電気生理学プラットフォームを用いた網膜波の高密度多電極アレイ記録

Summary

高密度多電極アレイ(HD-MEA)は、神経回路の発達に重要な役割を果たす自発的な網膜波の研究に使用されます。このプロトコルでは、マウス網膜組織を調製し、電気生理学プラットフォーム上でHD-MEAを使用して電気生理学的記録を行う手順を概説しています。

Abstract

自発的な網膜波は、発達中の網膜ネットワーク活動の特徴であり、軸索の微細化、血管系の透過性、および神経回路の全体的な成熟に影響を与えることにより、視覚系の形成に重要な役割を果たします。これらの波は、網膜神経節細胞(RGC)活性の大規模な集団の電気生理学的記録を可能にする多電極アレイ(MEA)を使用した ex vivo 網膜調製物で一般的に研究されています。MEAベースの電気生理学は、ハイスループットデータを迅速に収集するための使いやすさにより、強力なツールとなり、さまざまな実験条件での網膜活性の研究に理想的です。

このプロトコルでは、電気生理学プラットフォーム上で高密度MEA(HD-MEA)を使用して電気生理学的データを取得するための網膜組織を準備するための重要なステップを概説します。このプロセスは、生理学的条件下で新生児動物から無傷の網膜を慎重に分離することから始まります。準備が整うと、網膜は、少なくとも1,000のRGCから同時に細胞外記録を行うことができる26,400の電極のグリッドで構成されるHD-MEAチップに慎重に取り付けられます。最終的に、この方法論的アプローチは、網膜の発達、疾患、および潜在的には種間比較研究の研究に貴重なアプリケーションを提供し、神経科学と視覚研究の広範な進歩に貢献します。

Introduction

自発的な網膜波は、視力が始まる前に発達中の網膜で観察される相関活動の周期的なバーストです。マウスでは、網膜波を開始および伝播する回路は、発生中に急速に変化し、胚から始まり、開眼時(生後14^日目)で終了します1。網膜回路が発達するにつれて、網膜波の時空間特性は劇的に変化します^2,3。いくつかの研究は、これらの特定の時空間特性が視覚系の発達を指示することを裏付けています:目の間の非同期活動は眼特異的な分離を指示^し4、波の面積サイズは両眼脳領域^5,6の網膜軸索の微細化を指示し、波の伝播方向は上丘の方向選択性回路を指示するために関与しています 3.神経回路を超えて、網膜波は血液血管系の透過性の発達に関与しています⁷。さらに、ステージIIの網膜波は、受容野野の伸長を制御し、網膜神経節細胞(RGC^)でそれを安定させることが発見されました8。重要なことに、発達中の異常な網膜波は、さまざまな神経発達障害の基礎であ....

Protocol

このプロトコルは、Maxwell Biosystems HD-MEAプラットフォームを使用して網膜波のMEA記録のために、新生児マウスから網膜組織を分離および調製する手順を概説しています。この手順は、生理学的条件を維持するように設計されており、網膜組織が構造的に無傷で損傷を受けず、最適な電極接触のために適切に準備されていることを保証します。これらの実験は、Vanderbilt Animal Care and Use Programによって、プロトコル番号M2200056-00で承認されました。マウス(1〜2週齢、男女とも)を12時間の昼夜サイクルビバリウムに収容し、定期的な食事を与えました。

1. 網膜組織の調製

1. 網膜の分離
   注:このプロトコルで使用される材料、機器、および試薬の詳細については、 材料の表 を参照してください( 図1も参照してください)。
   1. ワークスペースを準備する
      1. 人工脳脊髄液(aCSF)を調製する:125 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.25 mM NaH₂PO₄、26 mM NaHCO₃、2 mM CaCl_2....

Results

HD-MEAによる網膜波のハイスループット記録と解析
自発的な網膜波の1時間にわたるHD-MEA記録を行いました(図2)。ニューロン活動のラスタープロットは、網膜波の構造パターンを示しており、各ドットは個々の電極から検出された活動電位を表しています(図2A、下)。電極間のアクティビティを合計すると、1つのトレースになり、1時間の記録における波のタイミングを視覚化しやすくなります(図2A、上)。平均的なニューロン活動を表すヒートマップは、網膜の広い領域でサンプリングできることを示しています(図2B)。波の時空間性状を解析するために、波の発生地点(図2C)、波間間隔(IWI)(図2D

Discussion

ここで説明するプロトコルは、網膜組織を調製し、HD-MEA記録を実行するための再現性のあるハイスループットな方法を提供し、網膜ネットワーク活動を研究するための堅牢な方法を提供します。HD-MEA技術は、特にハイスループットデータのキャプチャにおいて、従来の電気生理学的およびイメージング技術に比べて大きな利点を提供します。HD-MEAは、自発的な網膜波ダイナミクスのミリ秒スケールのリアルタイム記録を提供し、正確な波の開始、伝播、および同期特性評価を可能にします。さらに、HD-MEAは、数千の網膜神経節細胞(RGC)からの同時記録を可能にすることにより、パッチクランプ法を凌駕し、ネットワークアクティビティのビューを提供します。このスケーラビリティと、その使いやすさ、長期にわたる記録安定性により、HD-MEAは開発研究にとって非常に貴重なツールとなっています。このプロトコルは、ラットおよび霊長類の網膜のMEA記録に、いくつかの外挿で適合させることができます。最後に、HD-MEA記録のハイスループットな性質は、その高い電極密度により、薬物による網膜活性の変化の正確なモニタリング.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 mLの使い捨てトランスファーピペット(端がカットオフされた状態)	フィッシャーバーンド	13-711-9CM	は、ペトリ皿間の網膜の移動を支援します。
人工脳脊髄液(aCSF)			、NaCl、KCl、NaH2PO4、NaHCO3、CaCl2、MgCl2、グルコースで構成され、カルボゲンで泡立たれています。
CaCl2	Fisher Chemicals	C79-500	人工脳脊髄液(aCSF)を調製するためカル
ボゲン供給(95% O2、5% CO2)			aCSFを酸素化し、組織の生存率を維持するために使用されます。
カーブブレードメス(#10)	インテグラ	4-110	組織を精密にカットするために使用されます。
解剖顕微鏡(ステレオスコープ)	Zeiss	Stemi 508	網膜組織の可視化と取り扱いに必須です。
グルコース	フィッシャーケミカル	ズBP350-1	人工脳脊髄液(aCSF)を調製するにはインライン
ヒーター	チャネルシステム	TC02aCSF	を32-34°Cに温めます。最適な条件のためのC。
イスマテック灌流システム	イスマテック	ISM4208	酸素化されたaCSFの連続的な流れを維持します。
KCl	Fisher Chemicals	P271-500	人工脳脊髄液(aCSF)の調製に
KH2PO4	Sigma Aldrich	P5504-100g	人工脳脊髄液(aCSF)の調製には
MaxOne Recording Unit	Maxwell Biosystems Maxwell Biosystems	MX1-BRD	MaxOne ChipとSystem
MaxOne System	Maxwell Biosystems	MX1-SYS	MEAベースの電気生理学的制御のためのコアシステム。
3軸マイクロマニピュレーターと交換可能なインサートを備えたMaxOneティッシュホルダー	Maxwell Biosystems	MX1-HLD	MEAチップ上の網膜の正確な配置を保証します。
MEAチップ (MX1-S-CHP, MaxWell Biosystems)	Maxwell Biosystems	MX1-S-CHP	神経活動を記録するための高密度微小電極アレイです。
MgCl2	Fisher Chemicals	M33-500	人工脳脊髄液(aCSF)を調製する
NaCl	Fisher Chemicals	S271-1	人工脳脊髄液(aCSF)を調製する
NaHCO3	>Fisher Chemicals	S233-500	人工脳脊髄液(aCSF)を調製する針
(30 G x ½)	BDバイオサイエンス305106		膜の切開に役立ちます。
新生児動物(P1-P14;マウス)			マウス、ラット、または網膜研究に使用される他の他の生物などのモデル生物。
MaxLab Live ScopeソフトウェアHP		Z4	データ取得と録音の分析に使用されます。
ペトリ皿(35mmまたは60mm)	Pyrex	3483E12	解剖用の作業スペースとして使用されます。
Roboz micro Adson鉗子(RS-5232、長さ4.75インチ、歯数1 x 2、先端0.5mm)	Roboz	RS-5232	微細解剖用の専用鉗子です。
ロボズスプリングハサミ(RS-5671、刃先10mm、先端幅0.15mm、3¾「全長)」	Roboz	RS-5671	デリケートな組織を切断するための精密ハサミ。
片毛ブラシ			デリケートなティッシュを扱うために、片毛に改造された小さな絵筆。
先端の細い2つの鉗子	Roboz	RS-5060	繊細な組織の取り扱いに使用されます。
Whatman濾紙(#1)、小片にカット	GEヘルスケア	1001-042	網膜組織の取り扱いと乾燥に使用されます。