電気生理学プラットフォームを用いた網膜波の高密度多電極アレイ記録

サマリー

高密度多電極アレイ(HD-MEA)は、神経回路の発達に重要な役割を果たす自発的な網膜波の研究に使用されます。このプロトコルでは、マウス網膜組織を調製し、電気生理学プラットフォーム上でHD-MEAを使用して電気生理学的記録を行う手順を概説しています。

要約

自発的な網膜波は、発達中の網膜ネットワーク活動の特徴であり、軸索の微細化、血管系の透過性、および神経回路の全体的な成熟に影響を与えることにより、視覚系の形成に重要な役割を果たします。これらの波は、網膜神経節細胞(RGC)活性の大規模な集団の電気生理学的記録を可能にする多電極アレイ(MEA)を使用した ex vivo 網膜調製物で一般的に研究されています。MEAベースの電気生理学は、ハイスループットデータを迅速に収集するための使いやすさにより、強力なツールとなり、さまざまな実験条件での網膜活性の研究に理想的です。

このプロトコルでは、電気生理学プラットフォーム上で高密度MEA(HD-MEA)を使用して電気生理学的データを取得するための網膜組織を準備するための重要なステップを概説します。このプロセスは、生理学的条件下で新生児動物から無傷の網膜を慎重に分離することから始まります。準備が整うと、網膜は、少なくとも1,000のRGCから同時に細胞外記録を行うことができる26,400の電極のグリッドで構成されるHD-MEAチップに慎重に取り付けられます。最終的に、この方法論的アプローチは、網膜の発達、疾患、および潜在的には種間比較研究の研究に貴重なアプリケーションを提供し、神経科学と視覚研究の広範な進歩に貢献します。

概要

自発的な網膜波は、視力が始まる前に発達中の網膜で観察される相関活動の周期的なバーストです。マウスでは、網膜波を開始および伝播する回路は、発生中に急速に変化し、胚から始まり、開眼時(生後14^日目)で終了します1。網膜回路が発達するにつれて、網膜波の時空間特性は劇的に変化します^2,3。いくつかの研究は、これらの特定の時空間特性が視覚系の発達を指示することを裏付けています:目の間の非同期活動は眼特異的な分離を指示^し4、波の面積サイズは両眼脳領域^5,6の網膜軸索の微細化を指示し、波の伝播方向は上丘の方向選択性回路を指示するために関与しています 3.神経回路を超えて、網膜波は血液血管系の透過性の発達に関与しています⁷。さらに、ステージIIの網膜波は、受容野野の伸長を制御し、網膜神経節細胞(RGC^)でそれを安定させることが発見されました8。重要なことに、発達中の異常な網膜波は、さまざまな神経発達障害の基礎である可能性があり、実際、先天性眼振のマウスモデルでは網膜波が異常です³。初期の視覚系の発達における網膜波の重要な役割と疾患への影響を考えると、あらゆる年齢および動物モデルにおける網膜波の時空間ダイナミクスを記録する必要があります。

網膜波を研究するためのいくつかの方法が登場しました。シングルセル電気生理学^9,10とカルシウムイメージング11,12,13,14,15の両方が、網膜波の回路と機能に関する独創的な発見をもたらしました。ここでは、網膜波¹⁶の初期の研究以来使用され、技術²として改良が続けられている方法である多電極アレイ記録(MEA)に焦点を当てます。MEAは、数百から数千のRGCからの活動電位の細胞外電位の同時記録を可能にし、研究者はカルシウムイメージングと同様に波の開始、伝播、および終了を追跡できます。MEAはRGCからの活動電位を直接記録するため、MEAはカルシウムインジケーターの導入という追加の合併症なしに、さまざまな遺伝的マウスモデルまたは非モデル生物の研究に使用できます。また、組織をMEAで直接培養することもできるため、非常に長い記録時間が可能になります。また、MEAは拡張性も高く、現在の製品では一度に最大6つのアクティブMEAが可能であるため、網膜の迅速な評価や創薬の触媒となる可能性があります。おそらく、MEAの最大の強みは、高いサンプリングレートで多くの細胞をサンプリングできることであり、これにより世界中のラボが豊富なデータセットを迅速に取得できますが、後処理の専門知識が必要です。

このプロトコルの主な目標は、自発的な網膜波を ex vivoで研究するために、シングルウェル高密度MEA(HD-MEA)システムを使用して網膜組織を調製し、電気生理学的記録を実施するための詳細で再現性のあるプロトコルを提供することです。この方法により、ハイスループットで長時間のデータ取得が可能となり、幅広い発生研究や疾患関連研究に適しています。新しい高度なCMOSベースのHD-MEAシステムは、一度に>1,000の電極サイトを可能にし、従来の電気生理学的アプローチに比べていくつかの利点を提供します。高密度の電極アレイ(26,400電極)により、最大1,012個のRGCからの正確な同時細胞外記録が可能になり、微細な空間活動パターンを捉えることができます。シングルウェル設計により、均一な記録条件^{が得られる17}。さらに、このシステムは数時間にわたる長期記録を可能にし、信号の大幅な劣化なしに、さまざまな生理学的および薬理学的条件下で波動ダイナミクスを研究することを可能にする¹⁸。この研究は、プロトコルを提供することにより、神経科学、眼科学、視覚科学の研究者の幅広い聴衆がHD-MEAテクノロジーを利用できるようにすることを目的としています。この方法は、網膜波の研究における重要な前進を表しており、初期の視覚系の発達、疾患メカニズム、および潜在的な治療介入を研究するための新しい道を提供します。

プロトコル

このプロトコルは、Maxwell Biosystems HD-MEAプラットフォームを使用して網膜波のMEA記録のために、新生児マウスから網膜組織を分離および調製する手順を概説しています。この手順は、生理学的条件を維持するように設計されており、網膜組織が構造的に無傷で損傷を受けず、最適な電極接触のために適切に準備されていることを保証します。これらの実験は、Vanderbilt Animal Care and Use Programによって、プロトコル番号M2200056-00で承認されました。マウス(1〜2週齢、男女とも)を12時間の昼夜サイクルビバリウムに収容し、定期的な食事を与えました。

1. 網膜組織の調製

1. 網膜の分離
   注:このプロトコルで使用される材料、機器、および試薬の詳細については、 材料の表 を参照してください( 図1も参照してください)。
   1. ワークスペースを準備する
      1. 人工脳脊髄液(aCSF)を調製する:125 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.25 mM NaH₂PO₄、26 mM NaHCO₃、2 mM CaCl₂、1 mM MgCl₂、10 mM グルコース、カルボゲンで泡立たせた:95% O₂/5% CO₂ (pH 7.4、浸透圧 290 ± 10 mOsm) 5°Cで保存する。 解剖する前に、aCSFを10分間酸素化している間、氷の上に置いてください。
         注:CaCl₂ は、溶液をカルボゲンで10分間泡立てた後、最後に追加する必要があります。
      2. 新鮮で氷のように冷たいaCSFの酸素化を開始します(少なくとも10分間)。
      3. 解剖ツールと顕微鏡をセットアップします。
   2. 施設のガイドラインに従って動物を安楽死させます。
   3. 湾曲したスプリングハサミを使用して目をエヌクリーします-
      1. 産後の子犬はP11-13まで目を閉じており(マウスの場合)、まぶたを慎重に開く必要があるため、マイクロ鉗子でまぶたをつかみ、スプリングハサミで取り除きます。スプリングハサミを使用して慎重に目を取り出し、眼の損傷を避けます。
      2. 視神経を切断し、眼を酸素化されたaCSFに入れます。トランスファーピペットを使用して、ペトリ皿の間で目をそっと動かします。
         注:解剖プロトコルの残りの部分については、10分ごとに酸素化aCSFでリフレッシュしてください。.
   4. 解剖顕微鏡下で、
      1. 鉗子で目を安定させながら、針を使って角膜を小さく切開します。
      2. 強膜の周囲に沿ってそっと引き裂くことにより、角膜を鈍く解剖します。.
      3. 虹彩とレンズを取り外します。網膜が若い動物の水晶体に付着している場合は、鉗子を使用して網膜を穏やかに分離します。
         注:若い動物では、網膜がレンズに付着していることがあります。鉗子を使用して、一方の鉗子を使用してレンズを引っ張り、もう一方の鉗子を網膜の外縁に置いて、レンズを取り外す間、網膜を所定の位置に保持します。
   5. 網膜の向きを合わせます。
      1. 脈絡膜組織を使用して腹側を特定し(配向に関する詳細なプロトコルについては、Sondereker et ^al.19 を参照)、RGC層を上に向けて研究者の方を向いて配置します。
      2. 湾曲したメスを使用して、腹軸から反時計回りに45°の基準カットを作成します。
      3. 細い鉗子を使用して、網膜を網膜色素上皮(RPE)と強膜から穏やかに分離します。
         注:若いマウスでは、RPEは網膜から容易に剥がれます。高齢のマウスでは、RPEは網膜により付着しています。網膜の大部分からRPEを取り除いた後も、RPEが視神経を介して網膜に固定されている場合は、スプリングハサミを使用してその接続を切断します。これにより、視神経近くの網膜組織の損傷を防ぎます。
   6. 新生児の網膜には硝子体がほとんどありませんが、古い網膜にはあります(網膜の縁に沿って茶色のフィラメントとして表示されますが、線維は硝子体液内でも互いに接続しています)。細い鉗子を使用して、RGC層の上にある硝子体組織を切除します。
      注意: この繊維層は、レンズを取り外すと剥がれることがあります。そうでない場合は、できるだけ多くのものを取り除くことが重要です。そうしないと、RGCと電極が適切に接触できなくなります。
   7. メスを使用して、網膜が皿に平らになるように4つのレリーフカットを行います。後で向きを知り、維持するために、メスで腹側象限の2つの角を切り取ります。

2. MEAチップへの網膜の取り付け

1. 網膜の取り付け-
   1. 先端を切り落とした状態で、トランスファーピペットを使用して、ペトリ皿からMEAチップに網膜を静かに移します。チップにウェルの底を覆うのに十分なaCSFがあることを確認してください。
   2. シングルヘアブラシを使用して、網膜を電極の上に配置するように優しく操作し、RGC層を電極に面させます。
   3. 10 μLピペットを使用して、網膜組織周辺の余分なaCSFを静かに取り除きます。チップを斜めに傾けて、余分なaCSFを取り除きます。
      注意: 電極やアンプにピペットチップで触れないでください。aCSFが除去されると、網膜はより平らになります。網膜の一部がそれ自体の下に折りたたまれている場合は、シングルヘアブラシを使用して、目的のリーフレットの下をそっとすくい取り、広げます。リーフレットの一部を広げるときに網膜が動くのを防ぐために、2番目のシングルヘアブラシを使用して、視神経が接続する網膜の中心に穏やかな圧力を加えることができます。
   4. チップを45°の角度で傾け、チップの傾斜部分に溜まっている最後のaCSFを取り除いて、ウェルをできるだけ乾かします。
      注:これにより、網膜と電極の間の接続が増加します。
   5. 濾紙を使用して、網膜の端を軽くたたいて乾かします。MEAチップを記録チャンバーに入れます。
2. 電極接触の強化-
   1. 交換可能なティッシュホルダーインサートを使用して、網膜を電極に優しく押し込み、最適な接触を確保し、信号対雑音比を改善します。
      注意: ティッシュホルダーインサートは、網膜に接触したらすぐに下降を停止する必要があります(接触点に明確な「ウェットスポット」が見えます)。電極ホルダーをさらに下げると、網膜組織を損傷するリスクがあります。ステップ2.1.4から2.2.1にすばやく移行して、網膜が酸素化aCSFなしで留まる期間を最小限に抑えます。この手順は重要であり、できるだけ早く完了する必要があります。チップ上の網膜を平らにするときは速く動くことが重要ですが、網膜が電極と良好に接触するように、解剖からのaCSFの大部分を乾燥させることも重要です。網膜を酸素化するために速すぎると、記録電極とうまく接触できないリスクがあり、遅すぎると網膜細胞が低酸素状態になって死滅するリスクがあります。30〜60秒が良好な接触と健康な網膜につながることがわかりました(つまり、典型的な網膜波を観察します)。
   2. 参照された灌流システムを使用して、2 mL/分の流速でMEAチップに酸素化aCSFを充填し始めます。
      注:電気ノイズが低く、網膜に新鮮なaCSFを提供するため、オープン灌流システムが推奨されます。aCSFを生理学的条件まで温めるために、インライン加熱システムが灌流セットアップに取り付けられていることを確認してください。
   3. 灌流システムのインラインヒーターをオンにして、aCSFを32〜34°Cに温めます。

3. 電気生理学的記録

1. 細胞外記録-
   1. 録音システムのスイッチを入れます。
   2. 取得コンピューターで、最初に [サーバー ] アイコンをダブルクリックし、次に [スコープ ] をダブルクリックして開きます。
   3. Scopeインターフェースの「Initialize」アイコンをクリックし、MEAチップIDを入力して、MEAシステムを使用した細胞外記録を開始します。
   4. スコープインターフェースのオフセットアイコンをクリックして、オフセットを設定します。
   5. ゲインとフィルターの設定を調整して、信号検出を最適化します。デフォルト設定の 512 ゲインと 300 Hz のハイパスを使用します。Sampリングレートを20kHzに設定します。
   6. 適切な録画設定を選択します。サンプリング可能な総アクティブエリアは3.85 x 2.1 mm²です。このソフトウェアでは、ユーザーは電極間隔の設定方法を選択できます。このプロトコルに従うには、記録電極を最大アクティブ領域に均等に広げるデフォルト設定を使用します。これは、網膜のできるだけ多くの部分にサンプリングするためです。これにより、記録電極あたり87.5μmの間隔が空くことになります。
   7. 網膜が記録チャンバーに60分間順応するのを待ちます。
   8. RGCからの自発的な活動記録を開始するには、[ Assay ]タブに移動し、[ Create New Assay ]アイコンを選択します。 ネットワーク アッセイタイプを選択し、適切なファイル名を割り当てて、「 OK 」をクリックし、設定を保存します。 [記録時間 (秒)] パラメーターを調整して、記録に必要な時間を設定します。 「Only Spike 」オプションを有効にしてスパイクデータに焦点を当て、「 Run Assay 」アイコンをクリックして記録セッションを開始します。
      注:10分以上の網膜波の記録には、チャネルごとの完全な生の電気生理学的トレースの代わりに、組み込みのスパイク検出ツールを使用して活動電位のタイムスタンプのみを保存する スパイクのみ の設定を使用することをお勧めします。これは、1,024チャンネルにわたる長時間の録音(>10分)は、技術的に分析が困難なTBサイズのデータファイルになりやすく、研究の進行が大幅に遅くなる可能性があるためです。 スパイク時間 を使用した生データは、網膜波の既知の時空間特性のみを再現することを確認しました:ステージII波については、網膜の大部分を覆う大きな波を観測し、以前の報告と一致する周波数で発生します( 図2を参照)。研究プロジェクトでスパイク波形のより詳細な分析が必要な場合は、生の電気生理学的トレースを記録する必要があることに注意してください。
   9. 進行中の記録を定期的に監視して、データ取得が期待どおりに進行し、システムが適切に機能していることを確認します。

4. 清掃手続き

1. 録音が完了し、データが保存されたら、インラインヒーターのスイッチを切り、次に灌流システムの電源を切ります。
2. ティッシュホルダーインサートを慎重に取り外し、MEAチップを取り出します。チップを最初に70%エタノールですすいで洗浄し、次に脱イオン(DI)水で洗浄します。
3. チューブの目詰まりを防ぐため、灌流システムを単次元水で15分間洗い流します。

結果

HD-MEAによる網膜波のハイスループット記録と解析
自発的な網膜波の1時間にわたるHD-MEA記録を行いました(図2)。ニューロン活動のラスタープロットは、網膜波の構造パターンを示しており、各ドットは個々の電極から検出された活動電位を表しています(図2A、下)。電極間のアクティビティを合計すると、1つのトレースになり、1時間の記録における波のタイミングを視覚化しやすくなります(図2A、上)。平均的なニューロン活動を表すヒートマップは、網膜の広い領域でサンプリングできることを示しています(図2B)。波の時空間性状を解析するために、波の発生地点(図2C)、波間間隔(IWI)(図2D

ディスカッション

ここで説明するプロトコルは、網膜組織を調製し、HD-MEA記録を実行するための再現性のあるハイスループットな方法を提供し、網膜ネットワーク活動を研究するための堅牢な方法を提供します。HD-MEA技術は、特にハイスループットデータのキャプチャにおいて、従来の電気生理学的およびイメージング技術に比べて大きな利点を提供します。HD-MEAは、自発的な網膜波ダイナミクスのミリ秒スケールのリアルタイム記録を提供し、正確な波の開始、伝播、および同期特性評価を可能にします。さらに、HD-MEAは、数千の網膜神経節細胞(RGC)からの同時記録を可能にすることにより、パッチクランプ法を凌駕し、ネットワークアクティビティのビューを提供します。このスケーラビリティと、その使いやすさ、長期にわたる記録安定性により、HD-MEAは開発研究にとって非常に貴重なツールとなっています。このプロトコルは、ラットおよび霊長類の網膜のMEA記録に、いくつかの外挿で適合させることができます。最後に、HD-MEA記録のハイスループットな性質は、その高い電極密度により、薬物による網膜活性の変化の正確なモニタリング...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
3 mLの使い捨てトランスファーピペット(端がカットオフされた状態)	フィッシャーバーンド	13-711-9CM	は、ペトリ皿間の網膜の移動を支援します。
人工脳脊髄液(aCSF)			、NaCl、KCl、NaH2PO4、NaHCO3、CaCl2、MgCl2、グルコースで構成され、カルボゲンで泡立たれています。
CaCl2	Fisher Chemicals	C79-500	人工脳脊髄液(aCSF)を調製するためカル
ボゲン供給(95% O2、5% CO2)			aCSFを酸素化し、組織の生存率を維持するために使用されます。
カーブブレードメス(#10)	インテグラ	4-110	組織を精密にカットするために使用されます。
解剖顕微鏡(ステレオスコープ)	Zeiss	Stemi 508	網膜組織の可視化と取り扱いに必須です。
グルコース	フィッシャーケミカル	ズBP350-1	人工脳脊髄液(aCSF)を調製するにはインライン
ヒーター	チャネルシステム	TC02aCSF	を32-34°Cに温めます。最適な条件のためのC。
イスマテック灌流システム	イスマテック	ISM4208	酸素化されたaCSFの連続的な流れを維持します。
KCl	Fisher Chemicals	P271-500	人工脳脊髄液(aCSF)の調製に
KH2PO4	Sigma Aldrich	P5504-100g	人工脳脊髄液(aCSF)の調製には
MaxOne Recording Unit	Maxwell Biosystems Maxwell Biosystems	MX1-BRD	MaxOne ChipとSystem
MaxOne System	Maxwell Biosystems	MX1-SYS	MEAベースの電気生理学的制御のためのコアシステム。
3軸マイクロマニピュレーターと交換可能なインサートを備えたMaxOneティッシュホルダー	Maxwell Biosystems	MX1-HLD	MEAチップ上の網膜の正確な配置を保証します。
MEAチップ (MX1-S-CHP, MaxWell Biosystems)	Maxwell Biosystems	MX1-S-CHP	神経活動を記録するための高密度微小電極アレイです。
MgCl2	Fisher Chemicals	M33-500	人工脳脊髄液(aCSF)を調製する
NaCl	Fisher Chemicals	S271-1	人工脳脊髄液(aCSF)を調製する
NaHCO3	>Fisher Chemicals	S233-500	人工脳脊髄液(aCSF)を調製する針
(30 G x ½)	BDバイオサイエンス305106		膜の切開に役立ちます。
新生児動物(P1-P14;マウス)			マウス、ラット、または網膜研究に使用される他の他の生物などのモデル生物。
MaxLab Live ScopeソフトウェアHP		Z4	データ取得と録音の分析に使用されます。
ペトリ皿(35mmまたは60mm)	Pyrex	3483E12	解剖用の作業スペースとして使用されます。
Roboz micro Adson鉗子(RS-5232、長さ4.75インチ、歯数1 x 2、先端0.5mm)	Roboz	RS-5232	微細解剖用の専用鉗子です。
ロボズスプリングハサミ(RS-5671、刃先10mm、先端幅0.15mm、3¾「全長)」	Roboz	RS-5671	デリケートな組織を切断するための精密ハサミ。
片毛ブラシ			デリケートなティッシュを扱うために、片毛に改造された小さな絵筆。
先端の細い2つの鉗子	Roboz	RS-5060	繊細な組織の取り扱いに使用されます。
Whatman濾紙(#1)、小片にカット	GEヘルスケア	1001-042	網膜組織の取り扱いと乾燥に使用されます。