Chromobacterium violaceumにおけるビオラセインの定量と生理活性化合物による阻害

サマリー

このプロトコルの目的は、生理活性化合物によるクオラムセンシング阻害を評価するための代用として、 クロモバクテリウム・ビオラセウム ATCC 12472によるビオラセイン産生を定量化することです。

要約

細菌はクオラムセンシング (QS) として知られるシステムを通じて通信し、細胞密度の変化に応じて行動を調整できます。このプロセスには、通常自己誘導物質 (AI) と呼ばれる小さな細胞外シグナル伝達分子の生成、分泌、検出が含まれます。QS は、バイオフィルムの形成と拡散、群がる運動性、病原性因子の産生、抗生物質耐性、生物発光など、幅広い遺伝子と機能を調節します。QS 阻害は、従来の抗生物質と比較して選択圧が低いため、抗生物質耐性菌に対する有望な抗病原性戦略となっています。細菌 Chromobacterium violaceum ATCC12472では、 Aliivibrio fisheriのLuxI / LuxR型QSタンパク質と相同であるQSタンパク質CviI / CviRが、紫色色素ビオラセインの産生に関与する遺伝子を含む多くの遺伝子を制御しています。 C. violaceum は、QS 阻害研究、特にビオラセイン産生の阻害においてバイオセンサー株として広く使用されています。多くの化合物は、LuxIまたはLuxR相同体のいずれかのQSタンパク質に結合し、QS回路を破壊することにより、QSを阻害する可能性があります。このプロトコルは、 C. violaceum ATCC 12472によって産生されるビオラセインを定量する方法と、細菌の増殖に影響を与えない濃度の生理活性化合物によるその阻害について説明します。ここで説明するアッセイは、試験された化合物によるビオラセイン産生の有意な減少を示しています。この研究は、このプロトコルを使用して QS 阻害研究で有望な候補をスクリーニングする可能性を強調しています。

概要

細菌は QS として知られるシステムを介して通信でき、細胞密度の変化に応じて細菌の行動を協調的に調節できます。このプロセスには、自己誘導物質とも呼ばれる小さな細胞外シグナル伝達分子の産生、分泌、および検出が含まれ、異なる種間および同じ種内の両方のコミュニケーションを可能にします^1,2。

このコミュニケーションは、バイオフィルムの形成と分散、運動性と接着、細胞増殖、エキソ酵素とシデロフォアの合成、胞子形成、耐酸性、水平遺伝子導入、抗生物質耐性、生物発光、エキソ多糖類の産生などの遺伝子と機能を調節することができます^3,4,5.QS制御表現型の関連性を考えると、この細胞通信を妨害できるシステムの開発に大きな関心が寄せられています。QSシグナル伝達の阻害は、クオラムクエンチング(QQ)⁶とも呼ばれます。QQは、自己誘導物質の合成の阻害剤、これらのシグナルの酵素的不活性化、およびこれらの分子に拮抗作用を有する分子など、いくつかの方法で発生する可能性があります^4,7。

抗生物質耐性の脅威の増大により、病原体を直接殺すことなく細菌のコミュニケーションを妨害するクオラムセンシング阻害剤(QSI)などの代替療法の研究が推進されています。これらの化合物は、抗生物質と組み合わせると相乗効果を示し、細菌の感受性を高め、抗生物質の投与量を減らすことができ、これは耐性の発生を遅らせるための重要な戦略です。たとえば、レスベラトロールとカナマイシンは一緒にエア ロモナス・ハイドロフィラの 成長を遅らせます⁸ 一方、N-アセチルシステインはトブラマイシンと相乗効果を発揮して 緑膿菌 のバイオフィルムを破壊します⁵。

抗生物質の過剰使用と医薬品開発の停滞により、QS 阻害などの抗病原性アプローチはパラダイム シフトをもたらします⁹。生存率を標的にする代わりに、病原性因子を標的にし、細菌の害を軽減し、宿主免疫や抗生物質に対してより脆弱にします⁵。この戦略は、従来の抗生物質と比較して選択圧が弱く、耐性を最小限に抑え、有益な微生物叢を保存します^10,11。有望な検査結果にもかかわらず、臨床試験による実際の検証は十分に検討されていないままです¹².QS阻害は抗生物質を補完する有望なものですが、その実践への応用には、複雑な生物学的環境における有効性と安全性のさらなる証拠が必要です。

C. violaceum は、滑らかで光沢のある表面を持つ紫色のコロニーを形成するベータ プロテオバクテリウムです。それらは通性嫌気性桿菌であり、胞子を形成しません¹³.C. violaceumのQSのメカニズムには、タンパク質CviI(LuxIと相同)およびCviR(LuxRと相同;図1)。ビオラセインは、真菌、細菌、線虫、ウイルスなどのさまざまな生物に対して、特に個体群密度が非常に高く、栄養素がほぼ枯渇する微生物の定常成長期に殺生物活性を示します。その結果、ビオラセイン生産は、微生物コロニーの生存を延長するための競争戦略と見なすことができます¹⁴。

植物は二次代謝に由来する化合物を生成し、不利な環境に適応する能力を高める上で重要な役割を果たします。アルカロイド、フェノール、フラボノイド、キノン、タンニン、テルペン、レクチンなどのこれらの代謝産物は、草食動物や微生物に対する防御機構として広く認識されています¹⁵。QSIとしての植物由来化合物の可能性は、植物と微生物の間の動的な相互作用により、特に注目を集めています。根圏における植物と病原体の相互作用に関する研究は、植物が病原体に対する阻害剤として作用できる生理活性化合物を分泌することにより、細菌の自己誘導物質に応答できることを実証しました¹⁶。

本研究では、生理活性化合物によるバイオラセウムの阻害に着目し、 C. violaceumによるビオラセイン産生を定量化するための実用的な方法を記述する。この方法は、QSI活性の可能性がある化合物を選択するための初期スクリーニングツールとして機能します。グラム陰性病原菌に対する将来の治療法開発のための迅速かつ実用的なアプローチを提供します。この標準化されたプロトコルは、以前の研究では行われていない詳細な説明を提供し、将来のさまざまな研究間の比較を容易にするため、有用です^17、18、19。

プロトコル

1.培養準備(図2)

1. C . violaceum ATCC 12472の5 mL培養物をLuria Bertaniブロス(LB:トリプトン10 g / L、酵母抽出物5 g / L、5g / L NaCl)で30°Cで30°Cで24時間増殖させます。
2. 培養液を OD₅₉₅ の 0.1 in LB ブロスに調整し、約 1 x 10⁸ CFU/mL に相当します。

2. 化合物の調製

1. 平底の96ウェルプレートに、以下の説明に従って、連続希釈計算に従ってLBブロスと生理活性化合物を加えます。溶解度に応じて、生理活性化合物は通常、純粋なDMSOまたはDMSO:水(1:1)溶液で希釈されます。
   注:QSIを評価する方法論では、使用される濃度が最小阻害濃度(サブMIC)未満であること、つまり細菌の増殖に影響を与えないことを確認することが重要です。したがって、異なる濃度で成長曲線アッセイを実施して、化合物が微生物の生存率ではなく細胞間コミュニケーションを特異的に阻害することを確認することをお勧めします。このプロトコルで使用される試験された生理活性化合物の成長曲線アッセイについては、 補足図1 を参照してください。
2. ウェル中の生理活性化合物濃度を計算するには、ファルネゾールとリナロールのストック溶液を20 mg / mL、ウェル内の目標濃度を200 μg/mL、およびストック溶液中に2.5 mg / mL、ウェルで25 μg/mLのレスベラトロールを考慮して、次のように計算を実行します。
   C₁V₁ = C₂V₂
   20,000 μg/mL x V₁ = 200 μg/mL x 200 μL
   V₁ = 40,000/20,000 μL
   V₁ = 2 μL
   ここで、C₁ = 原液濃度 (20 mg/mL、20,000 μg/mL に相当)。V₁ = 添加する原液の量。C₂ = 所望の最終濃度 (200 μg/mL);V₂ = ウェル内の最終容量(200 μL)。

3. 連続希釈²⁰ とプレート調製(図3)

注:連続希釈は、試験された化合物の濃度範囲を迅速に評価するために使用されます。このプロセスでは、化合物は一定の比率(この場合は1:2)で連続的に希釈されます。各希釈により、化合物の濃度が以前の濃度と比較して半分に減少し、その結果、濃度が減少する範囲が生じます²⁰。

1. 連続希釈の最初の列に、196 μL の LB ブロスを追加します(この例では、列 3、5、および 7)。連続希釈の次のウェルに、100 μLのLBブロスを追加します(この場合は、4、6、および8列目)。
2. 次に、前のステップ(2.2)で計算した生理活性化合物の2倍の量を加えて、連続希釈を行います。計算の結果、最初のウェルで最終濃度を達成するために各試験化合物が 2 μL になったため、化合物を 4 μL 添加します(列 3、5、および 7)。
3. ウェルの総容量の半分(100 μL)を次のカラム(この場合はカラム4、6、8)に移し、連続希釈を行う場合は、最後の目的の濃度まで移します。移送する前に内容物をよく混ぜることを忘れないでください。
   注:この実験セットアップでは、簡単にするために2つの濃度のみを使用し、すべての化合物が1つのプレートにのみ収まります。
4. 各化合物の濃度ごとに少なくとも3回に分けて実験を行います。3回の生物学的複製も推奨されます。チップを交換し、最後に希望する濃度になるまで手順を繰り返します。最後の列(この場合は4、6、および8)で、そこから100 μLを取り出して廃棄します。
5. 80 μLのLBブロスをすべてのウェルに加え、合計180 μL(行BからD)にします。次に、ステップ1.2で標準化された C.ビオラセウム 培養物20 μLを加え、ウェルあたり200 μLの最終容量を確保します(行BからD)。ウェル間の高濃度のキャリーオーバーや汚染を避けるために、ウェルを交換するときは毎回ピペットチップを交換してください。
6. 化合物が何らかの種類の溶媒に溶解している場合は、必ずその溶媒でコントロールを調製してください。DMSOを使用しました。この場合、未処理のコントロールである UC となる溶媒コントロールを調製します (生理活性化合物なし、列 9)。コントロールウェルごとに2 μLのDMSOを追加します。これにより、テストで最大濃度は 1% DMSO になります。
   注:1%のDMSOは細菌の増殖に影響を与えません^21,22。
7. ブランクを準備するか、バクテリアなしで顔料化合物を使用する場合はカラーコントロールを準備します。80 μLのLBブロスをすべてのウェルに加え、合計180 μL(前述のようにB行からD行)を加えた後、20 μLのLBブロスを対応するブランクウェルに加え、合計200 μL(行EからG)を加えます。これは、このプロトコルのステップ5で説明するように、OD測定値から差し引く必要があるクリスタルバイオレットからのバックグラウンド染色があるために行われます。
8. いずれかのカラムが空のままの場合は、200 μL の LB ブロスまたは滅菌蒸留水で満たします(列 1、2、10、11、および 12)。このステップは、インキュベーター内の培地の過度の乾燥を防ぐために重要です。

4. ビオラセインのインキュベーションと抽出

1. 使用する分光光度計に応じて、蒸発を防ぐために、プレートを蓋またはシーリングフィルム( 材料表に指定)で覆います。
2. プレートを30°Cで130rpmで攪拌しながら24時間インキュベートします。次に、プレートをインキュベーターから取り出し、60°Cの乾燥インキュベーターに入れ、蓋を外し、プレートを完全に乾燥させます(約8時間)。
3. プレートが乾燥したら、インキュベーターから取り出し、各ウェルに200 μLの純粋なDMSOを加え、蓋をします。プレートを25°Cのインキュベーターに入れ、130rpmで30分間振とうしてビオラセイン色素を溶解します。
4. この後、プレートをインキュベーターから取り出し、チップとウェルの壁との接触を避けながら、100 μLを別のマイクロプレートに移します。

5. ビオラセイン生産の定量化

1. 適切なプレート分光光度計を使用して595 nmでの吸光度を測定することにより、ビオラセイン産生量を定量します(材料表)。ビオラセイン色素の阻害は、吸光度の読み取り値の低下に比例します。
2. 100%ビオラセイン生産の基準としてネガティブコントロール(未処理コントロール)を使用して、ビオラセイン生産を定量化します(表1)。まず、各処理反復からブランクの吸光度値を差し引いて、ビオラセイン顔料のみに対応する吸光度を取得します(ブロスまたはコンパウンドカラーからの干渉を除く)。次に、次の式を使用して、各処理のビオラセイン産生の割合を計算します。
   ビオラセイン生産率=(生理活性化合物のOD/未処理対照のOD)×100
3. 統計分析を3回の反復で計算します。結果はANOVAに提出し、その後、GraphPad Prism 8.0ソフトウェアを使用してTukeyのテストを行うことができます。p <0.05 の値は統計的に有意であると考えられました。

結果

ここで示した結果には、私たちの研究グループ⁸によって以前に研究された3つの生理活性化合物、レスベラトロール、ファルネゾール、およびリナロールが使用されました。各化合物は、vioABCDE オペロン²³ を介して QS システムによって調節される表現型である C. violaceum ATCC 12472 でビオラセイン産生を阻害する能力についてテストされました。

この結果は、ビオラセイン産生の定量化における当社のプロトコルの有効性と、 C. violaceum ATCC 12472 の生理活性化合物によるその阻害を検証します。細菌の増殖に影響を与えることなく、ファルネゾール、リナロール、およびレスベラトロールによるビオラセインレベルの有意な低下は、QSIを抗菌効果と区別する方法の能力を裏付けています²⁴。以前の方法^25、

ディスカッション

C. violaceum からビオラセインを抽出して特性評価する最初の方法は、色素合成に適した炭素源を特定することに焦点を当てて 1990 年代に登場しました。このプロセスでは、ビオラセインを細胞および培地とともに乾燥させ、エタノールに再懸濁させ、上清抽出によって分離しました。エタノールに溶解したビオラセインは、その後再び乾燥され、純粋で乾燥した形態の顔料²⁷が得られました。1998 年に、プロトコルは修正されました²⁸.ビオラセインの溶解にはまだエタノールが使用されていましたが、更新された方法ではろ過、ソックスレー抽出、および結晶化ステップが導入されました。長年にわたり、ビオラセイン抽出/定量の方法は、細胞を溶解し、ブタノール²⁵でビオラセインを抽出し、超音波処理、^DMSO29で希釈し、プレートを乾燥させてDMSO³⁰

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DMSO	シンセ
ファルネゾール	シグマ・アルドリッチ	F203	95%
リナロール	シグマ・アルドリッチ	L2602	97%
ルリア・ベルタニ・ミディアム	ディフコ	244620
光学粘着フィルム	サーモフィッシャー	4311971	マイクロアンプ
レスベラトロール	シグマ・アルドリッチ	R5010	≥99%(HPLC)
Synergy HTX マルチモードリーダー	バイオテック
組織培養プレート 96 ウェル	カスヴィ	K12-096