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研究記事

NRF2/HO‐1経路活性化による自然脳内出血後のRKIP阻害による神経フェロトーシス減衰

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DOI:

10.3791/68511

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2025年10月31日

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1Department of Neurosurgery, Affiliated Hospital 2 of Nantong University

この記事について

サマリー

生物と細胞培養の両方に基づく研究を実施することにより、Raf キナーゼ阻害タンパク質 (RKIP) を阻害すると、自然脳内出血後の神経細胞フェロトーシスが軽減され、それによって脳損傷が軽減されることが実証されました。観察された細胞保護は、 NRF2 / HO-1 シグナル伝達軸の調節を介して発生します。

要約

ホスファチジルエタノールアミン結合タンパク質ファミリーの主要メンバーであるRafキナーゼ阻害剤タンパク質(RKIP)は、細胞分化、遊走、細胞周期、アポトーシスなどのさまざまな生理学的プロセスに関与していることが認識されています。この研究では、自然脳内出血 (ICH) 後の神経細胞フェロトーシスにおけるその機能と関連するメカニズムを調査しました。ヘミンで刺激された培養ラット褐色細胞腫(PC12)細胞を用いて、自然ICHの細胞モデルを開発した。細胞生存率、RNA発現、活性酸素種(ROS)レベル、および脂質ヒドロペルオキシド(LPO)が評価されました。さらに、タンパク質発現レベルを測定しました。この研究では、RKIP 阻害が ICH 後の in vitro で神経保護作用があることが確認されました。この効果は、グルタチオンペルオキシダーゼ4(GPX4)の発現の増加と、ニューロンのROSおよびLPOレベルとともに、アシルCoAシンテターゼ長鎖ファミリー4(ACSL4)の発現の減少と関連していました。RKIP 阻害は、核因子 E2 関連第 2 因子/ヘムオキシゲナーゼ-1 (NRF2/HO-1) 経路の活性化を介して、ICH 後の in vitro でのニューロンフェロトーシスに対する保護的役割を実証しました。このメカニズムは、ICH におけるニューロンフェロトーシスを標的とする治療戦略についての洞察を提供する可能性があります。

概要

自然脳内出血 (ICH) は、頭蓋内血管損傷、壊死、血管破裂による出血を特徴とする脳血管疾患であり、一般に大脳基底核に影響を及ぼし、出血性脳卒中の主要なサブタイプを表します1。ICH と診断された患者の死亡率は約 50% であり、生存者のかなりの割合が深刻な自立の喪失を経験しています2。自然発生性 ICH に対する現在の治療選択肢は限られており、死亡率を大幅に低下させたり、ICH 後の神経学的転帰を著しく改善したりすることが示されている既存の治療法はありません。

鉄依存性のプログラム細胞死であるフェロトーシスは、脂質過酸化、第一鉄イオンの蓄積、およびグルタチオンの枯渇によって定義され、遺伝的、形態学的、生物学的観点から他の形態のプログラム細胞死と区別されます3。ICH の病理におけるニューロンフェロトーシスの役割を強調する証拠が増えています。ホスファチジルエタノールアミン結合タンパク質 1 (PEBP1) としても知られる Raf キナーゼ阻害タンパク質 (RKIP) は、神経発達に関与し、フェロトーシスの重要な調節因子である 15-リポキシゲナーゼ (15LOX) との結合を通じて 15LOX/PEBP1 複合体を形成します4。しかし、自然 ICH の進行に関連するフェロトーシスにおける RKIP の具体的な役割とメカニズムは、まだ解明されていません。

この研究では、ニューロンに対する RKIP 阻害の抗フェロトーシス効果を調べ、 RKIP 発現の阻害が、核因子E2関連第2因子/ヘムオキシゲナーゼ-1(NRF2/HO-1)経路の活性化を通じて、ICH後のニューロンフェロトーシスを抑制できることを実証しました。これらの発見は、ICH の病因を標的とする新しい治療戦略の開発にとって重要です。

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プロトコル

PC12細胞の培養
PC12細胞株は、10%ウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含むロズウェルパークメモリアルインスティテュート1640(RPMI-1640)増殖培地で増殖させ、標準培養条件(37°C、5%CO2加湿雰囲気)で定期的に維持しました。実験手順では、接着細胞を培養容器にプレーティングし、ほぼコンフルエントな単層(約90%の表面被覆率)に達するまで増殖させました。細胞解離は、0.25% トリプシン-EDTA 溶液を使用した酵素処理によって達成され、その後、集団の安定性を確保するために 3 回連続して継代培養サイクルが行われました。処理された細胞は、その後、下流の実験アプリケーションと分析評価に割り当てられました。

細胞生存率アッセイ
細胞生存率は、アッセイキットの製造元から提供された指示に従って、PC12細胞に対するヘミンとロコスタチンの細胞毒性を評価するために評価されました。PC12細胞を96ウェルプレートに均一に播種し、ヘミンまたはロコスタチンで24時間培養した。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄した後、細胞を10%テトラゾリウム塩溶液を含むRPMI-1640培地で37°Cで90分間インキュベートしました。 次に、マイクロプレートリーダーを使用して光学密度(OD)値を450 nmで測定しました。

定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)
RNA抽出試薬を用いてPC12細胞からトータルRNAを抽出しました。まず、サンプルを抽出試薬中で均質化し、徹底的に溶解しました。クロロホルムを混合物に加え、激しく振とうし、遠心分離して相を分離しました(12,000 × g、15分、4°C)。RNAを含む水相を採取し、イソプロパノール(水相:iPrOH=1:1)を添加し、室温でインキュベートしてRNAを沈殿させた。遠心分離してRNAをペレット化し(12,000 × g、10分、4°C)、70%エタノール1mLを加えて不純物を除去し、最後にRNAペレットをRNaseフリーの水に溶解して-80°Cで保存しました。 相補的DNA(cDNA)テンプレートは、RTマスターミックスによる逆転写によって生成されました。次に、得られたテンプレートを1:5の比率で希釈し、リアルタイムPCR装置で定量的リアルタイムPCRにかけました。各サンプルを3回に増幅し、PCR産物の相対量を平均化しました。使用したプライマーを表1に示し、β-アクチンがハウスキーピング遺伝子として機能します。相対mRNA濃度は、式E = 2−ΔΔCtを使用して決定され、各反応の臨界閾値サイクル(CT)値が記録されました。

細胞内活性酸素種(ROS)および脂質ヒドロペルオキシド(LPO)アッセイ
ROS および LPO レベルは、フローサイトメトリーを使用して測定されました。PC12細胞をヘミン(80 μM)、ロコスタチン(5 μM)、およびML385(5 μM)で24時間処理し、皿中でPBSで3回洗浄しました。次に、細胞をROSプローブである2',7'-ジクロロジヒドロフルオレセインジ酢酸(DCFH-DA)およびLPOプローブであるBODIPY 581/591 C11の存在下で、5%CO2とともに37°Cで40分間インキュベートした。余分なプローブを除去するためのPBS洗浄に続いて、フローサイトメトリーによって蛍光強度を測定しました。すべてのサンプルに一貫したゲーティング戦略が適用されました:最初に、破片を排除するためにFSC-AとSSC-Aで細胞をゲートし、次にFSC-AとFSC-Hゲーティングによって単一細胞を選択しました。未染色の細胞およびヘミンのみで処理された細胞をネガティブおよびポジティブコントロールとして使用して、蛍光補償とゲートを確立しました。データは、リンクされたソフトウェアを使用して分析されました。

タンパク質抽出とウェスタンブロット
全タンパク質抽出
処理したPC12細胞の上清を廃棄し、続いて氷冷PBSで3回洗浄しました。トリプシンを使用して細胞を回収し、200 × g で 5 分間遠心分離しました。上清を除去した後、細胞ペレットを10%プロテアーゼ阻害剤と10%ホスファターゼ阻害剤を含む低温放射性免疫沈降アッセイ(RIPA)溶解バッファーで均質化しました。氷上で30分間インキュベートした後、ライセートを12,000 × gで4°Cで15分間遠心分離した。 透明な上清をローディングバッファー(4:1)と混合し、95°Cで5分間加熱してタンパク質を変性させました。タンパク質サンプルは、その後の使用のために-80°Cで保存しました。

ウェスタンブロット分析
タンパク質は、スタッキングゲルと分離ゲルを使用してSDS-PAGEによって分離され、サンプルはウェルにロードされました。電気泳動は、スタッキングゲルの場合は80 V、分離ゲルの場合は120 Vで実行されました。タンパク質を、300 mAの定電流で1〜2時間、転写システムを使用して、ポリフッ化ビニリデン(PVDF)メンブレン(メタノール中で1分間予め活性化)に転写しました。膜は、非特異的結合を防ぐために、TBST中の5%スキムミルクで室温で2時間ブロックされました。TBSTで3回洗浄(各10分)した後、メンブレンをTBSTで希釈した一次抗体とともに4°Cで一晩インキュベートした:ウサギ抗ACSL4 (1:1,000)、ウサギ抗GPX4 (1:1,000)、ウサギ抗HO-1 (1:2,000)、ウサギ抗NRF2 (1:1,000)、ウサギ抗RKIP (1:1,500)、およびマウス抗βアクチン(1:5,000)。メンブレンをTBSTで3 x 10分間洗浄し、HRP標識二次抗体(HRP標識ヤギ抗マウスIgG(1:1,000)、HRP標識ヤギ抗ウサギIgG(1:1,000))と室温で2時間インキュベートした。さらに 3 x 5 分間の TBST 洗浄後、ECL ウェスタンブロットキットを使用してタンパク質シグナルを視覚化し、ImageJ ソフトウェアを使用して定量しました。

免疫蛍光染色
細胞を培養プレートにあらかじめ配置したカバーガラスに播種し、接着させました。実験的処理後、上清を廃棄し、細胞をPBSで3回洗浄しました。細胞を室温で4%パラホルムアルデヒド(PFA)で15分間固定し、続いてPBS洗浄を3回行いました。続いて、細胞を室温で0.1%Triton X-100で10分間透過処理し、PBSで3回洗浄した。非特異的結合は、3%ウシ血清アルブミン(BSA)と室温で30分間インキュベートすることによりブロックされました。一次抗体を4°Cで一晩適用しました:ウサギ抗HO-1 (1:500)、ウサギ抗NRF2 (1:500)。翌日に3回のPBS洗浄の後、細胞を蛍光二次抗体と室温で暗所で1時間インキュベートしました:Alexa Fluor 488標識ヤギ抗ウサギIgG(1:500)。最終洗浄に続いて、核対比染色のために4',6-ジアミジノ-2'-フェニルインドール(DAPI)を含む封入剤でサンプルをマウントしました。画像は共焦点レーザー走査顕微鏡を使用してキャプチャされました。

統計分析
測定データは、平均±標準偏差 (SD) として表されました。分析のために、3つの独立した反復アッセイの結果を表す定量的データが採取されました。2 つのグループ間の比較には t 検定が適用され、複数グループ間の比較には一元配置分散分析 (ANOVA) が使用され、続いて多重比較には Tukey の事後検定が使用されました。0.05

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結果

ヘミンは原形質膜損傷を誘発する可能性があるため、ICHのin vitro細胞モデルの構築に頻繁に使用されます。この研究では、さまざまな濃度と期間でのヘミン処理がPC12細胞の生存率に及ぼす影響を調査すると同時に、ウェスタンブロット分析を通じて対応する実験条件下での RKIP タンパク質発現動態を分析しました(図1A)。細胞生存率は、ヘミン濃度が60μM以上(図1B)で有意に低下し、この減少は濃度の増加とともに用量依存的に発生しました。さらに、ヘミン細胞毒性は時間依存性であり、曝露後最初の24時間以内にピークに達し、その後徐々に低下しました(図1C)。ウェスタンブロット分析により、 RKIP タンパク質の発現は80μMヘミンで有意に上昇し(図1D、E)、刺激後24時間でピークに達しました(図1...

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ディスカッション

この研究では、in vitro 環境で ICH によって誘発されるフェロトーシスに対する RKIP ノックダウンの効果と根底にあるメカニズムを調査しました。ヘミンによる細胞の刺激は酸化ストレスを引き起こし、ROS と LPO の過剰な生成を伴い、それによってフェロトーシスを促進します。内因性RKIP発現の阻害は、遊離したNRF2が核に転座して抗酸化応答要素(ARE)に結合し、下流の抗酸化遺伝子の転写を開始します。ヘム代謝における重要な酵素であり、NRF2 の下流標的の 1 つである HO-1 は、強力な抗酸化効果を発揮します。この経路は、組織の恒常性を維持しながら、フェロトーシスと酸化的損傷を軽減します(図7)。これらの発見は、RKIP が ICH の治療における潜在的な治療標的として機能する可能性があることを示しています。

ICH...

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開示事項

著者らは、この論文で報告された研究に影響を与えると思われる競合する経済的利益や個人的な関係が知られていないことを宣言します。

謝辞

この研究は、南通市衛生健康委員会プロジェクト (MS2022015) および南通科学技術局プロジェクト (JCZ2023022) からの助成金によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Alexa Fluor 488標識ヤギ抗ウサギIgGビヨタイム・バイオテックA0423
抗ACSL4抗体細胞シグナル伝達38493T
抗GPX4抗体細胞シグナル伝達59735S
抗HO-1抗体メドケムエクスプレスHY-P80499
抗NRF2抗体細胞シグナル伝達12721T
抗RKIP抗体アブカムAB76582
抗βアクチン抗体アブカムAB179467
BeyoECL Plusビヨタイム・バイオテックP0018M
BSANCMバイオテックWB6504-100g
細胞計数キット-8ビヨタイム・バイオテックC0037
セルセービングNCMバイオテックC40050
ChamQ SYBR カラー qPCR マスターミックスヴァイジームQ411-02
DMSOビヨタイム・バイオテックST038
胎児用牛血清ギブコA5670801
GraphPad プリズム
ヘミンメドケムエクスプレスHY-19424
HiScript Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA ワイパー)ヴァイジームR123-01
HRP標識されたヤギ抗マウスIgG熱C31430100
HRP標識されたヤギ抗ウサギIgG熱C31460100
過酸化脂質(LPO)含有量検査キットソーラービオBC5245
ロコスタチンメドケムエクスプレスハイW013411A
ML385メドケムエクスプレスHY-100523
マウントメディウム?アンチフェーディング(DAPI使用)ソーラービオS2110
非脂肪粉ミルクソーラービオD8340
PBS(粉末?pH7.2-7.4)ソーラービオP1010
PC-12Adh南京バイオチャネルバイオテクノロジーBC-C-RA-005
ペニシリン・ストレプトマイシン液体ソーラービオP1400
PRMI-1640ギブコA1049101
プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル(一般使用)、50倍ビヨタイム・バイオテックP1045
プロテインマーカー熱26617
PVDF ミリポールRIKB43638
活性酸素種アッセイキットソーラービオCA1410
RIPAバッファ(高値)ソーラービオR0010
SDS-PAGEジェルクイックプレミュレーションキットエピジムPG110
SDS-PAGEサンプルローディングバッファ、5倍ビヨタイム・バイオテックP0015
トライトンX-100ソーラービオIT9100
トリゾル熱15596018CN
トリプシン-EDTA溶液?0.25%(フェノールレッドなし)ソーラービオT1300

参考文献

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