エレクトロポレーション閾値を定量化するためのハイスループット対応3次元組織モデル

Summary

このプロトコルは、エレクトロポレーションプロトコルのハイスループット分析のために、3次元組織模倣内のトランスフェクトされた細胞の空間分布を使用して、計算モデリングを使用して可逆的および不可逆的なエレクトロポレーション閾値を定量化します。

Abstract

エレクトロポレーションは、高分子送達や軟部組織アブレーションに電気パルスを利用する有望な技術であり、次世代の予防薬やがんなどの遺伝病の治療などに応用されています。この研究は、特定のエレクトロポレーションプロトコルの可逆的および不可逆的なエレクトロポレーション閾値を定量化するためのハイスループット可能な3D組織培養モデルを示しています。不均一な電場を使用し、トランスフェクトされた細胞の空間分布を分析することにより、1つのサンプル内で可逆的および不可逆的な閾値の両方を特定でき、特に in vivo 翻訳において、エレクトロポレーションプロトコルの特性評価の効率が向上します。この能力を示すために、HEK293細胞を含む3D組織模倣体をリングとピン電極を使用してトランスフェクトし、GFPをコードするプラスミドを送達しました。次に、トランスフェクトされたサンプルの蛍光顕微鏡画像に基づいてエレクトロポレーション閾値を導き出しました。このモデルは、エレクトロポレーションプロトコルのハイスループット評価の手段として使用できる可能性を示しており、時間がかかり、 in vivo 条件をあまり代表しない傾向にあるこれらの閾値を評価するための現在の方法よりも重要な利点です。

Introduction

可逆的エレクトロポレーション(RE)は、通常は膜を透過しないさまざまな化合物および分子^を細胞に送達するための確立された方法論です^1,2,3。ここでは、パルス電場 (PEF) を使用して、細胞膜の一部に沿って一過性の局所的なナノ細孔を誘導する臨界電界強度を達成します。REは、色素や核酸から化学療法薬^{やその他の薬物に}至るまで、さまざまな分子や化合物を送達するために使用されてきました4,5,6,7,8,9,10。しかし、電界強度が十分に増加すると、より高い臨界閾値を満たすことができ、その結果、細胞^生存率が急速に低下します1,2,11,12。

Protocol

この研究で使用された試薬と機器は、 材料表に記載されています。

1. 細胞調製

1. バイオセーフティキャビネットで、10%(v / v)ウシ胎児血清と1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加したEagle's Minimum Essential Mediumに組織培養T75フラスコあたり10 mLの容量で細胞株HEK293を10×^5細胞/ mLでプレートします。
2. HEK293細胞を37°Cの加湿インキュベーターで5%_CO2 環境でインキュベートします。
3. 播種の2日後に、培地を除去し、4 mLの0.25%トリプシン-EDTAで細胞を処理して、実験用の細胞を回収します。
4. 細胞とトリプシンを、5%CO₂ 環境で37°Cの加湿インキュベーターで3〜5分間、または細胞が培養表面から剥離するまでインキュベートします。
5. 4 mLの培地を添加することにより、トリプシンの酵素活性を不活性化します。
6. 180 × g で 5 分間遠心分離して細胞をペレット化し、培養培地に 8 × 10⁶ 細胞/mL の最終濃度に再懸濁します。

Results

リングとピンの電極は、緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードするDNAプラスミドを、HEK293細胞が埋め込まれた3Dコラーゲン組織模倣物に送達することに成功しました。図 2 に示すように、トランスフェクト領域の外側半径を測定し、実験セットアップの計算モデルから対応する電界強度を導き出すことで、RE 閾値の定量化に成功しました。IRE閾値は、トランスフェクト領域の内径を測定することによって同様に定量化されました。図3A-Cは、バイポーラマイクロ秒PEFを使用した3つのプロトコルについて、結果として得られるREおよびIREのしきい値(それぞれ白と赤で概説)を示しています。プロトコルでは、「PND」表記を使用して、波形の正(P)と負(N)のパルス持続時間、およびこれら2つの成分間の遅延(D)を記述しました。各波形を複数回配信してバーストを作成し、約100μsのオンタイムを構成します(たとえば、.......

Discussion

この方法では、離散電圧で複数のサンプルをテストすることなく、可逆的および不可逆的なエレクトロポレーション閾値を特定できます。不均一電場を使用することで、モデル内のトランスフェクトされた細胞の空間分布に基づく定量化が可能になります。ただし、この不均一な分布には制限があります。何よりもまず、本明細書に記載されているREおよびIRE閾値は、それぞれトランスフェクションおよび細胞死の成功の閾値であり、エレクトロポレーションの程度の直接測定ではない可能性があります。例えば、一部の細胞はエレクトロポレーションされていても、トランスフェクションには細孔が十分でなかったり、遺伝子の過剰発現などの非エレクトロポレーション現象で一部の細胞が死んでしまったりする可能性があります。これはエレクトロポレーションプロトコルがin vivoでどのように変換されるかに大きな影響を与えることはありませんが、分子の取り込みの程度と処理による細胞死が関心のある指標であるため、基礎研究にはより高い精度が必要になる可能性があり、カルセインやヨウ化プロピジウムなどの他のアッセイを使用してこのモデ.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25%トリプシン-EDTA	ギブコ	25200056
1000 uLピペットチップ	フィッシャーサイエンティフィック	13-811-164
15 mLコニカルチューブ	フィッシャーサイエンティフィック	14-959-70C
200 uLピペットチップ	フィッシャーサイエンティフィック	13-811-139
304ステンレス鋼の鈍い先端針	マクマスター・カー	75165A753
316ステンレス鋼チューブ	マクマスター・カー	89785K319
アクリル	マクマスター・カー	8505K754
バイオセーフティキャビネット	フィッシャーサイエンティフィック	13-261-312
CADソフトウェア	ダッソーシステムズ	ソリッドワークス
遠心機	ヌエア	NU-C200R型
エレクトロポレーター	Hbio	45-0662	この研究では、カスタムビルドのデバイスと BTX ECM 830 システムが使用されました
エメム	フィッシャーサイエンティフィック	MT10009CV	これは異なる場合があります HEK293以外の細胞株を使用している場合
Falcon 12ウェルクリアフラットボトムTC処理マルチウェル細胞培養プレート、蓋付き	コーニング	353043	任意の12ウェルプレートを使用できますが、電極ホルダーを製造する際にウェルの寸法が考慮されていることを確認してください。
FBSの	フィッシャーサイエンティフィック	A5670701
光ファイバー温度プローブ	マイクロノール株式会社	TS5-20MM-02
GFP-プラスミド	アルデベロン	gWiz-GFP
HEK293細胞	ATCCの	CRL-1573	他の細胞株を使用することもできますが、正しい培地が使用されていることを確認してください
ホットプレート	熱電冷却アメリカコーポレーション	AHP-301CPV
氷または冷蔵ビーズバス	フィッシャーサイエンティフィック	10-876-001
画像解析ソフトウェア	ライカ	ラスエックス
孵卵器	フィッシャーサイエンティフィック	15-015-2633
倒立蛍光顕微鏡	ライカ	DMi8
レーザーカッター	マクマスター・カー	7344N11
ペニシリン-ストレプトマイシン	フィッシャーサイエンティフィック	15140122
ピペットキット	フィッシャーサイエンティフィック	14-388-100
シミュレーションソフトウェア	コンソル	COMSOL マルチフィジックス 6.2
T75フラスコ	フィッシャーサイエンティフィック	156499
I型ウシコラーゲン溶液	高度なバイオマトリックス	5005	3 mg/mL