Dumont11200-14
トランスファーピペット、5.8 mLフィッシャーサイエンティフィ13-711-9AMMD
Triton X-100サーモサイエンティフィックケミカルズA16046。APブロッキングおよび抗体インキュベーションに0.5%で使用
角度抗ズウシグ フィルターック ペピック

参考文献

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