このプロトコルは、食品廃棄物を生分解性ポリヒドロキシアルカノエート(PHA)バイオプラスチックに変換するためのスケーラブルな方法を提供します。食品廃棄物の前処理には停止した嫌気性消化を、PHA生合成には好塩性微生物発酵を、PHA回収には化学薬品を含まない下流プロセスを利用します。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
このプロトコルは、食品廃棄物を生分解性ポリヒドロキシアルカノエート(PHA)バイオプラスチックに変換するためのスケーラブルな方法を提供します。食品廃棄物の前処理には停止した嫌気性消化を、PHA生合成には好塩性微生物発酵を、PHA回収には化学薬品を含まない下流プロセスを利用します。
世界的なマイクロプラスチック危機は、食品廃棄物処理の課題の増大と相まって、これらの環境問題に一緒に対処するための革新的な解決策を必要としています。ポリヒドロキシアルカノエート(PHA)は、海洋生態系を含むすべての環境で完全に生分解性を持つユニークなバイオプラスチックであり、石油ベースのプラスチックに代わる持続可能な選択肢を提供します。同時に、食品廃棄物をPHA生産の原料として利用することは、食品廃棄物処理の課題を軽減しながら、価値の高い生分解性プラスチックを生産するための効果的な戦略を提供します。この研究では、食品廃棄物からPHAを生成するための段階的なプロトコルを提供し、高い細胞PHA含有量と品質を確保するために必要なクリティカルケアを強調しています。このプロセスは、嫌気性環境を維持し、固体保持時間などのパラメータを最適化することで、食品廃棄物を微生物同化可能な揮発性脂肪酸(VFA)に変換するアレスド嫌気性消化から始まります。次に、VFAが豊富な消化物を使用して、乾燥細胞重量の最大66%±5%のPHAを蓄積できる好塩性微生物である Haloflex mediterraneiを培養します。 H. mediterranei の高塩分栽培環境は、培養汚染を防ぎ、最適なPHA生産を確保しました。細胞増殖は、PHAハーベスティングの理想的な時間を決定するために、光学密度を測定することによってモニターされます。細胞は、浸透圧勾配を活用した化学薬品を含まない水ベースの方法を使用して溶解され、93±3%のPHA回収を達成し、続いて溶媒ベースのPHA精製により96%±2%のPHA純度が得られます。各ステップは、高品質の生分解性プラスチックの生産を確保するために不可欠です。この論文では、停止型嫌気性消化、純培養発酵、ケミカルフリー細胞溶解、および溶媒ベースのPHA精製の詳細な方法を提供し、食品廃棄物をパイロットおよびフルスケールのアプリケーションに適した生分解性バイオプラスチックに変換するためのスケーラブルで持続可能なアプローチを提供します。
プラスチック汚染と食品廃棄物処理は環境問題の高まりであり、持続可能な廃棄物管理と材料開発を通じて両方の課題に対処する革新的なアプローチの必要性が浮き彫りになっています1。従来の石油由来のプラスチックは、環境汚染やマイクロプラスチック汚染の主な原因であり、何世紀にもわたって埋め立て地や水生生態系に存在し続けています2。ポリヒドロキシアルカノエート(PHA)は、微生物バイオプラスチックの一種であり、従来のプラスチックに匹敵する機械的特性を持つ完全生分解性の代替品を提供しながら、自然環境での完全な分解を保証します3。しかし、PHAの高い製造コストは、依然として広範な商業的採用の大きな障壁となっています4。この制限を克服するための有望なアプローチの1つは、コーンスターチやグルコース5などの純粋な炭素源に依存する現在の工業プロセスでは、原料が総生産費の約50%を占めるため、微生物PHA生合成のための費用対効果の高い炭素源として有機廃棄物を活用することです。廃棄物の価値を高めることで、このアプローチは有機材料を埋め立て地から転用するだけでなく、石油ベースのプラスチックの持続可能な代替品に変換し、廃棄物の蓄積とプラスチック汚染の問題に同時に対処します。
好塩性微生物であるH.mediterraneiは、高塩分条件(2-5 M NaCl)で繁殖する能力により、廃棄物由来の原料をPHA生産に利用する大きな可能性を示しています。これは、非好塩性微生物の増殖を阻害することにより汚染を自然に防ぎます6。この高塩分環境により、工業発酵における厳格な滅菌が不要になり、運用コストが削減されます。従来の細菌性PHA産生者とは異なり、H. mediterraneiは多様な廃棄物由来の炭素源を効率的に代謝し、ストレス応答メカニズムとしてPHAをその乾電池重量(DCW)の70%まで蓄積することが報告されている7,8。さらに、その高塩分環境は、水浸によって誘発される浸透圧ショックが細胞を効果的に破壊し、酵素または化学処理を必要とせずにPHA放出を可能にするため、簡単な下流処理を可能にする9。これらの利点により、H. mediterraneiは、スケーラブルな廃棄物ベースのバイオプラスチック生産の理想的な候補として位置付けられています。
既存の研究では、H. mediterranei 6,10,11,12,13,14,15,16,17,18 による PHA 発酵のために、チーズ ホエー、オリーブ工場の廃水、農工業残渣などのさまざまな廃棄物が調査されています.廃棄物組成の高変動性は、微生物の同化11,17,19,20の前に、酵素加水分解、酸加水分解、または熱処理などの異なる前処理戦略を必要とする重大な課題を提示する。ここでは、アレスト嫌気性消化(aAD)は、多様な食品廃棄物を均質な揮発性脂肪酸(VFA)に富む消化物に変換することにより、スケーラブルなソリューションを提供し、H.mediterraneiによるPHA合成の直接の前駆体として機能します21,22。このプロセスにより、原料の一貫性が向上し、基質のばらつきが軽減されると同時に、微生物の発酵効率が向上します。
その可能性にもかかわらず、H. mediterranei 23,24,25 による一般的な食品廃棄物からバイオプラスチックへの変換のために、aAD と微生物 PHA 発酵を統合したこの 2 段階のプロセスを成功裏に実証した研究はごくわずかです。この研究では、食品廃棄物の前処理、半連続aADによるVFA生産、およびPHA生産のためのH.mediterraneiの純粋培養発酵をカバーする詳細なステップバイステップのプロトコルを提供します。さらに、以前の研究では、H. mediterraneiからの水ベースのPHA抽出が検証されていますが、この方法を使用してPHA回収効率と純度を定量化した研究はありません11,18。この研究では、水による浸透圧溶解を利用したケミカルフリーのPHA回収方法を実証し、従来の次亜塩素酸ナトリウム(NaClO)ベースのPHA回収方法と比較してその回収効率を定量化することにより、このギャップに対処します26。さらに、この研究では、水で回収されたPHAの純度を評価し、スケーラブルなバイオプラスチック生産に対するその有効性を包括的に評価します。
実験室規模の実現可能性と産業実装との間のギャップを埋めるために、このプロトコルは、パイロットスケールのaADおよびPHA発酵と、バイオプロセシングおよび大規模微生物発酵で広く使用されている技術である細胞分離のためのディスク遠心分離を組み込んで、産業アプリケーションでのスケーラビリティを実現するように設計されています27。この方法は、食品廃棄物からバイオプラスチックへの変換を最適化することで、大規模な廃棄物の価値化の工業化をサポートし、循環型バイオエコノミーの取り組みを推進します。廃棄物由来の原料、好塩性発酵、および環境に優しいPHA回収戦略の統合により、廃棄物からバイオポリマーへの効率的な変換が可能になり、化石燃料ベースのプラスチックへの依存を減らしながら、持続可能なバイオプラスチック生産を促進します。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
1. 食品廃棄物の収集と準備

図1:均質化前と均質化後のレストランの食品廃棄物の視覚的比較。 写真は、(A)生の食品廃棄物と(B)均質化された食品廃棄物スラリーを示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
2. aADによるVFA制作
(1)
(2)
図2:VFA製造と固液分離に使用される装置。 (A)100LパイロットスケールのaAD消化器。(B)ディスク遠心分離機の分離タンクからそれぞれのバケツへの上清と固形物の排出。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| パラメーター | 食品廃棄物 |
| TS (%) | ~16.5 |
| VS (%) | ~14.5 |
| C:N | ~17:1 |
表1:食品廃棄物の例の特徴。
| 歩 | メディア | 温度 | 目的 | 期間 (分) | 吐出量(L) | 筆記 | ||
| 1 | 水 | 寒い | プライマリフラッシング用 | 5 | 1 | 使用済みの水は通常、排水されます。 | ||
| 2 | 水 | ホット (70 °C) | 酵母の魔法瓶溶解用(該当する場合) | 5 | 1 | 使用済みの水は通常、排水されるか、循環されます。 | ||
| 3 | 2% NaOH溶液 | ホット (70 °C) | タンパク質沈着物の溶解用(該当する場合) | 20 | 1 | 溶液は通常循環しています。 | ||
| 4 | 水 | ホット (70 °C) | フラッシング用 | 5 | 1 | 使用済みの水は通常、排水されるか、循環されます。 | ||
| 5 | 1%硝酸溶液 | ホット (70 °C) | 無機堆積物の溶解に | 10 | 1 | 軟水を使用する場合、酸洗浄は年に数回で済みます。この場合、リターンはドレインに渡すことができます。硬水を使用する場合、CIPごとに酸洗浄が必要になることがあります。この場合、循環システムを使用する必要があります。 | ||
| 6 | 水 | ホット (80–95 °C) | フラッシングおよび滅菌用 | 5 | 1 | このステップからの放電の濁度が高い場合は、ステップ2から繰り返します。 | ||
表2:ディスク遠心分離機の洗浄手順。
3. VFAを豊富に含む消化物上清を用いたPHA発酵
×量(3)
図3: H.mediterraneiによるPHA生産の発酵前および発酵後のフラスコ。 (A)インキュベーション/発酵前の食品廃棄物消化物上清から作られたフラスコ内の培地。(B)発酵後のピンクがかったPHAに富む H.mediterranei 培養。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:50LパイロットスケールPHA発酵槽 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
4. PHAダウンストリームの回復

図5:分離された塩辛い上清(左)と細胞(右)この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6:PHA粉末(A)粗PHA粉末と(B)精製PHA粉末。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
5. 分析方法
(4)
(5)アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
aADからの食品廃棄物特性とVFA生成
調製済み食品廃棄物スラリー中のTS、VS、およびC:N比の例を 表1に示します。食品廃棄物の組成には、サンプリング源や時間によって固有のばらつきがあるため、TS、VS、C:N比の値の変動が予想されます。ばらつきは許容できるが、定期的なTS、VS、およびC:N比の測定は、プロセスモニタリング、微生物バランス、および全体的なaADシステムの最適化に不可欠である37。
VFA濃度は、aAD消化器の操作の安定性と効率の重要な指標として機能します。 表 3 は、例として 4 つの運用サイクルの VFA データを示しています。これらのサイクル中、VFA濃度は4.13 ± 0.05 g HAc/Lで安定しており、aAD発酵槽がVFAを安定して生成できることが確認されました。この値は、文献22で報告されている値に匹敵し、パイロットスケールのaADシステムの運...
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
aADからのVFA制作
VFAは、H. mediterraneiが食品廃棄物をPHAに変換する際の重要な前駆体として重要な役割を果たしています。したがって、aAD中に高いVFA濃度を維持することが不可欠です。aAD25でのVFA生産を強化するために、いくつかの戦略を採用することができます。効果的なアプローチの一つは、理想的な期間が8日以下のSRT最適化であり、これはメタン生成菌のウォッシュアウトを促進しながら加水分解と酸生成を最大化し、それによって過剰なVFA消費を防ぐ46。好熱条件(45-55°C)は基質の可溶化と酸性化を改善し、中温条件と比較してVFAの生産性を高めることができるため、温度調節は別の効果的なアプローチである47。さらに、2-ブロモエタンスルホン酸などの化学的阻害剤の添加、またはpH 4での短期間のpHショックは、主要な微生物経路を標的とするか、メタン生...
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
著者は何も開示していません。
この研究は、エネルギー省-エネルギー効率および再生可能エネルギー局(Prime Award No.DEEE0009268)および米国農務省国立食糧農業研究所(賞番号2023-79000-38973)。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 空気 | エアガス | AI UZ300 | GC操作に使用 |
| ポンプ座 | クラウドレイ | ハイレア ACO-009D | |
| 塩化アンモニウム | アクロスオーガニック | A0396560 | |
| オートクレーブ | ステリス | AMSCOラボ250 | ATCC培地調製に使用 |
| 秤 | メトラー・トレド | 00 ME204TE | |
| ミキサー | ヴェヴォル | IB750LV+BLD300+WB-1 | |
| バケツ | ロウズ | モデル 50640 | 5ガロンBPAフリープラスチック製一般バケツ |
| 塩化カルシウム二水和物 | アクロスオーガニック | A0362932 | |
| クロロホルム | ミリポアシグマ | C2432 | |
| デシケーター | TS、VS、VSS測定に使用できる任意のタイプ | ||
| 消化チューブ、PTFEライナー付きスクリューキャップ | ミリポアシグマ | CLS982613 | |
| デジタルリアクターブロック | ハッハ社 | DRB200 | Hach VFA定量法で使用 |
| デジタルスターラー | サイロゲックス | SCI550-プロ | |
| ディスク遠心分離機 | アルファ・ラバル株式会社 | クララ 20 | |
| 三角フラスコ | アマゾン | B07V3JPQMM | |
| エタノール | アマゾン | B09DGVL4ML | |
| 凍結乾燥機 | ラボコンコ | 10030133、1027319、0109621 | FreeZone 2.5リットルフリーズドライシステム |
| ヒュームフード | ケワウニーサイエンティフィックコーポレーション | シュプリームエアLV | |
| 炉 | サーモサイエンティフィック | モデルF30428C | |
| ガスクロマトグラフィー(GC) | アジレント | モデル8890 | |
| Haloferax mediterranei | ATCCの | 33500 | |
| 水素 | エアガス | ハイUHP300 | GC操作に使用 |
| ナイフ | 食品廃棄物の削減に使用されるあらゆるタイプ | ||
| 潤滑油 | フィッシャーサイエンティフィックカンパニー | NC9844626 | |
| 塩化マグネシウム六水和物 | フィッシャーサイエンティフィックカンパニー | BP214-500 | |
| 硫酸マグネシウム七水和物 | ミリポアシグマ | M1880型 | |
| メトナール | ミリポアシグマ | 34860 | |
| 安息香酸メチル | ミリポアシグマ | 93583 | PHA定量の内部標準として使用 |
| マイクロプレートリーダー | BioTek シナジー | シナジーH1 | |
| 窒素 | エアガス | NIのUHP300 | GC操作に使用 |
| オーブン | サーモサイエンティフィック | オーム750 | |
| 蠕動ポンプ | シンプリーポンプ株式会社 | PM6000 交流 | 優れた空運転能力を備えた高流量自吸式ポンプで、高粒子スラリーを処理でき、1/8インチの壁チューブ用に設計されています。 |
| pHメーター | フィッシャーサイエンティフィックカンパニー | AE150 | |
| PHA規格 | ミリポアシグマ | 403105 | |
| パイロットaAD消化槽 | クエーサーエネルギーグループ、インディペンデンス、オハイオ州、米国 | 総容量100 L、作業容量80 L のステンレス鋼発酵槽。 | |
| パイロットPHA発酵槽 | マヌカツリー | SF-50l ISO 9001 CE | 二重層ジャケット付きガラスリアクター |
| 塩化カリウム | ジーバイオサイエンス | 162006 | |
| ポンプチューブ | 内径が1/8インチ、外径が3/8インチの任意のブランドのシリコンチューブ | ||
| 炭酸水素ナトリウム | フィッシャーケミカル | 241787 | |
| 臭化ナトリウム | カロライナ | 21139-45 | |
| 塩化ナトリウム | アマゾン | B0787CFHF3 | |
| 水酸化ナトリウム、ペレット | フィッシャーバイオ試薬 | 236088 | |
| 次亜塩素酸ナトリウム | ミリポアシグマ | 425044 | |
| Sorvall LYNX 4000 超高速遠心分離機 | サーモサイエンティフィック | 75006580 | 下流のPHA回収におけるPHA顆粒の収集に使用されます |
| 分光光度計 | ハッハ社 | DR3900 | Hach VFA定量法で使用 |
| 硫酸 | ミリポアシグマ | 258105 | |
| シリンジフィルター | アマゾン | B06X6GTKVY | |
| TOC分析装置 | 島津製作所 | 型式 TOC-LCSN | |
| 揮発性酸TNTplusバイアルテスト | ハッハ社 | TNT 872 | 50〜2,500 mg/Lの酢酸の範囲でVFAを測定できます。 |
| 湯沸かし器 | ボッシュ株式会社 | トロニック 3000 T 7 ガロン (ES8) | |
| 酵母エキス | フィッシャーサイエンティフィックカンパニー | AAJ6028736 |
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。