マイコプラズマ肺炎核酸と薬剤耐性遺伝子の検出

サマリー

このプロトコルは、 マイコプラズマ 肺炎感染症を検出し、抗生物質耐性を特定するための迅速かつ信頼性の高い方法を提供します。これは、開業医が適切な治療法をより迅速に選択できるようにし、肺炎患者のケアを改善し、抗生物質のより良い使用をサポートするのに役立ちます

要約

マイコプラズマ肺炎 (Mp) は、小児集団における市中肺炎 (CAP) の原因となる最も一般的な病原体の 1 つです。 マイコプラズマ 肺炎耐性遺伝子の検出は、MP 感染症の正確な臨床診断と治療のための強力な技術サポートと理論的基盤を提供します。Mp感染における薬剤耐性の正確な診断と評価は、臨床治療に不可欠です。 マイコプラズマ 肺炎の一般的な検出方法には、培養、抗体検出、分子生物学ベースのアッセイなどがあります。Mp培養は診断のゴールドスタンダードですが、特定の培地を必要とし、時間がかかり、感度が低くなります。抗体ベースのMp検出は広く使用されています。ただし、感染の初期段階で偽陰性が発生する可能性があります。分子生物学ベースの検出は、迅速なターンアラウンド、低汚染リスク、高感度、高い特異性を提供し、サンプル採取のタイミングや免疫状態に制限されません。したがって、 マイコプラズマ 肺炎感染症を診断するための新しいゴールドスタンダードとして認識されています。マクロライド剤は、小児の Mp 感染症の第一選択治療法です。しかし、小児の気道感染症におけるマクロライドの広範な使用により、薬剤耐性 マイコプラズマ 肺炎感染症の発生率が増加しています。耐性株に感染した患者は、敏感株に感染した患者と比較して、発熱期間が有意に長く、入院期間が長くなり、投与後の発熱が長引くことが経験されます。現在までに同定された変異部位には、2063、2064、2067、および2617が含まれます。中国では、点突然変異は2063位と2064位でのみ記録されており、2063位でのAからGへの置換が最も一般的です。これらの部位では、蛍光プローブ技術と組み合わせたポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) を使用して、ヒト喀痰サンプル中の マイコプラズマ 肺炎の核酸と薬剤耐性変異を検出しています。 マイコプラズマ 肺炎耐性遺伝子の検出は、Mp 感染の正確な診断と効果的な治療のための重要な技術サポートと理論的根拠を提供します。

概要

マイコプラズマ肺炎 (Mp) は、細菌とウイルスの中間位置に位置する、独立した生存が可能な最小の病原性微生物です。これは主に呼吸器飛沫またはエアロゾルによって播種され、小児の市中肺炎 (CAP) に関連する 2 番目に多い病原体を構成し¹、CAP インスタンスの 20% から 40% を占めます²。Mp は、細胞壁がないため、ペニシリンやセファロスポリンなどのβ-ラクタム系抗生物質に対して固有の耐性を示し、これらの抗生物質は細胞壁合成を妨害することで標的となります。Mp 感染症の主な治療法は、マクロライドやテトラサイクリンなどのタンパク質合成を妨げる薬剤と、テトラサイクリンやフルオロキノロンなどの DNA 複製を阻害する医薬品で構成されます ^3,4,5。したがって、抗生物質の賢明な適用を知らせるためには、Mp の迅速な検査室での同定が不可欠です。Mp の最新の実験室検出法には、単離と培養、抗原検出、抗体検出、遺伝子診断技術が含まれます。

従来の検出方法として、分離と培養は、 マイコプラズマ 肺炎感染症を診断するための決定的な標準であり続けています。喉のぬぐい液または喀痰検体から Mp を培養することは信頼できる診断技術であることを観察しました⁶。このアプローチは、Mp の厳格な文化的前提条件、培養期間の延長、通常陽性検出率の低さなど、かなりの障害に遭遇し、日常的な臨床使用を制限します。Mp抗原の検出は、Mp特異的抗体に依存します。Miyashita らは、二重抗体サンドイッチ ELISA のコーティング剤としてさまざまな Mp 株のモノクローナル抗体を使用し、PCR⁷ を使用してその有効性を評価しました。調査結果は、2つの方法論の間に実質的な違いはないことを明らかにしました。しかし、特異性が高く力価の高いモノクローナル抗体の必要性により、この方法の広範な実施が制限されています。

Mp 感染後、免疫系は特異的な IgM および IgG 抗体を生成します。IgM 抗体は通常、感染後 1 週間以内に検出可能になり、3 週間から 4 週間でピークに達するため、早期感染の貴重な診断指標となります。ただし、抗体レベルが低下するため、初期段階では偽陰性の結果が生じる可能性があります⁸。逆に、IgG抗体は後に現れ、通常は以前の感染を意味します^9,10。Mpの血清学的検出は、非特異的抗体アッセイと特異的抗体アッセイに分類されます。非特異的抗体検査は管理が簡単ですが、リケッチアやアデノウイルスなどの他の病原体による感染も風邪凝集素レベルを上昇させ、偽陽性の結果を引き起こす可能性があるため、その特異性は限られています。特異的抗体アッセイには、補体固定試験、粒子凝集試験、間接赤血球凝集試験、間接免疫蛍光試験、酵素結合免疫吸着試験(ELISA)が含まれます。ELISA は、その確立された技術と商業的アクセス性により、中国で広く利用されており、高感度と操作の簡素化を提供し、それによって日常的な臨床診療で Mp 感染症を診断するための実用的で信頼できる方法として機能します¹¹。

リアルタイム蛍光定量PCRは、迅速な処理時間、高い特異性、堅牢な感度、および交差反応性の欠如によって区別されます。この方法は、喀痰、咽頭スワブ、または気管支洗浄液のサンプル中のMp DNAを同定し、反応ごとに1〜100 ngのDNAを必要とします。検出はリアルタイムPCR装置を使用して実行されました。DNAテンプレートは高温で変性を経験し、続いてプライマーアニーリングと蛍光プローブハイブリダイゼーションが続きます。遺伝子増幅技術により、極低濃度の核酸フラグメントを短時間で数百万コピーに複製し、≥10 CFU/mL¹² の検出感度を達成します。従来のPCRと比較して、リアルタイム蛍光定量PCRは、汚染リスクを低減しながら、ハイスループットで自動化された分析を可能にします。したがって、臨床現場で直接 Mp 検出に好まれる技術として浮上しています¹³。感度が高いため、偽陽性または偽陰性の結果が生じる可能性のある汚染を回避するために厳格な対策が必要です。

臨床治療では、マクロライドはマイコプラズマ肺炎肺炎 (MPP) の主要な治療介入を構成します。抗生物質の過剰使用と不適切な使用により選択圧が課され、マクロライド耐性 Mp の出現につながりました。この耐性は、難治性 MPP の大きな原因となります。マイコプラズマ肺炎におけるマクロライド耐性は、東アジア、特に中国と日本で顕著に高まっていますが、ヨーロッパと米国では比較的低い耐性率を示しています。小児患者は一般に成人に比べて抵抗率が高いため、より厳しい監視が必要です¹⁴。2000年以降、マイコプラズマ肺炎感染症(MRMPI)の発生率は、世界規模で、特に東アジアで大幅に増加しています。中国では、MRMPI 株が症例¹⁵ の 69% から 95% を占めており、重篤な疾患、治療の失敗、合併症、および長期的な後遺症に大きく寄与しています。研究によると、23S rRNA 遺伝子の変異は標的部位へのマクロライド結合を阻害し、その結果、薬効を低下させます。頻繁な突然変異遺伝子座には、位置 2063、2064、2067、および 2617 が含まれます。中国では、変異は位置 2063 と 2064^16,17 でのみ確認されています。2016年の調査によると、北京、ハルビン、上海、新疆ウイグル自治区のマクロライド耐性率は66.7%から86.7%の間で変動したのに対し、南京は20%と低い割合を示しました¹⁸。マクロライド耐性株はさまざまな地域で出現しており、耐性率は次のように報告されています:フランスで8.3%〜9.8%、ドイツで3.0%〜3.6%、米国で8.2%、デンマークで0.9%〜2.9%、カナダで12.1%、イタリアで20%、イスラエルで22%、スペインで8%、英国で9.3%^{19、20、21、22、23、24、25、26、27}.この傾向は、マクロライド耐性の世界的な急増を浮き彫りにしています。2008年、Hindleyらは、マクロライド耐性マイコプラズマ肺炎の46例を報告し、40例がA2063G変異を示し、1例がA2063C変異を示し、5例がA2064G変異を示しました²⁸。同等の耐性変異が日本と米国で確認されており、一次変異は2063位と2064位で発生しています²⁹。研究は、突然変異部位と薬剤耐性表現型との関係を示唆しています:A2063G変異は14員マクロライド(ML)に耐性を与え、A2064G変異は14員および16員MLの両方に耐性を与え、C2617Gは14員および15員MLに耐性を与え、A2067G変異は16員MLに耐性を与えます³⁰。Mp耐性のモニタリングは、薬剤耐性感染症の早期発見と臨床治療の選択に情報を提供するために極めて重要である。研究によると、in vitro 抗菌薬感受性試験は臨床薬の有効性を予測できることが示されています³¹。2011 年、米国臨床検査基準協会は、マクロライド耐性を評価するための最小阻害濃度 (MIC) を確認するための微量希釈法を提唱するガイドラインを公布しました³²。ただし、MIC の測定には数週間かかる場合があり、それによってリアルタイムの抗生物質療法を指示する際の臨床的有用性が制限されます。

サンガーシーケンシングは、Mpの23S rRNA遺伝子の変異を同定するための直接的な手法です。この方法では、蛍光標識ヌクレオチドと電気泳動分析を使用して DNA 配列を確認し、Mp 遺伝的変異の同定を容易にします。サンガーシーケンシングは、複数の変異を同時に同定し、耐性株と感受性株の比率を定量化することができますが、労働集約的で時間がかかるため、その臨床的有用性が制限されます^33,34。対照的に、パイロシーケンシングは、ヌクレオチド取り込み中のピロリン酸放出を特定することにより、DNA 配列の変異をより正確に評価します。この方法では、MRMPI株を同定し、サンガーシーケンシングよりも高い精度で臨床サンプル中の耐性株と感受性株の比率を定量化できます。さらに、パイロシーケンシングにより、個々の患者の縦断的モニタリングが可能になり、耐性の発生をリアルタイムで評価し、治療の変更を通知することができます³³。しかし、その臨床応用は、特殊な装置、熟練した人員、および長期にわたる処理時間の必要性によって制約されています。

P1遺伝子の制限断片長多型(RFLP)解析に基づいて、MpはI型(さらに5つのサブタイプに分けられる:1a-1e)とタイプII(さらに3つのサブタイプに分けられる:2a-2c)の2つのタイプに分類される。この検査は、マイコプラズマ肺炎の 8 つの遺伝子サブタイプを検出できます ³⁵。この方法は、小児喀痰検体中のマイコプラズマ肺炎およびマクロライド耐性変異 (23S rRNA 2063 (A:G) および 2064 (A:G) 変異部位) の定性的同定を容易にし、マイコプラズマ感染症および抗生物質耐性サーベイランスのための迅速かつ簡単な補助診断手段を提供します。

プロトコル

すべての研究プロトコルは、河源人民病院の医療倫理委員会によって審査され、承認されました (承認番号。YXYJLL-LW2025001)。すべての患者は、参加前に書面によるインフォームドコンセントを提供しました。

1. 検体採取

注:サンプル収集中は無菌技術を維持する際に注意してください。

1. 患者または疑いのある患者の喀痰の検体を採取します。患者の病気の発症から3日以内にサンプルを採取します。
2. 患者に、水で口をすすぎ、深呼吸し、5秒間息を止め、徐々に息を吐くように指示します。
3. 患者にもう一度深く息を吐き、痰を排出し、指定されたプラスチックカップに入れ、蓋をしっかりと閉めるように依頼します。喀痰は、室温(RT)で速やかに臨床検査室に届けるべきです。サンプルを2〜8°Cで冷蔵庫に保管します。

2. 増幅試薬の調製

1. PCRラボの試薬調製エリアで、バッファー、プライマープローブ、およびキットの水を-20°Cの冷凍庫から取り出した後、4°Cで解凍します。酵素を取り除き、振とうとやさしく混合し、1,006 x g で10秒間遠心分離します。
2. 無菌ヌクレアーゼフリー遠心分離管を取り出し、ラベルを付け、 表1に概説するように、各個体ごとに反応システムを準備します。PCR反応の総数は、サンプルの合計、1つの弱いポジティブ品質管理、1つの品質管理製品W、および1つのネガティブ抽出コントロールの合計に等しくなければなりません。
3. 各試薬の量を決定し、適切なサイズの遠心分離管に組み込み、完全に混合し、低速で短時間遠心分離します。各PCR反応チューブに20 μLの試薬を分注し、サンプル処理エリアに移します。

3. サンプル処理

1. 1 mLの喀痰サンプルを2 mLの喀痰消化バッファーで処理し、ボルテックスで完全に混合し、完全な液化が達成されるまで30分間インキュベートします。
2. サンプル量に基づいて、核酸抽出プレートの1^列目 と7^列 目に5μLの内部標準を順次添加し、続いて200μLの液化サンプル、生理食塩水、MM弱陽性品質管理を連続して添加します。
3. 自動核酸抽出装置を使用して核酸抽出プレートを回収します。抽出プレートの6列目と12列目に下流アッセイを行った後、抽出した核酸を加える。
4. サンプルの追加: PCR ラボのサンプル前処理エリアで、抽出した核酸を抽出プレートの 6^番 目と 12^番目の 列に追加します。続いて、調製したサンプル核酸5.0 μLを、PCR反応混合物(サンプル、強・弱ポジティブ品質管理、品質管理W、抽出ネガティブコントロールを含む)を含むPCR反応チューブに移します。
5. PCR反応チューブ液を固定し、直ちに遠心分離を行い、液が適切に密閉され、気泡がないことを確認します。

4. 増幅

1. 反応チューブを蛍光PCR検出器に挿入し、 表2のようにサイクルパラメータを設定します。
2. FAM(2063または2064 A:G変異)、VIC(マイコプラズマ肺炎)、およびCY5(内部標準)の蛍光シグナルを取得し、データ収集は64°Cに設定されます。

5. データ分析

注:この研究では定量的リアルタイムPCR(qPCR)が採用され、代表的な結果は、 マイコプラズマ肺炎の2063または2064の位置でのA:G耐性関連変異を示しています。陽性反応が出た患者は、臨床治療においてマクロライド系抗生物質を避けるべきです。

1. 反応後、装置は自律的に分析し、結果をアーカイブします。ネガティブコントロールの標的遺伝子がFAM蛍光Ct ≥ 35.33、VIC蛍光Ct ≥ 35.01を示し、品質管理の標的遺伝子WがFAM蛍光Ct ≥ 35.33、VIC蛍光Ct ≥ 35.01を示していることを確認します。弱陽性品質管理製品におけるFAMおよびVIC蛍光のCt値は、29.00〜34.00の範囲でした。
2. 一般に、内部標準のCt値は35.00≤です。特徴的なS増幅曲線が観察されたが、標的遺伝子の濃度が上昇して内部標準が増幅されない場合は、陽性サンプルとして直接報告するか、10倍のグラジエント希釈によってサンプルを再評価します。
3. UNDECTまたは典型的なS型増幅曲線がないことを示すサンプルを陰性として分類します。
4. FAM蛍光(2063または2064 A:G変異)Ct≥35.33、VIC蛍光(マイコプラズマ肺炎)Ct≥35.01、または典型的なS型増幅曲線がない場合、サンプルを陰性とみなします。Cet 値が 表 3 を満たし 、特徴的な S 型増幅曲線を示す場合、サンプルは陽性です。
   注: サンプル検出の結果は、サンプルの収集、処理、輸送、保存の品質によって異なります。エラーがあると、偽陰性の結果が生じる可能性があります。サンプル処理中に相互汚染を制御しないと、偽陽性の結果が生じる可能性があります。

結果

喀痰サンプルの液化、核酸抽出、および蛍光PCR増幅に続いて、増幅曲線の分析後にベースラインの開始値、終了値、および閾値を変更しました。開始値は 3 で、終了値は 20 でした。

この実験の代表的な結果は、Mp核酸陽性であり、2063または2064部位でA:G耐性変異が発生し、Mp感染とマクロライド系抗生物質に対する耐性が示唆された。

品質管理 W の増幅曲線は、しきい値線を下回るように校正されました。陰性対照の標的遺伝子は、FAM蛍光Ct>35.33、VIC蛍光Ct>35.01でした。品質管理Wの標的遺伝子は、FAM蛍光Ct>35.33、VIC蛍光Ct>35.01でした。弱陽性品質管理におけるFAM蛍光およびVIC蛍光のCt値は、29.00〜34.00の範囲でした。Mpおよび薬剤耐性遺伝子に関する所見は、陰性...

ディスカッション

PCR とその誘導技術は、 マイコプラズマ 肺炎 (MP) における薬剤耐性の同定、タイピング、および検出において、血清学的方法と比較して優れた感度と特異性を示しています。さらに、PCR ベースの技術は操作の容易さと経費の削減を実現し、日常的な臨床診断の実行可能な代替手段となります³⁶。Mp は CAP に関連する注目すべき病原体であり、かなりの有病率を示しています³⁷。適切な抗生物質を選択すると、回復が促進され、副作用の可能性が減ります。マクロライドは、特に小児患者における肺炎 菌の一次治療法として機能します。中国における肺炎 菌 の有病率の増加は、臨床管理に重大な課題をもたらしています³⁷。

この研究では、蛍光プローブ技術と組み合わせて PCR を使用して、ヒト喀痰サンプル中の マイコプラズマ 肺炎...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
自動核酸抽出装置	広州大安遺伝子有限公司	スマート32
フィルターのヒント	コーリングライフサイエンス株式会社	29822001	0-10µL
フィルターのヒント	コーリングライフサイエンス株式会社	03023001	1-50&マイクロ;L
フィルターのヒント	コーリングライフサイエンス株式会社	05623001	5-300&マイクロ;L
マイクロチューブ	コーリングライフサイエンス株式会社	14124934	1.5ミリリットル
マイコプラズマ肺炎 核酸・薬剤耐性変異部位検出キット(蛍光PCR法)	江蘇モグラバイオテクノロジー株式会社	20241111
核酸抽出試薬(磁気ビーズ法)	Shengxiang Biotechnology Co., Ltd.	G24004
PCRチューブ	DNバイオテック(香港) 株式会社。	6121003	0.2ミリットル
リアルタイム蛍光PCR装置	バイオラッド	CFX96