エレクトロポレーション閾値を定量化するためのハイスループット対応3次元組織モデル

Summary

このプロトコルは、エレクトロポレーションプロトコルのハイスループット分析のために、3次元組織模倣内のトランスフェクトされた細胞の空間分布を使用して、計算モデリングを使用して可逆的および不可逆的なエレクトロポレーション閾値を定量化します。

Abstract

エレクトロポレーションは、高分子送達や軟部組織アブレーションに電気パルスを利用する有望な技術であり、次世代の予防薬やがんなどの遺伝病の治療などに応用されています。この研究は、特定のエレクトロポレーションプロトコルの可逆的および不可逆的なエレクトロポレーション閾値を定量化するためのハイスループット可能な3D組織培養モデルを示しています。不均一な電場を使用し、トランスフェクトされた細胞の空間分布を分析することにより、1つのサンプル内で可逆的および不可逆的な閾値の両方を特定でき、特に in vivo 翻訳において、エレクトロポレーションプロトコルの特性評価の効率が向上します。この能力を示すために、HEK293細胞を含む3D組織模倣体をリングとピン電極を使用してトランスフェクトし、GFPをコードするプラスミドを送達しました。次に、トランスフェクトされたサンプルの蛍光顕微鏡画像に基づいてエレクトロポレーション閾値を導き出しました。このモデルは、エレクトロポレーションプロトコルのハイスループット評価の手段として使用できる可能性を示しており、時間がかかり、 in vivo 条件をあまり代表しない傾向にあるこれらの閾値を評価するための現在の方法よりも重要な利点です。

Introduction

可逆的エレクトロポレーション(RE)は、通常は膜を透過しないさまざまな化合物および分子^を細胞に送達するための確立された方法論です^1,2,3。ここでは、パルス電場 (PEF) を使用して、細胞膜の一部に沿って一過性の局所的なナノ細孔を誘導する臨界電界強度を達成します。REは、色素や核酸から化学療法薬^{やその他の薬物に}至るまで、さまざまな分子や化合物を送達するために使用されてきました4,5,6,7,8,9,10。しかし、電界強度が十分に増加すると、より高い臨界閾値を満たすことができ、その結果、細胞^生存率が急速に低下します1,2,11,12。このプロセスは不可逆的エレクトロポレーション (IRE) として知られており、他の方法では手術不能な腫瘍や不整脈の治療としてを含む軟部組織アブレーションについて研究されています^{11、12、13、14、15、16}。治療結果を理解し、将来の治療に情報を提供するために、これらの RE および IRE 閾値の定量化は、エレクトロポレーション研究で一般的な方法です^{12、17、18、19、20}。ただし、RE および IRE の閾値は、セルの種類、印加電圧、パルス持続時間、パルス数、パルス送達速度^{1、17、18、21、22} などの多くの要因によって異なります。

エレクトロポレーションプロトコルには、REおよびIRE閾値^が変化する多くのパラメータがあります^{1,17,18,21,22}。最適な治療電圧と波形は長い間研究されてきました。市販されているエレクトロポレーション技術のほとんどは、100 μs-10 ms²³ のオーダーのモノポーラ PEF を使用したプロトコルを利用しています。これらのプロトコルは臨床的に関連する結果を達成しますが、in vivo で激しい筋肉収縮を誘発します ^24、25、26。このため、この刺激を緩和するより短いバイポーラマイクロ秒パルスが、最近^{の関心のある}トピックになっています^1,11,24。ただし、これらのパルスは、パルスの対称性、バースト持続時間、温度依存性など、REおよびIREのしきい値に影響を与える新しい要因を導入します1,17,22,27。さらに、細胞の種類と組織の特性も、REとIREの両方の結果に有意に影響を与えることが示されています19,28,29。この分野が進化し続けるにつれて、これらの要因とそれらの相互作用、および他の考えられる環境要因がREおよびIREの閾値にどのように影響するかをさらに特徴付ける必要があり、より高いスループットの実験を可能にするために実験効率を改善する必要性がますます高まっています。

典型的なin vitroエレクトロポレーション実験は、平行な導電性プレートでキュベット内の細胞を処理することによってプロトコルをテストし、その結果、処理中にキュベット内に均一な電界分布が生じます19,30,31,32,33,34。前述のように、特定の治療に最適な印加電圧を特定するには、プロトコルの RE および/または IRE しきい値を特定する必要があります。キュベット研究でこれを達成するには、複数のキュベットを処理し、それぞれが個別の印加電圧で処理する必要があります。これには、かなりの数のサンプルが必要であり、個別に準備、処理、分析する必要があり、実験スループットが制限されます。このプロセスを改善するために、2D^35,36および3D 13,20,27,37,38,39培養モデルの両方が開発され、不均一な電界分布13,20,27,37を作成する電極を使用して、単一のサンプルにおける電界強度の連続体を評価します^。38,39。次に、REおよびIREしきい値は、電界分布^{13,20,27,37,38}の計算モデルから導き出されます。これにより、必要なサンプル数が大幅に削減され、閾値定量に対するよりハイスループットなアプローチが可能になります。

この記事は、3D in vitro モデルでのREおよびIREフィールド定量化のためのこのアプローチを実証し、複数の環境(細胞の種類、治療パラメーター、送達される分子など)にわたるエレクトロポレーションプロトコルの効率的な評価の手段としての可能性を実証することを目的としています。

Protocol

この研究で使用された試薬と機器は、 材料表に記載されています。

1. 細胞調製

1. バイオセーフティキャビネットで、10%(v / v)ウシ胎児血清と1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加したEagle's Minimum Essential Mediumに組織培養T75フラスコあたり10 mLの容量で細胞株HEK293を10×^5細胞/ mLでプレートします。
2. HEK293細胞を37°Cの加湿インキュベーターで5%_CO2 環境でインキュベートします。
3. 播種の2日後に、培地を除去し、4 mLの0.25%トリプシン-EDTAで細胞を処理して、実験用の細胞を回収します。
4. 細胞とトリプシンを、5%CO₂ 環境で37°Cの加湿インキュベーターで3〜5分間、または細胞が培養表面から剥離するまでインキュベートします。
5. 4 mLの培地を添加することにより、トリプシンの酵素活性を不活性化します。
6. 180 × g で 5 分間遠心分離して細胞をペレット化し、培養培地に 8 × 10⁶ 細胞/mL の最終濃度に再懸濁します。

2. 3D 組織モデルの作成

注:混合物への気泡の侵入を防ぐために、これらの手順ではリバースピペッティングを使用してください。

1. バイオセーフティキャビネットで、調製した8×10⁶ 細胞/mLの細胞懸濁液をI型ウシコラーゲン溶液(3 mg/mL)と1:1の比率で完全に混合します。混合物の作業中の早期重合を防ぐために、氷の上または冷たいビーズ浴に入れます。
2. 500 μLの混合溶液をピペットで移動させ、12ウェルプレートの各ウェルの底をコーティングします。ウェルの中心で溶液を分配し始め、次にゆっくりと外側にらせん状に描くことで、ゲルが底に均一にコーティングされていることを確認します。
3. プレートをゆっくりと回転させて、ゲルの端がウェルの壁に接触するようにします。
4. ゲルを37°Cの加湿インキュベーターで5%CO₂ 環境で6時間、またはゲルが固くなり、プレートを傾けても動かなくなるまでインキュベートします。
5. ウェルプレートを傾け、処理の少なくとも1時間前にプレートの壁をスライドさせて、各ウェルに500 μLの培地をそっと加えます。ゲルは作成から48時間以内に処理する必要があります。

3. 電極の製造

1. 2本の1.64 mm 304ステンレス鋼の鈍い先端シリンジ針のプラスチック製ルアー接続を取り外します。ピン電極として機能する針を1本脇に置きます。もう一方の針は、一方の端の最後の5mmを平らにします。
2. 外径19mmの316ステンレス鋼チューブのセクションを切断し、ウェルプレートの底面と同じ高さに収まるのに十分な長さにして、リング電極を作成します。
3. 図1に示すように、CADソフトウェアを使用して電極ホルダーを設計します。ホルダーにピン電極用の中央穴、リング電極用の溝、および平らな針を挿入してリング電極を所定の位置に保持する圧入を作成できるように、溝と交差する穴があることを確認してください。
   1. また、ホルダーに12ウェルプレートにぴったりとフィットするように設計されたリップがあり、電極とウェルがすべて同軸になるようにリング電極とピン電極をウェルの中央に配置するようにしてください³⁸。
4. 確立されたレーザー切断技術を使用してアクリルから電極ホルダーを製造します⁴⁰.
5. リング電極とピン電極を電極ホルダーにはめ込んで電極を組み立てます。
6. 端を平らにした針をホルダーに圧入して、リング電極を固定します。

4. エレクトロポレーションによる3D組織モデルの処理

1. バイオセーフティキャビネットで、プレートを傾け、各ウェルから400 μLの培地を吸引します。ゲルに接触しないように注意してください。ゲルの水和を維持するために、各吸引ウェルに100 μLの培地を残す必要があります。吸引する液体が400 μL未満の場合(ピペットは液体を残さない/空気を吸い込む)、100 μLの培地を追加します。
2. プレートを傾け、各ウェルの壁に蓄積する液体に試薬を加えることにより、これらの吸引ウェルに20 μLの5 μg/μL GFPプラスミド溶液を加えます(ウェルあたり総容量120 μL)。ゲル表面全体に均一に広がるように、ゆっくりと回転させます。
3. ゲルを加湿インキュベーターで37°C、5%CO₂ 環境で10分間インキュベートします。
4. 光ファイバー温度プローブをピン電極に挿入し、温度の読み取りを開始します。
5. エレクトロポレーターのプラスリード線をピン電極に接続し、マイナスリード線をリング電極を固定する針に接続します。
6. ホットプレートの電源を入れ、ゲルを加熱して温度を37°Cに保ちます。
7. ピン内の光ファイバー温度プローブを備えたリングアンドピン電極をウェルに挿入します。ピンがプレートに対して垂直であり、両方の電極がゲルに完全に接触していることを確認してください。
8. ゲルが37°Cであることを確認します。
9. エレクトロポレーション治療を行います。
10. 乾燥しているように見えるゲルに100 μLの培地を加えます。
11. 手順 4.7 から 4.10 を繰り返します。
12. すべての処理が完了したら、ゲルを37°Cの加湿インキュベーターで5%CO₂ 環境で10分間インキュベートします。
13. ウェルプレートを傾け、プレートの壁をスライドさせて各ウェルに500 μLの培地をそっと加えます。
14. ゲルを37°Cの加湿インキュベーターで5%CO₂ 環境で24時間インキュベートします。

5. 洗浄とイメージング

1. プレートを傾け、各ウェルから培地を吸引します。ゲルに接触しないように注意してください。
2. プレートを傾け、500 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)をプレートの壁をスライドさせて各ウェルにそっと加えます。
3. ゲルを37°Cの加湿インキュベーターで5%CO₂ 環境で5分間インキュベートします。
4. プレートを傾け、各ウェルからPBSを吸引します。ゲルに接触しないように注意してください。
5. プレートを傾け、500 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)をプレートの壁をスライドさせて各ウェルにそっと加えます。
6. プレートをゆっくりと回転させ、傾けて、各ウェルからPBSを吸引します。ゲルに接触しないように注意してください。
7. 100 μLの新鮮なPBSを加えて、イメージングのためにゲルを水和状態に保ちます。
8. 標準的な蛍光顕微鏡技術を用いたイメージプレートこれにより、可逆的および不可逆的な電界のしきい値がそれぞれ領域の外縁と内縁を結合する、明確な緑色のトーラス状の領域を持つゲルの画像が得られるはずです。
9. ウェルプレートを傾け、プレートの壁をスライドさせて各ウェルに500 μLの培地をそっと加えます。
10. ゲルを37°Cの加湿インキュベーターで5%CO₂ 環境で24時間インキュベートします。
11. 各時点について、手順 5.1 から 5.10 を繰り返します。

6. 計算モデルの作成

1. 物理シミュレーション ソフトウェアを開き、電流、固体の熱伝達、および電磁加熱物理を利用する新しい 2D 軸対称モデルを作成します。
2. 実験セットアップのリング電極とピン電極、ゲル、ウェルプレートの電圧、周囲温度、ホットプレート温度、温度設定値、パルス送達速度、積分電気線量、寸法のパラメータを作成します。
3. 図2Aに示すように、リング電極とピン電極、ゲル、および実験セットアップのウェルプレートの放射状断面を表すドメインジオメトリを作成します。
4. ゲルの高さの半分の中心電極の内側にプローブポイントを配置して、in vitro実験中に使用される光ファイバー温度プローブを表します。
5. 入力引数として temperature を使用する区分関数を作成します。
6. 温度が手順 6.2 で定義した温度設定値パラメーターより小さい場合は値が 1 になり、それ以外の場合は 0 になるように関数を定義します。
7. ピン電極を表すドメイン ジオメトリの最上位サーフェスに電圧境界条件を適用し、電圧値をステップ 6.2 で定義した電圧パラメータに、ステップ 6.4 で作成したプローブ ポイントの温度で評価されたステップ 6.6 の区分関数を乗算した値に設定します。
8. リング電極を表すドメインジオメトリの最上サーフェスに[接地境界]条件を適用します。
9. 電気絶縁境界条件を残りのすべてのドメイン境界に適用します。
10. 温度を使用する連続関数を作成します。
11. コラーゲンゲルの温度依存導電率の確立されたモデル²⁷ を使用して、関数を0.8277 + 0.0323 * Tとして定義します。
12. カスタム材料を定義し、電気伝導率を手順6.11で定義した連続関数に設定します。この材料をゲルドメインに塗布します。
13. 材料を定義するか、ソフトウェアのデフォルト(使用可能な場合)を使用して、304および316ステンレス鋼材料をそれぞれピン電極ドメインとリング電極ドメインに割り当て、ポリスチレンをウェルプレートドメインに割り当てます。
14. モデルのベースに温度境界条件を適用し、温度の値を 37 °C に設定します。
15. 別のドメインとインターフェースしない他のすべてのドメインエッジにSurface Ambient Radiation境界条件を適用し、ドメインがプレート、ゲル、または電極の一部であるかどうかに応じて、放射率をそれぞれ0.97、0.9、および0.075に設定します²⁷。
16. モデルにフリー三角形メッシュを追加します。要素サイズを [細かい] に設定します。
17. さまざまなパラメータ レベルを評価する場合は、パラメータを評価するすべての値をリストするパラメトリック スイープを作成します。
18. [ 計算] ボタンをクリックしてシミュレーションを実行します。
19. 完了したら、結果セクションに電界の2Dカットラインプロットを作成します。
20. ピン電極からリング電極にゲルドメインの中央を通るカットラインを定義します。これにより、ピン電極の端からリング電極の端まで指数関数的に減衰するはずです。
21. プロット データを.csvファイルまたは.xlsxファイルとしてエクスポートして、ルックアップ テーブルを作成します。

7. しきい値の導出

1. 顕微鏡のソフトウェアを使用して、垂直軸と水平軸に沿ってトーラス状領域の外縁と内縁の直径を測定します。ソフトウェアにこの機能がない場合は、ImageJを使用して実行します。
2. 外径と内径をそれぞれ平均し、2で割ってトーラス形状の領域の外径と内径を計算します。外側の半径は、RE しきい値をマークします。内側の半径は、IRE しきい値をマークします。
3. ステップ6.21で作成したルックアップテーブルを使用して、測定された半径での電界強度を導き出します。

Results

リングとピンの電極は、緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードするDNAプラスミドを、HEK293細胞が埋め込まれた3Dコラーゲン組織模倣物に送達することに成功しました。図 2 に示すように、トランスフェクト領域の外側半径を測定し、実験セットアップの計算モデルから対応する電界強度を導き出すことで、RE 閾値の定量化に成功しました。IRE閾値は、トランスフェクト領域の内径を測定することによって同様に定量化されました。図3A-Cは、バイポーラマイクロ秒PEFを使用した3つのプロトコルについて、結果として得られるREおよびIREのしきい値(それぞれ白と赤で概説)を示しています。プロトコルでは、「PND」表記を使用して、波形の正(P)と負(N)のパルス持続時間、およびこれら2つの成分間の遅延(D)を記述しました。各波形を複数回配信してバーストを作成し、約100μsのオンタイムを構成します(たとえば、...

Discussion

この方法では、離散電圧で複数のサンプルをテストすることなく、可逆的および不可逆的なエレクトロポレーション閾値を特定できます。不均一電場を使用することで、モデル内のトランスフェクトされた細胞の空間分布に基づく定量化が可能になります。ただし、この不均一な分布には制限があります。何よりもまず、本明細書に記載されているREおよびIRE閾値は、それぞれトランスフェクションおよび細胞死の成功の閾値であり、エレクトロポレーションの程度の直接測定ではない可能性があります。例えば、一部の細胞はエレクトロポレーションされていても、トランスフェクションには細孔が十分でなかったり、遺伝子の過剰発現などの非エレクトロポレーション現象で一部の細胞が死んでしまったりする可能性があります。これはエレクトロポレーションプロトコルがin vivoでどのように変換されるかに大きな影響を与えることはありませんが、分子の取り込みの程度と処理による細胞死が関心のある指標であるため、基礎研究にはより高い精度が必要になる可能性があり、カルセインやヨウ化プロピジウムなどの他のアッセイを使用してこのモデ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25%トリプシン-EDTA	ギブコ	25200056
1000 uLピペットチップ	フィッシャーサイエンティフィック	13-811-164
15 mLコニカルチューブ	フィッシャーサイエンティフィック	14-959-70C
200 uLピペットチップ	フィッシャーサイエンティフィック	13-811-139
304ステンレス鋼の鈍い先端針	マクマスター・カー	75165A753
316ステンレス鋼チューブ	マクマスター・カー	89785K319
アクリル	マクマスター・カー	8505K754
バイオセーフティキャビネット	フィッシャーサイエンティフィック	13-261-312
CADソフトウェア	ダッソーシステムズ	ソリッドワークス
遠心機	ヌエア	NU-C200R型
エレクトロポレーター	Hbio	45-0662	この研究では、カスタムビルドのデバイスと BTX ECM 830 システムが使用されました
エメム	フィッシャーサイエンティフィック	MT10009CV	これは異なる場合があります HEK293以外の細胞株を使用している場合
Falcon 12ウェルクリアフラットボトムTC処理マルチウェル細胞培養プレート、蓋付き	コーニング	353043	任意の12ウェルプレートを使用できますが、電極ホルダーを製造する際にウェルの寸法が考慮されていることを確認してください。
FBSの	フィッシャーサイエンティフィック	A5670701
光ファイバー温度プローブ	マイクロノール株式会社	TS5-20MM-02
GFP-プラスミド	アルデベロン	gWiz-GFP
HEK293細胞	ATCCの	CRL-1573	他の細胞株を使用することもできますが、正しい培地が使用されていることを確認してください
ホットプレート	熱電冷却アメリカコーポレーション	AHP-301CPV
氷または冷蔵ビーズバス	フィッシャーサイエンティフィック	10-876-001
画像解析ソフトウェア	ライカ	ラスエックス
孵卵器	フィッシャーサイエンティフィック	15-015-2633
倒立蛍光顕微鏡	ライカ	DMi8
レーザーカッター	マクマスター・カー	7344N11
ペニシリン-ストレプトマイシン	フィッシャーサイエンティフィック	15140122
ピペットキット	フィッシャーサイエンティフィック	14-388-100
シミュレーションソフトウェア	コンソル	COMSOL マルチフィジックス 6.2
T75フラスコ	フィッシャーサイエンティフィック	156499
I型ウシコラーゲン溶液	高度なバイオマトリックス	5005	3 mg/mL