長期にわたる片側性尿管閉塞の回復後の長期的な構造的および機能的転帰を評価するためのマウスモデル

Summary

この論文では、研究者がマウスで可逆的な片側性尿管閉塞を実施できるようにするための詳細な手順を提供します 標準化されたモデルを使用して、 長期の尿管閉塞の逆転後の長期的な構造的および機能的転帰の分析を可能にします。

Abstract

尿路閉塞(UTO)患者の臨床管理には、閉塞の原因を逆転させるための早期介入が必要ですが、それにもかかわらず、UTOが長期にわたる患者は、慢性腎臓病(CKD)および再発性急性腎障害(AKI)のリスクが高くなります。しかし、閉塞の早期回復とCKDの進行を遅らせるためのジェネリック療法以外に、UTOの回復後に長期的な腎転帰を大幅に改善した治療法はありません。これに対処するために、多くの研究所が可逆的なUUO(R-UUO)のモデルを開発しましたが、これらは技術的に困難であり、広く採用されていません。また、R-UUOのマウスモデルは、マウス遺伝学の力を利用して疾患の病態生理学を研究できる点で魅力的ですが、閉塞が>3日間続くと不可逆的なUUOを引き起こすことが多いため、特に困難でした。さらに、これらのモデルの性質上、尿管閉塞を逆転させることの長期的な機能的転帰を評価した研究はほとんどありません。これに対処するために、私たちは最近、遅延対側腎摘出術を伴うR-UUOのマウスモデルを開発しました。これにより、長期のUTOを逆転させることが長期的な腎の構造的および機能的転帰に対する長期的な影響を分析できます。これらの研究は、逆転から3か月後にほぼ完全な組織学的回復にもかかわらず、腎機能の恒久的な低下と尿濃縮能力の顕著で持続的な欠陥があったことを示しています。このモデルでは、3つの主要な生存手術が必要ですが、閉塞の期間を調整することにより、さまざまなマウス系統で再現できる、堅牢で再現性のある腎機能の低下をもたらします。この記事では、これらの手術の実施、さまざまなマウス系統で使用するための条件の最適化、腎機能転帰の評価、および腎組織の採取についての詳細な手順を説明します。

Introduction

尿路閉塞(UTO)は片側性であり、多くの場合無症候性であり、慢性閉塞性尿路障害¹を遅発するか、腎疝痛および/または血尿を急性に呈する可能性があります。急性腎盂腎炎または腎後急性腎障害(AKI)²。UTOの管理の鍵は、障害物の早期反転²です。しかし、慢性腎臓病(CKD)の進行を遅らせるための効果的な回復とジェネリック療法の使用にもかかわらず、罹患した患者は進行性CKDと高血圧のリスクが高いままです^3,4。さらに、長期の尿濃縮能力 (UCC) が損なわれることが多く⁵、これにより、脱水症や再発性 AKI にかかりやすくなり、UTO 後の腎機能の進行性低下が加速する可能性があります。

この治療アプローチがUTO患者の長期転帰を改善するためのアプローチを特定できなかったことの一部は、UTOの病理生物学を探求するために不可逆的な片側尿管閉塞(UUO)モデルの使用に依存していたことに起因しています。しかし、これらのモデルは、患者が診断後すぐに逆転する臨床状況を再現するものではなく、閉塞が逆転した後の長期的な修復を改善するために使用できるメカニズムや治療アプローチを探求するために使用することはできません。これに対処するために可逆UUO(R-UUO)モデルが開発されましたが、これらは不可逆UUOモデルよりも技術的に困難であり、さまざまな研究所で再現するのがより困難であり、その結果、科学界ではそれほど広く採用されていませんでした。マウスモデルは、マウス遺伝学の力を利用して疾患の病態生理学を研究するために使用できるため魅力的ですが、閉塞が^3日以上続くと不可逆的なUUOにつながることが多いため、最適化が特に困難でした6。これに対処するために、複数の手術、2日ごとに尿管に沿ってクランプを順次配置するなど、さまざまなアプローチが展開されています^6,7。UUOとそれに続く膀胱再移植8,9,10,11;そして尿管12,13,14を塞ぐために非損傷のclを使用しますampsそして管。ラットおよびマウスを用いた長期転帰研究では、閉塞の回復後に腎機能の改善、線維化の減少、および/または糸球体損傷が示されていますが、UUOが^2日以上続く場合、部分的な回復のみが示されています6,7,8,9,12,14,15,16,17,18,19 .さらに、腎髄質(RM)は最近までUTO^20,21によって引き起こされる損傷を特に受けやすいですが、RMの構造と機能に対する長期のR-UUOの影響が研究された長期的なげっ歯類の研究はありませんでした。UCC と血圧を上昇させることなく塩分負荷を排泄する能力 (いわゆる圧力性ナトリウム利尿反応) は、RM ^22,23,24 の解剖学的完全性の維持に依存しているため、UTO の逆転後の RM の不完全な修復は、患者が UTO の逆転後に再発性 AKI と高血圧に対する感受性が高まった理由を説明する可能性があるため、これは重要です。しかし、これを評価するために必要な技術の多くは、複数回の手術(6日間の閉塞に対する5回の大手術^6,7)を必要とし、教えることが難しい外科的専門知識を必要とする(例えば、膀胱への尿管の外科的再移植^8,9,10,11))、閉塞は片側性であるため、研究者が閉塞の逆転後の腎機能の変化を評価することは困難になります。

これに対処するために、私たちは、実行と指導が比較的簡単で、他の技術よりも限られた数の手術(5〜7日間の閉塞に対して2回の手術)を必要とし、侵襲的および/または高価な分割腎機能研究を必要とせずに腎機能回復の分析を可能にするR-UUOのマウスモデルを開発しました²⁵.このために、マウスは3つの主要な手術を受けます:1)近位左尿管に非外傷性血管クランプを配置します。2)マウスの緊張に応じて、5〜7日後に血管クランプを取り外します。3) 腎機能を評価するために 10 日後に対側腎臓を切除します。マウスの約20〜40%は腎摘出術後2〜3日以内に死亡しており、UUOがすべてのマウスで逆転するわけではないことを示しています。生存マウスの長期追跡調査では、R-UUOの3ヵ月後に腎髄質(RM)がほぼ完全に組織学的に回復したにもかかわらず、経皮糸球体濾過率(tGFR)²⁶によって測定される腎機能の低下があります。さらに、水分制限後の尿中浸透圧を測定することによって決定されるUCCの顕著な減少があり、RM機能に永続的な欠陥があることを示唆しています。時間経過研究によると、RUUO後28日目から56日目にかけてtGFRに改善が見られる一方で、これは56日目から84日目にかけて安定することがわかっています。対照的に、R-UUO²⁵ の 28 日目から 84 日目までの間に UCC に改善は見られません。細胞系譜および免疫組織化学研究によって検証された単離されたRMのscRNA-Seqを使用して、R-UUO後にRM次元を回復させる強力な再生応答を特定しましたが、RMのすべての主要な細胞コンパートメントは、R-UUO後の機能回復に影響を与える可能性のある細胞数と遺伝子シグネチャーに永続的な変化を示しました。これには、R-UUOの84日後のヘンレ細胞集団のRM収集管およびループにおける持続的な炎症誘発性反応が含まれ、AKIおよびUUO後の修復に失敗した近位尿細管上皮細胞の炎症および老化の特徴と同様であった27,28,29,30。同様の変化は、再発性腎結石症の患者からのRM収集ダクトでも見られました³¹、ヒトとマウスの両方でRM損傷に対する共通の損傷反応があることを示唆しています。この記事では、これらの手術の実施方法、さまざまなマウス系統で使用するための条件の最適化方法、尿管が反転後も閉塞しているかどうかを判断する方法、主要な機能的結果を評価する方法、腎髄質構造を評価するための腎組織採取方法について詳しく説明します。

Protocol

ここでは、長期研究に使用される4段階のプロトコルについて説明します(図1)。この原稿の最後に述べたように、研究者はこれらのうち3つ(セクション1、2、および4)のみを実行するか、長期的な結果の研究に興味がある場合は4つすべてを実行するかを選択できます。この原稿のすべてのマウス実験は、ヴァンダービルト研究所の動物管理および使用委員会によって承認されており、動物使用ガイドラインに準拠しています。

1. 尿管クランプの装着 (10 - 15 min/mouse)

注:周囲の結合組織なしでは尿管を直接見ることができないため、尿管の位置を特定するには、マウスの腎臓の解剖学の知識に頼ってください。尿管は、腎臓が露出すると肺門組織の後面下部に沿って走っています(図2)。血管クランプの選択は重要です。これらは高価になる可能性がありますが、洗浄、オートクレーブ、および複数回再利用できます。これらのクランプは、少なくとも100回は問題なく再利用できます。

1. 手術前にすべての手術器具をオートクレーブで121°Cで30分間オートクレーブします。複数のマウスで手術を行う場合は、使用中に器具から血液や破片を取り除き、ホットビーズ滅菌器を使用して10〜15秒間滅菌します。機器を再度使用する前に、機器を冷ましてください。
2. マウスの重量を量ります。
3. 腹腔内注射により、5-10 mg/kg キシラジンと 90-120 mg/kg ケタミンを使用してマウスに麻酔をかけます ( 材料の表を参照)。通常、この処理が反映されるまでに 3 分から 5 分かかります。
4. キシラジンとは異なり、これは鎮痛効果がないため、イソフルランなどの別の麻酔薬を使用する場合は、術前鎮痛を投与します。.
5. 手術部位を腰から胸郭まで、そして側面の周りを、髪の毛が切開部位を汚染しないように十分な境界線で剃ります。手術が行われる場所ではなく、準備エリアで行ってください。
6. 加熱された手術野を滅菌手術用ドレープで覆います。これは、抜け毛が手術野に入るのを防ぎ、滅菌器具を置くための領域を提供するのに役立ちます。
7. 眼科用潤滑軟膏を目に塗ります。.
8. ベタジンを染み込ませたガーゼを使用して無菌製剤を塗布する:部位の中心から周辺に向かって3〜4回こすり洗いし、毎回アルコール綿棒で1回拭きます。切開する前に、手術野からすべてのベタジンを取り除きます。
9. ハサミと鉗子を使用して、皮膚と皮下層を通る正中線に1.5cmの縦背側切開を行います。
10. 腎臓の上の左脇腹の筋肉と筋膜を小さく切開し、左腎臓を外側に押し出します。
11. 尿管があるべき場所の周りの下部極脂肪と結合組織の一部を注意深く解剖します。周囲の結合組織がなければ、尿管を直接見ることはできません。次に、尿管とその周囲の結合組織を、腎静脈と動脈を含む腎椎弓根から分離して、腎椎弓根が尿管クランプに含まれないようにします(図2)。
12. クランプアプライヤーを使用して開き、骨盤の真下の尿管に置きます。血管クランプのマーキングを使用して、各マウスの尿管に同じ圧力で配置されていることを確認します(図3)。適用しないで、clを取り外してくださいamp 尿管を損傷する可能性があるため、再配置します。
13. クランプを配置したら、生理食塩水に浸した滅菌綿棒を使用して、クランプで腎臓を後腹膜腔にそっと押し戻します。
14. 吸収性縫合糸を使用して筋肉層を閉じます。
15. スキンクリップを使用してスキンレイヤーを閉じます。
16. 薬物のセクションで概説されているように、ブプレノルフィン3.25 mg / kg鎮痛剤を投与し、0.5 mLの滅菌生理食塩水を皮下に投与してマウスに水分を補給します。.
17. マウスを加熱したハードパッドの手術野に置いたままにするか、マウスが目を覚ますまでケージの半分の下に温めた等温パッドを入れて自宅のケージに移します。
18. マウスを動物室に戻します。
19. マウスを注意深く監視し、痛みや不快感に対してブプレノルフィンを追加投与します 48〜72時間。マウスが追加の鎮痛薬を必要としていることを示す痛みや苦痛の臨床徴候には、うつ病やその他の行動の変化、異常な外観、または立毛、猫背の姿勢、身だしなみや食事の欠如、不動などの姿勢が含まれます。

2. 尿管クランプの取り外し(10〜15分/マウス)

1. クランプ配置手順のステップ1.1-1.10に従い、元の皮膚と筋肉の切開を使用してクランプの取り外しを開始します。手術部位を清掃する前に、創傷クリップを取り外してください。髪の毛が再成長していないため、通常は再度剃る必要はありません。
2. 組織の癒着が発達しているため、鉗子を使用して、最初に腎臓を外部に出すことなく、後腹膜腔にクランプを慎重に配置します。クランプアプライヤーを使用してクランプを静かに開き、鉗子を使用してクランプヘッドの周囲から組織を下方向に引っ張ってクランプを取り外します。
3. 次に、腎盂を視覚化して閉塞を判断できるように、腎臓を外部化します。腎盂は腫れているはずで、水腎症を示しています。
4. 腎臓を検査したら、生理食塩水に浸した滅菌綿棒を使用して、腎臓を後腹膜腔にそっと押し戻します。
5. 上記の手順 1.13 から 1.18 に従います。

3. 対側腎摘出術(10〜15分/マウス)

1. 毛が生えている場合はその部分を剃ります。
2. 麻酔には1〜5%のイソフルラン/空気混合物を使用して、以前の麻酔イベントがあるために回復を容易にします。手術部位を清掃する前に、創傷クリップを取り外してください。
3. 術前にブプレノルフィン鎮痛剤を投与します( 材料の表を参照)。.
4. 手順1.1〜1.9に従って、元の皮膚切開を使用して開始します。
5. 腎臓の上の右脇腹の筋肉と筋膜を小さく切開し、右腎臓を外側に押し出します。
6. 滑らかで湾曲した鉗子で腎臓を優しく保持し、周囲の組織から解放された腎臓の上部と下部の極を慎重に解剖します。
   注:上極の周りの組織には副腎が含まれており、それ自体の血液供給を運び、腎臓から引き抜くことができますが、明らかにマウスから取り除くべきではありません( 図2を参照)。
7. 腎臓を周囲の組織から解放した後、二重の外科的結び目を使用して、4-0シルク縫合糸を腎血管と尿管の周りに完全に結びます。~30秒間放置すると、腎臓は暗くなります。滑らかで湾曲した鉗子で腎臓を保持し、湾曲したはさみで結び目から遠位に切って腎臓を取り除きます。
8. 生理食塩水を染み込ませた滅菌綿棒を使用して、残りの腎椎弓根を後腹膜腔にそっと押し戻します。.
9. 上記の手順 1.13 から 1.18 に従います。

4.ティッシュコレクション

1. 5% イソフルラン/空気混合物で麻酔し、終末処置の前に安定した外科的麻酔面を実現します。
2. 腹腔を開けて左腎臓を露出させます
3. 腎臓を検査して、腎盂の腫れを確認します(ステップ2.3を参照)。
4. 腎盂がまだ腫れているように見える場合は、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に1分の5000の希釈メチレンブルーを0.5mL含むシリンジに接続された小さなゲージのバタフライ針を挿入します。尿管が特許を取得している場合、青い溶液は腎盂から膀胱に移動するときに見えます。そうでない場合、腎盂は青い溶液で腫れ、膀胱には現れません。
5. 灌流するには、腎臓を固定し、胸腔を開き、心臓を露出させます。
   1. 心臓がまだ鼓動している間に、23〜25Gのバタフライ針を左心室に挿入し、通常の生理食塩水の注入を開始し、右心房または心室を切断して血液量を生理食塩水に置き換えます。
   2. 約1分後、腎臓が白くなっていることを確認します。生理食塩水の注入をさらに1分間続けるか、10%ホルマリン溶液の注入とさらに1〜2分間交換して組織を固定します。
   3. この時点で、マウスは死んでいます。ティッシュを収穫します。RNAまたはタンパク質研究のために組織を採取する場合は、灌流固定しないでください。
6. 動物から腎臓を取り出したら(灌流固定されているかどうかに関係なく)、かみそりの刃を使用して、腎臓の中心から厚さ2〜3mmの矢状切片を最大3つ切り取ります(図4)。これにより、腎髄質と皮質を含む代表的な切片が得られ、組織型、タンパク質、またはRNAアッセイに十分な組織が提供されます。
7. 研究要件に従ってサンプルの固定/凍結に進みます。

Results

長期的な研究では、一般的に、意識のあるマウスで連続的な血中尿素窒素 (BUN) と経皮糸球体濾過率 (tGFR) を測定することにより腎機能を評価します (これを説明する以前に公開された記事²⁶) に加えて、尿濃縮能力 (UCC) を測定することにより、18 時間の水分欠乏後に収集されたスポット尿サンプルから尿浸透圧を評価します。私たちは常にBUN研究を行っていますが、これらは腎摘出術後の早い時点での損傷の重症度を評価するのに最も役立ちます(ディスカッションを参照)。しかし、長期的な研究では、BUN(および血清クレアチニン)の測定は、腎機能の微妙な変化を検出するのに十分な感度ではありません。これらは通常、腎摘出術後の異なる時点で行われます(図1A)。UCC の分析は、腎髄質機能の簡単な測定を提供し、通常、尿中浸透圧値は、同じ時点での腎摘出術対照マウスよりも著しく低いことを示しています。図1B-Eは、R-U...

Discussion

マウスの長期UUOの逆転を研究するために使用されてきたいくつかのアプローチと比較^{6,7,8,9,10,11,12,13,14}、ここで説明するプロトコルは比較的簡単で、高度な事前の外科的専門知識を必要としません。これは、比較的少数の生存手術 (最大 3 回) を含み、長期的な機能的転帰を評価するために使用できます。この手法を成功させ、再現性を高めるためには、いくつかの重要なス...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9%塩化ナトリウム	VUMC薬局	倍数
吸収性縫合糸 Vicryl 6-0	メッド・ベット・インターナショナル - ETHICON	J492G型
アルコール綿棒	BDブランドイソプロピルアルコール綿棒	BD 326895
ベタジン溶液	ハンナ・ファーマシューティカル・サプライ株式会社	67618015017
鉗子を適用するクランプ:S&T CAF-4	ファインサイエンスツール	00071-14
デルタフェーズ等温パッド	ブレインツリーサイエンティフィック	DPIPの
電動トリマー	オスター	倍数
ENCORE ラテックステクスチャード手術用手袋	アンセル	5785003
エティカ XR ブプロフェノール (CIII) VI 1.3 mg/mL	パターソン獣医 - エティカ	86084010030
EZクリップ 9mm	ブレインツリーサイエンティフィック	EZC-CSの	または7 mm
EZクリップアプライヤー9mm	ブレインツリーサイエンティフィック	EZC-APL	または7 mm
EZクリップリムーバー9mm	ブレインツリーサイエンティフィック	EZC-RMV	または7 mm
ガーゼスポンジ2&急性;2	フィッシャーサイエンティフィック	22-362178
グレーフの角度付きまたは湾曲した鋸歯状の先端	ファインサイエンスツール	11049-10
Graefe ストレート鋸歯状チップ	ファインサイエンスツール	11050-10
加熱されたハードパッド15&急性;24	ブレインツリーサイエンティフィック	HHP2
加熱式ハードパッドポンプコネクタ	ブレインツリーサイエンティフィック	HHP Gaymarコネクタ
ホットビーズ滅菌器	ファインサイエンスツール	18000-45
インスリンシリンジ 0.5 mL 29 g	エクセルインターナショナル	26028
イソフルラン	パターソン獣医 - ピベタル	78949580
ケタミン 100 mg/mL	VUMC薬局
非吸収性縫合糸 シルク 4-0	メッド・ベット・インターナショナル - ETHICON	683グラム
オルセン・ヘガー ニードルホルダー:縫合カッター付き	ファインサイエンスツール	12002-12
Optixcare アイ ルーブ 20 g	メッド・ベット・インターナショナル	PHOPTIXCAREさん
はさみ-鈍いレクサー-赤ちゃん	ファインサイエンスツール	14078-10
はさみ-鋭い湾曲	ファインサイエンスツール	14005-12
滅菌綿先端アプリケーター	ピューリタン	25806 2WC
滅菌ガーゼスポンジ4&急性;4	フィッシャーサイエンティフィック	22-415-469
滅菌外科用使い捨てドレープ 18 & 急性;26	メッド・ベット・インターナショナル	20001
滅菌器具ポーチ 5 & 急性;10	フィッシャーサイエンティフィック	01-812-54
T/ポンプ加熱冷却ポンプ	ブレインツリーサイエンティフィック	TP-700
テイラー鉗子は湾曲した、滑らかな	ファインサイエンスツール	11017-17
血管クランプ:S&T 5〜15gプレス	ファインサイエンスツール	00396-01
キシラジン 100 mg/mL	パターソン獣医 - クロノス	CR04305