このプロトコルは、食品廃棄物を生分解性ポリヒドロキシアルカノエート(PHA)バイオプラスチックに変換するためのスケーラブルな方法を提供します。食品廃棄物の前処理には停止した嫌気性消化を、PHA生合成には好塩性微生物発酵を、PHA回収には化学薬品を含まない下流プロセスを利用します。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
世界的なマイクロプラスチック危機は、食品廃棄物処理の課題の増大と相まって、これらの環境問題に一緒に対処するための革新的な解決策を必要としています。ポリヒドロキシアルカノエート(PHA)は、海洋生態系を含むすべての環境で完全に生分解性を持つユニークなバイオプラスチックであり、石油ベースのプラスチックに代わる持続可能な選択肢を提供します。同時に、食品廃棄物をPHA生産の原料として利用することは、食品廃棄物処理の課題を軽減しながら、価値の高い生分解性プラスチックを生産するための効果的な戦略を提供します。この研究では、食品廃棄物からPHAを生成するための段階的なプロトコルを提供し、高い細胞PHA含有量と品質を確保するために必要なクリティカルケアを強調しています。このプロセスは、嫌気性環境を維持し、固体保持時間などのパラメータを最適化することで、食品廃棄物を微生物同化可能な揮発性脂肪酸(VFA)に変換するアレスド嫌気性消化から始まります。次に、VFAが豊富な消化物を使用して、乾燥細胞重量の最大66%±5%のPHAを蓄積できる好塩性微生物である Haloflex mediterraneiを培養します。 H. mediterranei の高塩分栽培環境は、培養汚染を防ぎ、最適なPHA生産を確保しました。細胞増殖は、PHAハーベスティングの理想的な時間を決定するために、光学密度を測定することによってモニターされます。細胞は、浸透圧勾配を活用した化学薬品を含まない水ベースの方法を使用して溶解され、93±3%のPHA回収を達成し、続いて溶媒ベースのPHA精製により96%±2%のPHA純度が得られます。各ステップは、高品質の生分解性プラスチックの生産を確保するために不可欠です。この論文では、停止型嫌気性消化、純培養発酵、ケミカルフリー細胞溶解、および溶媒ベースのPHA精製の詳細な方法を提供し、食品廃棄物をパイロットおよびフルスケールのアプリケーションに適した生分解性バイオプラスチックに変換するためのスケーラブルで持続可能なアプローチを提供します。
概要
プラスチック汚染と食品廃棄物処理は環境問題の高まりであり、持続可能な廃棄物管理と材料開発を通じて両方の課題に対処する革新的なアプローチの必要性が浮き彫りになっています1。従来の石油由来のプラスチックは、環境汚染やマイクロプラスチック汚染の主な原因であり、何世紀にもわたって埋め立て地や水生生態系に存在し続けています2。ポリヒドロキシアルカノエート(PHA)は、微生物バイオプラスチックの一種であり、従来のプラスチックに匹敵する機械的特性を持つ完全生分解性の代替品を提供しながら、自然環境での完全な分解を保証します3。しかし、PHAの高い製造コストは、依然として広範な商業的採用の大きな障壁となっています4。この制限を克服するための有望なアプローチの1つは、コーンスターチやグルコース5などの純粋な炭素源に依存する現在の工業プロセスでは、原料が総生産費の約50%を占めるため、微生物PHA生合成のための費用対効果の高い炭素源として有機廃棄物を活用することです。廃棄物の価値を高めることで、このアプローチは有機材料を埋め立て地から転用するだけでなく、石油ベースのプラスチックの持続可能な代替品に変換し、廃棄物の蓄積とプラスチック汚染の問題に同時に対処します。
好塩性微生物であるH.mediterraneiは、高塩分条件(2-5 M NaCl)で繁殖する能力により、廃棄物由来の原料をPHA生産に利用する大きな可能性を示しています。これは、非好塩性微生物の増殖を阻害することにより汚染を自然に防ぎます6。この高塩分環境により、工業発酵における厳格な滅菌が不要になり、運用コストが削減されます。従来の細菌性PHA産生者とは異なり、H. mediterraneiは多様な廃棄物由来の炭素源を効率的に代謝し、ストレス応答メカニズムとしてPHAをその乾電池重量(DCW)の70%まで蓄積することが報告されている7,8。さらに、その高塩分環境は、水浸によって誘発される浸透圧ショックが細胞を効果的に破壊し、酵素または化学処理を必要とせずにPHA放出を可能にするため、簡単な下流処理を可能にする9。これらの利点により、H. mediterraneiは、スケーラブルな廃棄物ベースのバイオプラスチック生産の理想的な候補として位置付けられています。
既存の研究では、H. mediterranei 6,10,11,12,13,14,15,16,17,18 による PHA 発酵のために、チーズ ホエー、オリーブ工場の廃水、農工業残渣などのさまざまな廃棄物が調査されています.廃棄物組成の高変動性は、微生物の同化11,17,19,20の前に、酵素加水分解、酸加水分解、または熱処理などの異なる前処理戦略を必要とする重大な課題を提示する。ここでは、アレスト嫌気性消化(aAD)は、多様な食品廃棄物を均質な揮発性脂肪酸(VFA)に富む消化物に変換することにより、スケーラブルなソリューションを提供し、H.mediterraneiによるPHA合成の直接の前駆体として機能します21,22。このプロセスにより、原料の一貫性が向上し、基質のばらつきが軽減されると同時に、微生物の発酵効率が向上します。
その可能性にもかかわらず、H. mediterranei 23,24,25 による一般的な食品廃棄物からバイオプラスチックへの変換のために、aAD と微生物 PHA 発酵を統合したこの 2 段階のプロセスを成功裏に実証した研究はごくわずかです。この研究では、食品廃棄物の前処理、半連続aADによるVFA生産、およびPHA生産のためのH.mediterraneiの純粋培養発酵をカバーする詳細なステップバイステップのプロトコルを提供します。さらに、以前の研究では、H. mediterraneiからの水ベースのPHA抽出が検証されていますが、この方法を使用してPHA回収効率と純度を定量化した研究はありません11,18。この研究では、水による浸透圧溶解を利用したケミカルフリーのPHA回収方法を実証し、従来の次亜塩素酸ナトリウム(NaClO)ベースのPHA回収方法と比較してその回収効率を定量化することにより、このギャップに対処します26。さらに、この研究では、水で回収されたPHAの純度を評価し、スケーラブルなバイオプラスチック生産に対するその有効性を包括的に評価します。
実験室規模の実現可能性と産業実装との間のギャップを埋めるために、このプロトコルは、パイロットスケールのaADおよびPHA発酵と、バイオプロセシングおよび大規模微生物発酵で広く使用されている技術である細胞分離のためのディスク遠心分離を組み込んで、産業アプリケーションでのスケーラビリティを実現するように設計されています27。この方法は、食品廃棄物からバイオプラスチックへの変換を最適化することで、大規模な廃棄物の価値化の工業化をサポートし、循環型バイオエコノミーの取り組みを推進します。廃棄物由来の原料、好塩性発酵、および環境に優しいPHA回収戦略の統合により、廃棄物からバイオポリマーへの効率的な変換が可能になり、化石燃料ベースのプラスチックへの依存を減らしながら、持続可能なバイオプラスチック生産を促進します。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
1. 食品廃棄物の収集と準備
- 図 1A に示すように、地元のレストランから食品廃棄物を収集します。得られた廃棄物を視覚的に評価します。観察の結果、廃棄物の主なものは野菜の皮、廃棄された生肉、米や麺類などの炭水化物が豊富な成分で構成されていることが明らかになりました。炭素と窒素(C:N)の比率は、ステップ5.1および5.2で詳述されているように測定し、食品廃棄物が主に炭素に富んでいる場合は、最適なC:N比が20:128に近い状態で調整する必要があるかもしれません。
- 10ガロンのバケツに5kgの食品廃棄物を入れ、2.5Lの水を追加します。ブレンダーを電源に接続します。ブレードを食品廃棄物と水の混合物に沈め、 スタート ボタンを押してブレンドを開始します。完全に均質化されるまで、少なくとも30分間ブレンドします(図1B)。ブレードを上下に動かして、食品廃棄物を完全にブレンドします。
注意: 過熱を防ぐために、ブレンダーのスタートボタンを1分間離す必要がある場合があります。 - ブレンド後、ブレンダーを取り外し、お湯と食器用洗剤で洗浄します。バケツに蓋をし、バケツにサンプル名と調製日をラベル付けし、すぐに使用しない場合は4°Cで保管します。
注:さまざまな発生源や時間から収集される食品廃棄物の特性が異なるため、全固形分(TS)や揮発性固形物(VS)などの調製されたスラリーの基本パラメータは、各調製後にステップ5.1に基づいて測定し、後で使用するために正確なTSおよびVS入力を確保する必要があります。このプロトコルでは、4°Cが短期保存(7日未満)、-20°Cが長期保存に使用されます。
図1:均質化前と均質化後のレストランの食品廃棄物の視覚的比較。 写真は、(A)生の食品廃棄物と(B)均質化された食品廃棄物スラリーを示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
2. aADによるVFA制作
- パイロットスケール(100L)のaAD消化槽(図2A)食品廃棄物からVFAへの変換用。
- パイロットaAD消化器の電源接続と気密性を確認してください。蒸解釜の温度を35°Cに、攪拌速度を150rpmに設定します。
- レイズボタンを押して、蒸解釜の蓋を持ち上げます。フタが約40cm上がったら、ストップボタンを押して停止します。
- 種子のaAD消化器から収集した培養物をパイロットのaAD消化器に、作業容量が80 Lに達するまで加えます。
- 蓋が完全に閉まるまで 下 ボタンを押してから、clで固定しますamps。これにより、蒸解釜は嫌気性条件を維持します。
- この研究では、aAD消化器で9日間の固体保持時間(SRT)が維持されました。以下に説明するように、3日ごとに消化器の作業容量の1/3(約26.7L)を供給および排出します。
注:従来の嫌気性消化は、メタン生成29,30のために14-30日のSRTで操作されます。ここでは、メタン生成を阻害するために9日間の短いSRTが採用されており、VFAの蓄積を促進してaADを成功させます。 - 給餌前のaAD内容物の一部の排出。排出を容易にし、目詰まりを防ぐために、蒸解釜の攪拌速度を一時的に150rpmから200rpmに上げ、この速度を20分間維持してから排出します。
注:攪拌速度を上げると、消化物中の固体粒子が均一に分布し、排出が容易になり、均質なサンプリングが容易になります。 - パイロットaAD蒸解釜の底部にある排出バルブを開き、消化物の作業量の1/3を排出します。排出された消化物をバケツに集め、VFA分析とその後のステップ2.2の固液分離のために4°Cで保存します。
- 有機物負荷率 (OLR) を 2.5 g VS/L-day とすると、食品廃棄物スラリーの VS は平均 ~14.5% でした (表 1)。このためには、設計されたOLRを達成するために、式1に基づいて食品廃棄物スラリーの4.1kgの湿重量が必要です。この4.1kgのスラリーをサンプリングし、後で給餌するために別のバケツに入れます。
供給される食品廃棄物スラリーの湿重量=
(1)
OLRは2.5 g VS / L-day、供給間隔は3日、作業量は80 L、VSは14.5%です。 - 前述の 4.1 kg の湿重量食品廃棄物スラリーが入った別のバケツに、式 2 から計算された容量 (この例では 26.7 L) に達するまで水を追加します。
(2)
供給間隔が3日の場合、作業量は80 L、SRTは9日です。 - ペリスタルティックポンプを使用して、この26.7 Lの食品廃棄物スラリーを 図2AのaAD消化槽に供給します。蠕動ポンプのインレットチューブが、すべての液体が移送されるまで供給バケット液に沈んだままであることを確認してください。
注意: 摂取プロセス中に、チューブがわずかに振動する場合がありますが、これは正常です。 - ポンプをオフにし、電源を抜いてください。パイロット蒸解釜の攪拌速度を150rpmに30分間リセットして、新しい飼料を既存の消化物で均質化します。
- 3 Lの均質化された消化物をバケツに排出し、pH調整を行います。3 Lの均質化消化物から100 mLの消化物をビーカーに分注し、pHを測定します。
- 100 mLの消化物にNaOHペレットを徐々に加え、pHが5.5に達するまで加えます。添加したNaOHペレットの重量を計算するには、pH調整前後のNaOHペレット容器の重量損失を計算します。
- 図2Aのパイロット消化槽に消化物の量に比例してNaOHペレットを添加し、pHを5.5に調整します。例えば、100 mLの均質化消化物をpH 5.5に調整するのに0.09 gのNaOHペレットが必要な場合、72 gのNaOHペレットは80 L、つまり80 L / 0.1 L × 0.09 g = 72 gであるため、パイロットaAD消化器に装填する必要があります。
注:aADの理想的なpH範囲は5〜5.531であるため、各給餌後にpHを5.5に調整する必要があります。aADの間、酸性化反応によりpHは常に低下します。したがって、必要に応じて、手順2.1.13から2.1.16に従って、pHを毎日チェックおよび調整することを強くお勧めします。 - パイロット蒸解釜をチェックして、すべてのバルブが閉じていることを確認し、攪拌速度を150rpmに調整して、次のaAD操作サイクルで断続的に混合します。
注:この研究のパイロットaAD消化器は、工業プロセスを模倣するために半連続モードで操作されます32。
- PHA発酵のためのVFA回収のための上清分離
- ディスク遠心分離機の主電源スイッチをオンにします。
- STANDSTILLテキストがヒューマンマシンインターフェイス(HMI)システム画面に表示されるまで待ちます。潤滑油のレベルが最小しきい値を超えていることを確認します。
- 水道ユーティリティラインのバルブを開き、圧力を45psiに調整します。エアユーティリティラインのバルブを開き、圧力を90psiに調整します。
- HMIシステム画面の グリーン ボタンを押して、ディスク遠心分離機の製造プロセスを開始します。システムがチェックを完了するまで待ちます。
- システムがフルセット速度に達するまで監視します(HMIシステム画面にSTANDBYで示されます)。
注:ディスク遠心分離機の速度は、高効率の分離のために最大容量に設定されています。 - インレットホースが排出された消化物容器に沈んでいることを確認してください。ディスク遠心分離機の上清出口パイプを空の5ガロンバケツに接続して上澄みを収集し、その後のPHA発酵に使用されます。固形物出口を別の空のバケツに接続して、消化物から残留固形物を収集します(図2B)。
- 蠕動ポンプを使用して、消化物をディスク遠心分離機の入口に供給します。それまでの間、HMIシステム画面の[PROD]ボタンをクリックします。 PROD は Production の略です。
- 入口バルブを調整して、0.2〜0.5 m3 / hの流量と0.5〜1バールの背圧を維持します。
注:上澄み物は、ディスク遠心分離機の固液分離段階を指す製造プロセス中により高い分離率を得るために循環されますが、固体はディスク遠心分離機に蓄積されます。 - 製造プロセスの30分後、HMIシステム画面の 排出 ボタンを押して、固形物と上清をそれぞれのバケツに排出します(図2B)。
注:このステップは目視によるチェックに基づいており、TSの分離効率は即座に測定することはできません。通常、上清と固体残留物の所望の分離を達成するには、30分の操作で十分です。 - 採取した上清は、その後のPHA発酵のために4°Cで保存してください。残留固形物は、バイオ廃棄物処理規則に従って廃棄するか、さらに消化するためにaAD蒸解釜に再循環させます。
- HMI画面の CIP ボタンを選択して、定置洗浄(CIP)サイクルを開始します。 表2に指定されている手順に従って、ディスク遠心分離機を洗浄します。
注:ペリスタルティックポンプは、洗浄媒体の供給と排出に使用されます。この洗浄ステップは、機器のメンテナンスにとって重要です。 - 洗浄が完了したら、ペリスタルティックポンプの電源を切って外し、 PROD ボタンを押して、ディスク遠心分離機が分離タンクからすべてを排出することを確認します。回転速度を徐々に下げます。
- HMIシステム画面の 赤い ボタンを押すと、操作が停止します。水と空気のユーティリティラインのバルブを オフ の位置に回します。主電源を切ります。
図2:VFA製造と固液分離に使用される装置。 (A)100LパイロットスケールのaAD消化器。(B)ディスク遠心分離機の分離タンクからそれぞれのバケツへの上清と固形物の排出。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| パラメーター | 食品廃棄物 |
| TS (%) | ~16.5 |
| VS (%) | ~14.5 |
| C:N | ~17:1 |
表1:食品廃棄物の例の特徴。
| 歩 | メディア | 温度 | 目的 | 期間 (分) | 吐出量(L) | 筆記 | ||
| 1 | 水 | 寒い | プライマリフラッシング用 | 5 | 1 | 使用済みの水は通常、排水されます。 | ||
| 2 | 水 | ホット (70 °C) | 酵母の魔法瓶溶解用(該当する場合) | 5 | 1 | 使用済みの水は通常、排水されるか、循環されます。 | ||
| 3 | 2% NaOH溶液 | ホット (70 °C) | タンパク質沈着物の溶解用(該当する場合) | 20 | 1 | 溶液は通常循環しています。 | ||
| 4 | 水 | ホット (70 °C) | フラッシング用 | 5 | 1 | 使用済みの水は通常、排水されるか、循環されます。 | ||
| 5 | 1%硝酸溶液 | ホット (70 °C) | 無機堆積物の溶解に | 10 | 1 | 軟水を使用する場合、酸洗浄は年に数回で済みます。この場合、リターンはドレインに渡すことができます。硬水を使用する場合、CIPごとに酸洗浄が必要になることがあります。この場合、循環システムを使用する必要があります。 | ||
| 6 | 水 | ホット (80–95 °C) | フラッシングおよび滅菌用 | 5 | 1 | このステップからの放電の濁度が高い場合は、ステップ2から繰り返します。 | ||
表2:ディスク遠心分離機の洗浄手順。
3. VFAを豊富に含む消化物上清を用いたPHA発酵
- スケールアップの最適条件を決定するためのベンチスケールPHA発酵。
- ステップ2.2.9で収集した消化物上清を濃度の勾配に希釈するために水を加え、細胞増殖23への妥協を最小限に抑えながら、食品廃棄物消化物上清に存在する潜在的な毒性化合物の阻害効果を最小限に抑える最適な希釈時間を特定する。
注:これらの阻害効果を緩和するためには、通常、最低2回の希釈が必要である25。 - 希釈した消化物上清に塩と栄養素、具体的には156 g / L NaCl、5 g / L酵母抽出物、13 g / L MgCl26H2O、20 g / L MgSO47H2O、1 g / L CaCl22H2O、4 g / L KCl、0.2 g / L NaHCO3、および0.5 g / L NaBrを補給します。 必要に応じてNH4Cl33。
- NaClを添加する前に、導電率プローブを使用して消化物上清の塩分濃度を測定します。食品廃棄物消化物は通常、塩分濃度がごくわずかです。ただし、塩分濃度が高い場合は、式3に基づいてNaClの投与量を調整します。
NaCl添加量(g)= 156 g / L NaCl×調製培地の総量-添加された消化物上清
×量(3) - 消化物上清から作られた培地のC:N比を15に保ちます。ステップ 5.2 および 5.3 で指定されている全有機炭素 (TOC) と全窒素 (TN) で測定された消化物上清の固有の C:N 比に基づいて、NH4Cl 添加を決定します。
- マグネチックスタープレートを使用して、すべてのサプリメントが完全に溶解するまで、200rpmで培地を攪拌します。1 N NaOHまたは1 N H2SO4を使用して、培地のpHを7.0±0.05に調整します。
- 調製した培地を滅菌三角フラスコに割り付け、容量の1/5のみを満たして、培養中に適切な空気移動のための大きなヘッドスペースを維持します(図3A)。フラスコを綿または栽培中のガス交換を可能にするのに十分な多孔性を備えた任意のタイプの通気性のある材料で覆います。
- H. mediterranei 種子培養物 (-80 °C で保存されている市販の American Type Culture Collection (ATCC) 33500 から活性化) を、H. mediterranei 株の通常の生育温度 (例: 37 °C) に設定した水浴中で穏やかに攪拌して解凍します。解凍は、約 2 分、またはすべての氷の結晶が溶けるまで、迅速に行う必要があります。
- 調製した培地に0.2%(v / v) H.mediterranei 種子培養物にOD600nm ~0.5を接種します。接種したポジティブコントロールフラスコとATCC培地1176を接種しなかったネガティブコントロールフラスコを準備します33。
注:ATCC培地は、ステップ3.1.2で詳述したのと同じ栄養組成を持っていますが、消化物の上清が1 g / Lグルコースに置き換えられ、追加の窒素源は追加されません。 - すべてのフラスコを37°Cでインキュベートし、オービタルシェーカーで150rpmで振とうします。光学濃度(OD600nm)を固定相で安定するまで毎日測定し、その後培養を中止します。ピンクがかったブロス(図3B)を収集して、下流のPHA回収を行います。
- ステップ2.2.9で収集した消化物上清を濃度の勾配に希釈するために水を加え、細胞増殖23への妥協を最小限に抑えながら、食品廃棄物消化物上清に存在する潜在的な毒性化合物の阻害効果を最小限に抑える最適な希釈時間を特定する。
- 50 Lガラス発酵槽でのパイロットスケールのPHA発酵。
- PHAパイロット発酵槽(図4)と水循環ヒーターを電源に接続します。
- ウォーターバス暖房スイッチをオンにします。温度を37°Cに設定します。 スターラーの電源を入れ、150rpmに設定します。
- 最適な希釈係数を使用して調製した食品廃棄物消化物上清を、ステップ3.1.2で特定した塩分および栄養サプリメントとともに加えると、作業量は40 Lになります。
- pH値を7に調整します。調製した培地に OD600nm の ~0.5 の 10% (v/v) H. mediterranei 種子培養液を接種します。
- パイロット発酵槽のエアポンプをオンにし、曝気速度を110 m3 / hに設定します。サンプルを収集し、OD600nm を毎日測定します。OD600nm が固定相に達したら、発酵を停止し、発酵ブロスを4°Cで保存して下流のPHAを回収します。
- 発酵槽を水道水と70%エタノールで洗います。
図3: H.mediterraneiによるPHA生産の発酵前および発酵後のフラスコ。 (A)インキュベーション/発酵前の食品廃棄物消化物上清から作られたフラスコ内の培地。(B)発酵後のピンクがかったPHAに富む H.mediterranei 培養。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:50LパイロットスケールPHA発酵槽 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
4. PHAダウンストリームの回復
- H. mediterranei発酵ブロスをディスク遠心分離機に供給して、塩辛い上清とH.mediterranei細胞を分離します。回収した細胞(図5のSolid Out部分)を回収し、その後の細胞溶解に使用します。リキッドアウトフラクションは、バイオ廃棄物処理規則に従って廃棄してください。
注:ここでのディスク遠心分離機の操作は、2.2の手順と同じです。 - 採取した細胞を100 mL/gの湿式細胞で水に回収し、室温で150 rpmで2時間混合して、浸透圧ショックによる細胞溶解を可能にします。
- ステップ4.1で回収した採取した細胞の少量(50 mL)を4% NaClO溶液(湿式細胞1gあたり4%NaClO溶液2 mL)に再懸濁し、5分間混合します。
注:NaClO処理は、 H.mediterranei 細胞から100%PHAを回収できるベースラインを提供するために使用されます。この仮定は、このNaClO処理がPHA回収に最も広く適応された方法であるという事実に基づいて行われる34。このNaClO処理は通常、細胞種に関係なく、完全な細胞溶解とPHA回収に十分なほど積極的であると考えられています。
注意:NaClOは強力な酸化剤です。重度の皮膚の火傷、目の損傷、呼吸器の炎症を引き起こす可能性があります。NaClOは、常に換気の良い場所またはドラフトの下で、手袋、安全ゴーグル、白衣などの適切な個人用保護具(PPE)を着用して取り扱ってください。皮膚に付着した場合は、すぐに患部を大量の水で洗い流し、刺激が続く場合は医師の診察を受けてください。NaClO含有廃棄物は、環境汚染を防ぐために、地域の有害廃棄物規制に従って処分してください。 - 溶解した懸濁液を10,000 x g で30分間遠心分離し、PHA顆粒を収集します。上澄み物は、バイオ廃棄物処理規則に従って研究室で処分してください。
- PHA顆粒を-50°Cで~48時間凍結乾燥し、一定の重量に達するまで凍結乾燥して粗PHA粉末を得ます(図6A)。
- 粗PHA粉末にエタノールを10mL/gで加え、残留不純物を除去します。10,000 x g で30分間遠心分離し、精製されたPHA顆粒を収集します。上澄み液は化学廃棄物処理規則に従って廃棄してください。
- PHAペレットを-50°Cで~48時間凍結乾燥し、一定の重量に達するまで凍結乾燥させて精製されたPHA粉末を得ます(図6B)。
図5:分離された塩辛い上清(左)と細胞(右)この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:PHA粉末(A)粗PHA粉末と(B)精製PHA粉末。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
5. 分析方法
- 標準的な方法35に従ってTSとVSを測定します。分光光度計35を使用して標準的な方法に従ってHachテストキットによってTNを決定します。
- TOC分析装置で、以前の研究25で説明した方法に従ってTOCを測定します。ベンチトップpHメーターでpHを測定します。
- キット36を使用してVFAの定量を決定する。マイクロプレートリーダーを使用してOD600nm をモニターします。
- 標準のVSS測定方法25,35に従って測定されたセルブロスの揮発性懸濁物質(VSS)からDCWを推定します。簡単に説明すると、50 mLの細胞ブロスを8,000 x gで15分間遠心分離し、ペレットをるつぼに移してVSS分析を行います。
注:VSSは有機バイオマスを反映し、 H. mediterranei23の塩分含有量による過大評価を避けるため、DCWを推定するために使用します。 - 凍結乾燥バイオマスをクロロホルムでメタノール化し、酸性化メタノールを105°Cで2時間2時間放置し、得られたモノマーをGCと安息香酸メチルを内部標準として定量する先行研究25の方法に従って、ガスクロマトグラフィー(GC)によるPHA定量を行う。式 4 を使用して PHA 回収率を計算し、式 5 を使用して PHA 純度を計算します。GCからPHAの全質量を判定します。
PHA回復率(%)=
(4)
PHA純度(%)=
(5)
注意:PHA定量に使用されるクロロホルムと硫酸は危険であり、細心の注意を払って取り扱う必要があります。クロロホルムは揮発性有機溶媒であり、吸入毒性のリスクがあり、長時間の曝露により肝臓や腎臓に損傷を与える可能性があります。硫酸は、皮膚や目に触れると重度の火傷を引き起こす可能性のある強力な腐食性化学物質です。これらの化学物質は、吸入暴露を防ぐために、常にドラフト内で取り扱ってください。耐薬品性手袋、安全ゴーグル、白衣など、適切なPPEの使用を確認してください。すべてのクロロホルムおよび硫酸廃棄物は、地域の有害廃棄物規制に従って適切に処分し、安全な実験室の慣行を維持します。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
aADからの食品廃棄物特性とVFA生成
調製済み食品廃棄物スラリー中のTS、VS、およびC:N比の例を 表1に示します。食品廃棄物の組成には、サンプリング源や時間によって固有のばらつきがあるため、TS、VS、C:N比の値の変動が予想されます。ばらつきは許容できるが、定期的なTS、VS、およびC:N比の測定は、プロセスモニタリング、微生物バランス、および全体的なaADシステムの最適化に不可欠である37。
VFA濃度は、aAD消化器の操作の安定性と効率の重要な指標として機能します。 表 3 は、例として 4 つの運用サイクルの VFA データを示しています。これらのサイクル中、VFA濃度は4.13 ± 0.05 g HAc/Lで安定しており、aAD発酵槽がVFAを安定して生成できることが確認されました。この値は、文献22で報告されている値に匹敵し、パイロットスケールのaADシステムの運...
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
aADからのVFA制作
VFAは、H. mediterraneiが食品廃棄物をPHAに変換する際の重要な前駆体として重要な役割を果たしています。したがって、aAD中に高いVFA濃度を維持することが不可欠です。aAD25でのVFA生産を強化するために、いくつかの戦略を採用することができます。効果的なアプローチの一つは、理想的な期間が8日以下のSRT最適化であり、これはメタン生成菌のウォッシュアウトを促進しながら加水分解と酸生成を最大化し、それによって過剰なVFA消費を防ぐ46。好熱条件(45-55°C)は基質の可溶化と酸性化を改善し、中温条件と比較してVFAの生産性を高めることができるため、温度調節は別の効果的なアプローチである47。さらに、2-ブロモエタンスルホン酸などの化学的阻害剤の添加、またはpH 4での短期間のpHショックは、主要な微生物経路を標的とするか、メタン生...
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
著者は何も開示していません。
謝辞
この研究は、エネルギー省-エネルギー効率および再生可能エネルギー局(Prime Award No.DEEE0009268)および米国農務省国立食糧農業研究所(賞番号2023-79000-38973)。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 空気 | エアガス | AI UZ300 | GC操作に使用 |
| ポンプ座 | クラウドレイ | ハイレア ACO-009D | |
| 塩化アンモニウム | アクロスオーガニック | A0396560 | |
| オートクレーブ | ステリス | AMSCOラボ250 | ATCC培地調製に使用 |
| 秤 | メトラー・トレド | 00 ME204TE | |
| ミキサー | ヴェヴォル | IB750LV+BLD300+WB-1 | |
| バケツ | ロウズ | モデル 50640 | 5ガロンBPAフリープラスチック製一般バケツ |
| 塩化カルシウム二水和物 | アクロスオーガニック | A0362932 | |
| クロロホルム | ミリポアシグマ | C2432 | |
| デシケーター | TS、VS、VSS測定に使用できる任意のタイプ | ||
| 消化チューブ、PTFEライナー付きスクリューキャップ | ミリポアシグマ | CLS982613 | |
| デジタルリアクターブロック | ハッハ社 | DRB200 | Hach VFA定量法で使用 |
| デジタルスターラー | サイロゲックス | SCI550-プロ | |
| ディスク遠心分離機 | アルファ・ラバル株式会社 | クララ 20 | |
| 三角フラスコ | アマゾン | B07V3JPQMM | |
| エタノール | アマゾン | B09DGVL4ML | |
| 凍結乾燥機 | ラボコンコ | 10030133、1027319、0109621 | FreeZone 2.5リットルフリーズドライシステム |
| ヒュームフード | ケワウニーサイエンティフィックコーポレーション | シュプリームエアLV | |
| 炉 | サーモサイエンティフィック | モデルF30428C | |
| ガスクロマトグラフィー(GC) | アジレント | モデル8890 | |
| Haloferax mediterranei | ATCCの | 33500 | |
| 水素 | エアガス | ハイUHP300 | GC操作に使用 |
| ナイフ | 食品廃棄物の削減に使用されるあらゆるタイプ | ||
| 潤滑油 | フィッシャーサイエンティフィックカンパニー | NC9844626 | |
| 塩化マグネシウム六水和物 | フィッシャーサイエンティフィックカンパニー | BP214-500 | |
| 硫酸マグネシウム七水和物 | ミリポアシグマ | M1880型 | |
| メトナール | ミリポアシグマ | 34860 | |
| 安息香酸メチル | ミリポアシグマ | 93583 | PHA定量の内部標準として使用 |
| マイクロプレートリーダー | BioTek シナジー | シナジーH1 | |
| 窒素 | エアガス | NIのUHP300 | GC操作に使用 |
| オーブン | サーモサイエンティフィック | オーム750 | |
| 蠕動ポンプ | シンプリーポンプ株式会社 | PM6000 交流 | 優れた空運転能力を備えた高流量自吸式ポンプで、高粒子スラリーを処理でき、1/8インチの壁チューブ用に設計されています。 |
| pHメーター | フィッシャーサイエンティフィックカンパニー | AE150 | |
| PHA規格 | ミリポアシグマ | 403105 | |
| パイロットaAD消化槽 | クエーサーエネルギーグループ、インディペンデンス、オハイオ州、米国 | 総容量100 L、作業容量80 L のステンレス鋼発酵槽。 | |
| パイロットPHA発酵槽 | マヌカツリー | SF-50l ISO 9001 CE | 二重層ジャケット付きガラスリアクター |
| 塩化カリウム | ジーバイオサイエンス | 162006 | |
| ポンプチューブ | 内径が1/8インチ、外径が3/8インチの任意のブランドのシリコンチューブ | ||
| 炭酸水素ナトリウム | フィッシャーケミカル | 241787 | |
| 臭化ナトリウム | カロライナ | 21139-45 | |
| 塩化ナトリウム | アマゾン | B0787CFHF3 | |
| 水酸化ナトリウム、ペレット | フィッシャーバイオ試薬 | 236088 | |
| 次亜塩素酸ナトリウム | ミリポアシグマ | 425044 | |
| Sorvall LYNX 4000 超高速遠心分離機 | サーモサイエンティフィック | 75006580 | 下流のPHA回収におけるPHA顆粒の収集に使用されます |
| 分光光度計 | ハッハ社 | DR3900 | Hach VFA定量法で使用 |
| 硫酸 | ミリポアシグマ | 258105 | |
| シリンジフィルター | アマゾン | B06X6GTKVY | |
| TOC分析装置 | 島津製作所 | 型式 TOC-LCSN | |
| 揮発性酸TNTplusバイアルテスト | ハッハ社 | TNT 872 | 50〜2,500 mg/Lの酢酸の範囲でVFAを測定できます。 |
| 湯沸かし器 | ボッシュ株式会社 | トロニック 3000 T 7 ガロン (ES8) | |
| 酵母エキス | フィッシャーサイエンティフィックカンパニー | AAJ6028736 |
参考文献
- Sabapathy, P. C. Recent developments in polyhydroxyalkanoates (phas) production-a review. Biores Tech. 306, 123132(2020).
- Koller, M., Simon, K. M. R. Haloarchaea as emerging big players in future polyhydroxyalkanoate bioproduction: Review of trends and perspectives. Curr Res Biotechnol. 4, 377-391 (2022).
- Atarés, L., Chiralt, A., González-Martínez, C., Vargas, M. Production of polyhydroxyalkanoates for biodegradable food packaging applications using haloferax mediterranei and agrifood wastes. Foods. 13 (6), 950(2024).
- Kusuma, H. S., et al. Waste to wealth: Polyhydroxyalkanoates (pha) production from food waste for a sustainable packaging paradigm. Food Chem Mol Sci. 9, 100225(2024).
- Li, M., Wilkins, M. R. Recent advances in polyhydroxyalkanoate production: Feedstocks, strains and process developments. Int J Biol Macromol. 156, 691-703 (2020).
- Alsafadi, D., Al-Mashaqbeh, O. A one-stage cultivation process for the production of poly-3-(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) from olive mill wastewater by haloferax mediterranei. New Biotechnol. 34, 47-53 (2017).
- Amaro, T. M., Rosa, D., Comi, G., Iacumin, L. Prospects for the use of whey for polyhydroxyalkanoate (pha) production. Front Microbio. 10, 992(2019).
- Sharma, K., Gillum, N., Boyd, J. L., Schmid, A. The rosr transcription factor is required for gene expression dynamics in response to extreme oxidative stress in a hypersaline-adapted archaeon. BMC Genomics. 13, 1-18 (2012).
- Mitra, R., Xu, T., Xiang, H., Han, J. Current developments on polyhydroxyalkanoates synthesis by using halophiles as a promising cell factory. Micro Cell Factories. 19, 1-30 (2020).
- Alsafadi, D., Alhesan, J. S. A., Mansoura, A., Oqdeha, S. Production of polyhydroxyalkanoate from sesame seed wastewater by sequencing batch reactor cultivation process of haloferax mediterranei. Arabian J Chem. 16 (4), 104584(2023).
- Pais, J., Serafim, L. S., Freitas, F., Reis, M. A. Conversion of cheese whey into poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) by haloferax mediterranei. New Biotechnol. 33 (1), 224-230 (2016).
- Koller, M., et al. Potential of various archae-and eubacterial strains as industrial polyhydroxyalkanoate producers from whey. Macromol Biosci. 7, 218-226 (2007).
- Bhattacharyya, A. Integration of poly-3-(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) production by haloferax mediterranei through utilization of stillage from rice-based ethanol manufacture in india and its techno-economic analysis. World J Microbiol Biotechnol. 31, 717-727 (2015).
- Bhattacharyya, A., et al. Utilization of vinasse for production of poly-3-(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) by haloferax mediterranei. AMB express. 2, 1-10 (2012).
- Khamplod, T., Wongsirichot, P., Winterburn, J. Production of polyhydroxyalkanoates from hydrolysed rapeseed meal by haloferax mediterranei. Biores Tech. 386, 129541(2023).
- Montemurro, M., et al. Exploitation of wasted bread as substrate for polyhydroxyalkanoates production through the use of haloferax mediterranei and seawater. Front Microbio. 13, 1000962(2022).
- Alsafadi, D., Ibrahim, M. I., Alamry, K. A., Hussein, M. A., Mansour, A. Utilizing the crop waste of date palm fruit to biosynthesize polyhydroxyalkanoate bioplastics with favorable properties. Sci Total Environ. 737, 139716(2020).
- Raho, S. Production of the polyhydroxyalkanoate phbv from ricotta cheese exhausted whey by haloferax mediterranei fermentation. Foods. 9 (10), 1459(2020).
- Aliyu Salihu, M. Z. A. Pretreatment methods of organic wastes for biogas production. J Appl Sci. 16 (3), 124-137 (2016).
- Khomlaem, C., et al. Defatted chlorella biomass as a renewable carbon source for polyhydroxyalkanoates and carotenoids co-production. Algal Res. 51, 102068(2020).
- Li, Y., Jin, Y., Borrion, A., Li, H., Li, J. Effects of organic composition on mesophilic anaerobic digestion of food waste. Biores Tech. 244, 213-224 (2017).
- Giduthuri, A. T., Ahring, B. K. Current status and prospects of valorizing organic waste via arrested anaerobic digestion: Production and separation of volatile fatty acids. Fermentation. 9 (1), 13(2022).
- Wang, K., Zhang, R. Production of polyhydroxyalkanoates (pha) by haloferax mediterranei from food waste derived nutrients for biodegradable plastic applications. Journal of Microbio Biotech. 31 (2), 338-347 (2021).
- Wang, K., Chen, C., Zhang, R. Process development of polyhydroxyalkanoates production by halophiles valorising food waste. Bioengineering. 9 (11), 630(2022).
- Zhang, X. Long-term effects of cycle time and volume exchange ratio on poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) production from food waste digestate by haloferax mediterranei cultivated in sequencing batch reactors for 450 days. Biores Tech. 416, 131771(2024).
- Getino, L., Martín, J. L., Chamizo-Ampudia, A. A review of polyhydroxyalkanoates: Characterization, production, and application from waste. Microorganisms. 12 (10), 2028(2024).
- Esmaeilnejad-Ahranjani, P., Hajimoradi, M. Optimization of industrial-scale centrifugal separation of biological products: Comparing the performance of tubular and disc stack centrifuges. Biochem Engineering J. 178, 108281(2022).
- Tennison-Omovoh, C. A., Fagbohungbe, M. O., Bankole, P. O., Semple, K. T. The effect of different cn ratios on volatile fatty acid (vfas) production from acidogenic fermentation of sucrose in continuous-stirred tank reactors. Biomass Convers Biorefinery. 13, 9339-9351 (2023).
- Epa, U. Biosolids technology fact sheet, multi-stage anaerobic digestion. Natl Serv Center Environ Publi. , 1-13 (2006).
- Schnaars, K. What every operator should know about anaerobic digestion. Water Environ Tech. 24, 82-83 (2012).
- Sun, J., Zhang, X., Guan, J., He, Z. Volatile fatty acid production through arresting methanogenesis by electro-synthesized hydrogen peroxide in anaerobic digestion and subsequent recovery by electrodialysis. ACS ES&T Eng. 4 (12), 2964-2973 (2024).
- Bhatia, P., et al. Effect of semi-continuous anaerobic digestion on the substrate solubilisation of lignin-rich steam-exploded ludwigia grandiflora. Appl Sci. 11 (10), 4452(2021).
- Product sheet of haloferax mediterranei (rodriguez-valera et al.) torreblanca et al. , American type culture collection (atcc). https://www.atcc.org/products/33500 (2025).
- Pagliano, G., Galletti, P., Samorì, C., Zaghini, A., Torri, C. Recovery of polyhydroxyalkanoates from single and mixed microbial cultures: A review. Front Bioeng Biotechnol. 9, 624021(2021).
- Rice, E. W., Bridgewater, L. Standard methods for the examination of water and waste water. 10, American Public Health Association. Washington, DC. (2012).
- Kaur, H., Kommalapati, R. R. Optimizing anaerobic co-digestion of goat manure and cotton gin trash using biochemical methane potential (bmp) test and mathematical modeling. SN Appl Sci. 3, 1-14 (2021).
- Yi, J., Dong, B., Jin, J., Dai, X. Effect of increasing total solids contents on anaerobic digestion of food waste under mesophilic conditions: Performance and microbial characteristics analysis. PloS One. 9 (7), e102548(2014).
- Velivela, A., et al. Biogas: Converting waste to energy. Innovation Mang Intelligent World Cases Tools. , 285-298 (2020).
- Cui, Y. W., Shi, Y. P., Gong, X. Y. Effects of c/n in the substrate on the simultaneous production of polyhydroxyalkanoates and extracellular polymeric substances by haloferax mediterranei via kinetic model analysis. RSC Adv. 7 (31), 18953-18961 (2017).
- Ghosh, S., et al. Macroalgal biomass subcritical hydrolysates for the production of polyhydroxyalkanoate (pha) by haloferax mediterranei. Biores Tech. 271, 166-173 (2019).
- Bold goals for us biotechnology and biomanufacturing: Harnessing research and development to further societal goals. , The White House Office of Science and Technology Policy. (2023).
- Nienow, A. W. Reactor engineering in large scale animal cell culture. Cytotechnology. 50 (1), 9-33 (2006).
- Goodhead, L. K., Macmillan, F. M. Measuring osmosis and hemolysis of red blood cells. Adv Physiol Educ. 41 (2), 298-305 (2017).
- Cai, S., et al. Identification of the haloarchaeal phasin (phap) that functions in polyhydroxyalkanoate accumulation and granule formation in haloferax mediterranei. Appl Environ Microbio. 78 (6), 1946-1952 (2012).
- Giani, M. Haloferax mediterranei cells as c50 carotenoid factories. Marine Drugs. 19 (2), 100(2021).
- Tanvir, R. U., Ahmed, M., Lim, T. T., Li, Y., Hu, Z. Arrested methanogenesis: Principles, practices, and perspectives. Adv Bioener. 7, 1-66 (2022).
- Lukitawesa,, Patinvoh, R. J., Millati, R., Sarvari-Horvath, I., Taherzadeh, M. J. Factors influencing volatile fatty acids production from food wastes via anaerobic digestion. Bioengineered. 11 (1), 39-52 (2020).
- Cabrera, F., et al. The accumulation of volatile fatty acids and phenols through a ph-controlled fermentation of olive mill solid waste. Sci Total Environ. 657, 1501-1507 (2019).
- Koller, M., Obruca, S., Pernicova, I., Braunegg, G. Physiological, kinetic, and process engineering aspects of polyhydroxyalkanoate biosynthesis by extremophiles. Polyhydroxyalkanoates Biosynth Chem Struct Appl. 2013, 1-70 (2018).
- Schiraldi, C., De Rosa, M. The production of biocatalysts and biomolecules from extremophiles. Trends Biotech. 20 (12), 515-521 (2002).
- Lorantfy, B., Seyer, B., Herwig, C. Stoichiometric and kinetic analysis of extreme halophilic archaea on various substrates in a corrosion resistant bioreactor. New Biotech. 31 (1), 80-89 (2014).
- Hezayen, F., Rehm, B., Eberhardt, R., Steinbüchel, A. Polymer production by two newly isolated extremely halophilic archaea: Application of a novel corrosion-resistant bioreactor. Appl Microbio Biotechnol. 54, 319-325 (2000).
- Mahler, N., Tschirren, S., Pflügl, S., Herwig, C. Optimized bioreactor setup for scale-up studies of extreme halophilic cultures. Biochem Eng J. 130, 39-46 (2018).
- Bondi, C. A., et al. Human and environmental toxicity of sodium lauryl sulfate (sls): Evidence for safe use in household cleaning products. Environ Health Insights. 9, S31765(2015).
- Najim, A. A., Ismail, Z. Z., Hummadi, K. K. Biodegradation potential of sodium dodecyl sulphate (sds) by mixed cells in domestic and non-domestic actual wastewaters: Experimental and kinetic studies. Biochem Eng J. 180, 108374(2022).
- Zhao, F., Wang, Z., Huang, H. Physical cell disruption technologies for intracellular compound extraction from microorganisms. Processes. 12 (10), 2059(2024).
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
タグ
