NRF2/HO‐1経路活性化による自然脳内出血後のRKIP阻害による神経フェロトーシス減衰

自然脳内出血 (ICH) は、頭蓋内血管損傷、壊死、血管破裂による出血を特徴とする脳血管疾患であり、一般に大脳基底核に影響を及ぼし、出血性脳卒中の主要なサブタイプを表します¹。ICH と診断された患者の死亡率は約 50% であり、生存者のかなりの割合が深刻な自立の喪失を経験しています²。自然発生性 ICH に対する現在の治療選択肢は限られており、死亡率を大幅に低下させたり、ICH 後の神経学的転帰を著しく改善したりすることが示されている既存の治療法はありません。

鉄依存性のプログラム細胞死であるフェロトーシスは、脂質過酸化、第一鉄イオンの蓄積、およびグルタチオンの枯渇によって定義され、遺伝的、形態学的、生物学的観点から他の形態のプログラム細胞死と区別されます³。ICH の病理におけるニューロンフェロトーシスの役割を強調する証拠が増えています。ホスファチジルエタノールアミン結合タンパク質 1 (PEBP1) としても知られる Raf キナーゼ阻害タンパク質 (RKIP) は、神経発達に関与し、フェロトーシスの重要な調節因子である 15-リポキシゲナーゼ (15LOX) との結合を通じて 15LOX/PEBP1 複合体を形成します⁴。しかし、自然 ICH の進行に関連するフェロトーシスにおける RKIP の具体的な役割とメカニズムは、まだ解明されていません。

この研究では、ニューロンに対する RKIP 阻害の抗フェロトーシス効果を調べ、 RKIP 発現の阻害が、核因子E2関連第2因子/ヘムオキシゲナーゼ-1(NRF2/HO-1)経路の活性化を通じて、ICH後のニューロンフェロトーシスを抑制できることを実証しました。これらの発見は、ICH の病因を標的とする新しい治療戦略の開発にとって重要です。

PC12細胞の培養
PC12細胞株は、10%ウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含むロズウェルパークメモリアルインスティテュート1640(RPMI-1640)増殖培地で増殖させ、標準培養条件(37°C、5%CO₂加湿雰囲気)で定期的に維持しました。実験手順では、接着細胞を培養容器にプレーティングし、ほぼコンフルエントな単層(約90%の表面被覆率)に達するまで増殖させました。細胞解離は、0.25% トリプシン-EDTA 溶液を使用した酵素処理によって達成され、その後、集団の安定性を確保するために 3 回連続して継代培養サイクルが行われました。処理された細胞は、その後、下流の実験アプリケーションと分析評価に割り当てられました。

細胞生存率アッセイ
細胞生存率は、アッセイキットの製造元から提供された指示に従って、PC12細胞に対するヘミンとロコスタチンの細胞毒性を評価するために評価されました。PC12細胞を96ウェルプレートに均一に播種し、ヘミンまたはロコスタチンで24時間培養した。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄した後、細胞を10%テトラゾリウム塩溶液を含むRPMI-1640培地で37°Cで90分間インキュベートしました。 次に、マイクロプレートリーダーを使用して光学密度(OD)値を450 nmで測定しました。

定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)
RNA抽出試薬を用いてPC12細胞からトータルRNAを抽出しました。まず、サンプルを抽出試薬中で均質化し、徹底的に溶解しました。クロロホルムを混合物に加え、激しく振とうし、遠心分離して相を分離しました(12,000 × g、15分、4°C)。RNAを含む水相を採取し、イソプロパノール(水相:iPrOH=1:1)を添加し、室温でインキュベートしてRNAを沈殿させた。遠心分離してRNAをペレット化し(12,000 × g、10分、4°C)、70%エタノール1mLを加えて不純物を除去し、最後にRNAペレットをRNaseフリーの水に溶解して-80°Cで保存しました。 相補的DNA(cDNA)テンプレートは、RTマスターミックスによる逆転写によって生成されました。次に、得られたテンプレートを1:5の比率で希釈し、リアルタイムPCR装置で定量的リアルタイムPCRにかけました。各サンプルを3回に増幅し、PCR産物の相対量を平均化しました。使用したプライマーを表1に示し、β-アクチンがハウスキーピング遺伝子として機能します。相対mRNA濃度は、式E = 2^−ΔΔCtを使用して決定され、各反応の臨界閾値サイクル(CT)値が記録されました。

細胞内活性酸素種(ROS)および脂質ヒドロペルオキシド(LPO)アッセイ
ROS および LPO レベルは、フローサイトメトリーを使用して測定されました。PC12細胞をヘミン(80 μM)、ロコスタチン(5 μM)、およびML385(5 μM)で24時間処理し、皿中でPBSで3回洗浄しました。次に、細胞をROSプローブである2',7'-ジクロロジヒドロフルオレセインジ酢酸(DCFH-DA)およびLPOプローブであるBODIPY 581/591 C11の存在下で、5%CO₂とともに37°Cで40分間インキュベートした。余分なプローブを除去するためのPBS洗浄に続いて、フローサイトメトリーによって蛍光強度を測定しました。すべてのサンプルに一貫したゲーティング戦略が適用されました:最初に、破片を排除するためにFSC-AとSSC-Aで細胞をゲートし、次にFSC-AとFSC-Hゲーティングによって単一細胞を選択しました。未染色の細胞およびヘミンのみで処理された細胞をネガティブおよびポジティブコントロールとして使用して、蛍光補償とゲートを確立しました。データは、リンクされたソフトウェアを使用して分析されました。

タンパク質抽出とウェスタンブロット
全タンパク質抽出
処理したPC12細胞の上清を廃棄し、続いて氷冷PBSで3回洗浄しました。トリプシンを使用して細胞を回収し、200 × g で 5 分間遠心分離しました。上清を除去した後、細胞ペレットを10%プロテアーゼ阻害剤と10%ホスファターゼ阻害剤を含む低温放射性免疫沈降アッセイ(RIPA)溶解バッファーで均質化しました。氷上で30分間インキュベートした後、ライセートを12,000 × gで4°Cで15分間遠心分離した。 透明な上清をローディングバッファー(4:1)と混合し、95°Cで5分間加熱してタンパク質を変性させました。タンパク質サンプルは、その後の使用のために-80°Cで保存しました。

ウェスタンブロット分析
タンパク質は、スタッキングゲルと分離ゲルを使用してSDS-PAGEによって分離され、サンプルはウェルにロードされました。電気泳動は、スタッキングゲルの場合は80 V、分離ゲルの場合は120 Vで実行されました。タンパク質を、300 mAの定電流で1〜2時間、転写システムを使用して、ポリフッ化ビニリデン(PVDF)メンブレン(メタノール中で1分間予め活性化)に転写しました。膜は、非特異的結合を防ぐために、TBST中の5%スキムミルクで室温で2時間ブロックされました。TBSTで3回洗浄(各10分)した後、メンブレンをTBSTで希釈した一次抗体とともに4°Cで一晩インキュベートした:ウサギ抗ACSL4 (1:1,000)、ウサギ抗GPX4 (1:1,000)、ウサギ抗HO-1 (1:2,000)、ウサギ抗NRF2 (1:1,000)、ウサギ抗RKIP (1:1,500)、およびマウス抗βアクチン(1:5,000)。メンブレンをTBSTで3 x 10分間洗浄し、HRP標識二次抗体(HRP標識ヤギ抗マウスIgG(1:1,000)、HRP標識ヤギ抗ウサギIgG(1:1,000))と室温で2時間インキュベートした。さらに 3 x 5 分間の TBST 洗浄後、ECL ウェスタンブロットキットを使用してタンパク質シグナルを視覚化し、ImageJ ソフトウェアを使用して定量しました。

免疫蛍光染色
細胞を培養プレートにあらかじめ配置したカバーガラスに播種し、接着させました。実験的処理後、上清を廃棄し、細胞をPBSで3回洗浄しました。細胞を室温で4%パラホルムアルデヒド(PFA)で15分間固定し、続いてPBS洗浄を3回行いました。続いて、細胞を室温で0.1%Triton X-100で10分間透過処理し、PBSで3回洗浄した。非特異的結合は、3%ウシ血清アルブミン(BSA)と室温で30分間インキュベートすることによりブロックされました。一次抗体を4°Cで一晩適用しました:ウサギ抗HO-1 (1:500)、ウサギ抗NRF2 (1:500)。翌日に3回のPBS洗浄の後、細胞を蛍光二次抗体と室温で暗所で1時間インキュベートしました:Alexa Fluor 488標識ヤギ抗ウサギIgG(1:500)。最終洗浄に続いて、核対比染色のために4',6-ジアミジノ-2'-フェニルインドール(DAPI)を含む封入剤でサンプルをマウントしました。画像は共焦点レーザー走査顕微鏡を使用してキャプチャされました。

統計分析
測定データは、平均±標準偏差 (SD) として表されました。分析のために、3つの独立した反復アッセイの結果を表す定量的データが採取されました。2 つのグループ間の比較には t 検定が適用され、複数グループ間の比較には一元配置分散分析 (ANOVA) が使用され、続いて多重比較には Tukey の事後検定が使用されました。0.05

ヘミンは原形質膜損傷を誘発する可能性があるため、ICHのin vitro細胞モデルの構築に頻繁に使用されます。この研究では、さまざまな濃度と期間でのヘミン処理がPC12細胞の生存率に及ぼす影響を調査すると同時に、ウェスタンブロット分析を通じて対応する実験条件下での RKIP タンパク質発現動態を分析しました(図1A)。細胞生存率は、ヘミン濃度が60μM以上(図1B)で有意に低下し、この減少は濃度の増加とともに用量依存的に発生しました。さらに、ヘミン細胞毒性は時間依存性であり、曝露後最初の24時間以内にピークに達し、その後徐々に低下しました(図1C)。ウェスタンブロット分析により、 RKIP タンパク質の発現は80μMヘミンで有意に上昇し(図1D、E)、刺激後24時間でピークに達しました(図1F、G)。これらの知見に基づき、80μMのヘミンと24時間の処理期間を後続の実験に選び、そのメカニズムやシグナル伝達経路を解明しました。

ICH後のニューロンフェロトーシスにおけるRKIPの役割を調査するために、ロコスタチンを使用してRKIP発現を阻害しました(図2A)。ロコスタチンはRKIPに結合し、RKIPとRaf-1キナーゼおよびGRK2の両方との間の相互作用を破壊し、それによってRKIPの機能的効果を弱めて阻害目的を達成します。この研究では、関連する分子メカニズムを調査するために、RKIP阻害剤としてロコスタチンを使用しました5,6。ロコスタチンの細胞毒性は、生存率アッセイを使用して、0〜40μMの濃度範囲で最初に評価されました。結果は、≤5 μMで有意な細胞毒性を示さず、その後の実験のための安全な濃度範囲を確立しました(図2B)。さらに、ウェスタンブロッティングおよびRT-qPCR分析を使用して、RKIP発現に対する5μMロコスタチンの阻害効果を確認しました。ウェスタンブロットではRKIPタンパク質レベルの有意な低下が明らかになり(図2C、D)、RT-qPCRではRKIP mRNAレベルの低下が示されました(図2E)。これらの発見は、RKIP発現の阻害における5μMロコスタチンの有効性を示しています。

この研究では、フェロトーシスにおける RKIP の調節機能を描写するために、脳内出血 (ICH) のヘミン誘発性 PC12 細胞モデルが開発されました。私たちの結果は、ヘミン刺激が細胞生存率を低下させながら RKIP 発現を有意に増加させることを示しました。既存の研究に基づいて、ヘミン誘発性細胞死は、細胞コンパートメント内の病理学的鉄沈着と活性酸素種 (ROS) レベルの上昇を特徴とする鉄触媒脂質過酸化プロセスであるフェロトーシスと密接に関連している可能性があると推測しました。

RKIPとフェロトーシスの関係をさらに調査するために、ヘミン刺激PC12細胞をロコスタチンで処理しました。ウェスタンブロット分析により、フェロトーシスの主要なドライバーであるアシル-CoAシンテターゼ長鎖ファミリー4(ACSL4)の発現がヘミン処理群で有意に増加していることが明らかになりました(図3A、B)。ACSL4 はフェロトーシスにおける重要な死促進遺伝子であり、多価不飽和脂肪酸 (PUFA) のエステル化を促進し、それによってフェロトーシスに対する細胞の感受性を高めます。さらに、フェロトーシス阻害剤であるグルタチオンペルオキシダーゼ4(GPX4)の発現は、ヘミン処理群で有意に減少しました(図3A、C)。GPX4 はフェロトーシスの重要な調節因子であり、過酸化脂質を除去することで脂質過酸化を阻害し、それによって細胞を酸化的損傷から保護します。これらの結果は、ヘミン刺激がPC12細胞のフェロトーシスを増加させることを示しています。しかし、ヘミン群と比較して、ロコスタチンによるRKIPの薬理学的阻害はこれらの変化を逆転させ、RKIP発現の抑制がPC12細胞のフェロトーシスを阻害したことを示しています。mRNAレベルでも一貫した結果が観察されました(図3 F、G)。

また、フェロトーシス関連経路分子の発現についても調べました。NRF2/HO-1 経路は、フェロトーシスにおいて重要な役割を果たすことが示されています。これに基づいて、RKIP阻害はNRF2/HO-1経路を活性化することにより神経細胞のフェロトーシスを抑制する可能性があるという仮説を立てました。この仮説を検証するために、まずPC12細胞をヘミンで刺激し、NRF2タンパク質の発現が有意に増加し(図3A、D)、その下流産物HO-1の有意な増加(図3A、E)を発見しました。これらの発見は、ヘミン誘発性フェロトーシスがNRF2/HO-1経路を活性化し、細胞に保護効果を発揮することを示唆しています。NRF2は、細胞の抗酸化応答の主要な調節因子として、HO-1などの下流の標的遺伝子の発現を調節することにより、細胞の抗酸化能力を高め、それによってフェロトーシスを阻害します。その後、ロコスタチンの治療により、ヘミン治療群と比較してHO-1およびNRF2の発現がさらに増加しました(図3A、D)。mRNAレベルでも一貫した結果が観察され(図3I、J)、RKIPの阻害がNRF2とその下流分子HO-1を調節することにより、ヘミン刺激PC12細胞のフェロトーシスを抑制することがさらに確認されました。

特に、別のフェロトーシス阻害剤であるフェリチン重鎖1(FTH1)は、ヘミン刺激時に発現の増加を示し、 RKIP が阻害されるとその発現はさらに上昇しました(図3H)。 FTH1 はフェリチンの主成分であり、鉄の貯蔵と酸化に関与します。鉄イオンをより安定した形に変換し、遊離鉄による酸化ストレスを軽減します。ヘミン刺激時の FTH1 のアップレギュレーションは、細胞が酸化的損傷を避けるために過剰な鉄を蓄えようとするため、鉄過剰に対する代償反応を表している可能性があります。ロコスタチン治療による FTH1 発現のさらなる増加は、遊離鉄レベルの低下と抗酸化能力の強化を示唆しており、 RKIP 阻害がPC12細胞におけるヘミン誘発性フェロトーシスを抑制するという結論を強化しています。

PC12細胞のROSおよび脂質ヒドロペルオキシド(LPO)レベルは、フローサイトメトリーによって評価されました。ヘミン治療により ROS および LPO レベルが大幅に増加し、ロコスタチン投与後に逆転しました。この発見は、RKIPを阻害することがニューロンのフェロトーシスの抑制に役立つ可能性があることを示しています(図4A-D)。

要約すると、ヘミン誘発性の用量と PC12 細胞生存率の時間依存的な減少は、 RKIP タンパク質レベルの著しい増加を伴います。このプロセスは、 ACSL4 のレベルの上昇と GPX4の発現の抑制と関連していました。同時に、酸化的損傷マーカー(ROSおよびLPO)の有意な蓄積が観察され、どちらも酸化ストレスと脂質膜の破壊を媒介することにより、フェロトーシスの中核的なドライバーとして機能しました。さらに、鉄貯蔵タンパク質 FTH1 のアップレギュレーションは、鉄過剰に対する代償性細胞応答を示唆しました。重要なことに、ロコスタチンによる RKIP の薬理学的阻害は、これらの変化を逆転させ、ヘミン誘発性フェロトーシスを廃止しました(図1、 図2、 図3、および 図4)。

アッセイの結果は、 RKIP を阻害するとニューロンのフェロトーシスが効果的に抑制され、 NRF2/HO-1 発現が調節されることを示しました。 NRF2/HO-1 経路がフェロトーシスに重要な役割を果たすことを考えると、 RKIP 阻害で観察されるニューロンフェロトーシスの抑制は、この経路の刺激によって媒介される可能性があるという仮説が立てられました。この仮説を検証するために、さらなる実験が行われました(図5A)。

選択的NRF2阻害剤であるML385を使用し、その結果、NRF2の発現がタンパク質レベル(図5B、C)とmRNAレベル(図5E)の両方で効果的に低下することが確認されました。さらに、NRF2の下流分子であるHO-1の発現を評価しました。その結果、RKIP阻害は最初はHO-1発現を増加させたが、NRF2阻害後にこの効果が逆転したことが示された(図5B、D、F)。これらの結果は、RKIP阻害がNRF2/HO-1経路を活性化することによりニューロンのフェロトーシスを弱める可能性があることを示唆しています。免疫蛍光染色は、RKIP阻害後にNRF2の核転座が観察されたため、これらの発見をさらに裏付けました(図5G-J)。

その後、フローサイトメトリーを使用してPC12細胞のROSとLPOのレベルをさらに評価しました。ML385によるNRF2の阻害は、ロコスタチン誘発性のROSおよびLPOレベルの低下を逆転させることを発見しました。これらの発見は、RKIP抑制がNRF2 / HO-1経路を活性化することによりニューロンのフェロトーシスを阻害する可能性があることを示唆しています(図6A-D)。

データの可用性:
現在の調査中に生成されたデータセットは、 補足ファイル 1 に含まれています。

図1:ヘミン刺激PC12細胞によるin vitro疾患モデルの構築。(A)ヘミン刺激PC12細胞モデルの構築の概略図。(B)細胞生存率を評価するための細胞生存率アッセイを使用したin vitro脳内出血モデル確立のための最適なヘミン濃度の決定。(C)ヘミン(80μM)で処理したPC12細胞を用いた細胞生存率アッセイをさまざまな時点で実施。(D、E)異なるヘミン濃度で処理したPC12細胞におけるRKIP発現レベルの代表的なウェスタンブロット分析と定量的評価(24時間)。(F、G)ヘミン(80μM)にさまざまな期間曝露されたPC12細胞におけるRKIP発現レベルの代表的なウェスタンブロット分析と定量的評価。すべてのデータは、平均± SD (n = 3) として表示されます。*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001。略語: CCK8 = Cell Counting Kit-8;WB = ウェスタンブロット;RKIP = Rafキナーゼ阻害剤タンパク質。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:ヘミンで刺激されたPC12細胞におけるRKIP発現に対するロコスタチンの効果。(A)PC12細胞におけるロコスタチン処理の実験手順の概略図。(B)異なる濃度のロコスタチンで処理したPC12細胞の細胞生存率を細胞生存率アッセイを用いて評価した。(C、D)ヘミン(80 μM、24時間)および/またはロコスタチン(5 μM、24時間)で処理したPC12細胞におけるRKIPの発現をウェスタンブロットで分析し、代表的なブロットと統計分析を示しました。(E)ヘミン(80 μM、24時間)および/またはロコスタチン(5 μM、24時間)で処理したPC12細胞におけるRKIP mRNA発現をRT-qPCRを用いて測定した。すべてのデータは平均 ± SD (n=3) として表示されます。*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001。略語: CCK8 = Cell Counting Kit-8;WB = ウェスタンブロット;RT-qPCR = 定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応;ROS = 活性酸素種;LPO =脂質過酸化。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:ヘミン刺激後のPC12細胞におけるフェロトーシスに対するRKIP阻害の効果。(A-E)ヘミン(80 μM、24時間)および/またはロコスタチン(5 μM、24時間)で処理したPC12細胞におけるACSL4、GPX4、NRF2、およびHO-1のタンパク質発現変化のウェスタンブロット分析。(F-J)ヘミン(80 μM、24時間)および/またはロコスタチン(5 μM、24時間)で処理したPC12細胞におけるACSL4、GPX4、NRF2、HO-1、およびFTH1のmRNA発現レベルのRT-qPCR分析。すべてのデータは平均 ± SD (n=3) として表示されます。*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001。略語:WB =ウェスタンブロット;RT-qPCR = 定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応;RKIP = Rafキナーゼ阻害剤タンパク質;ACSL4 = アシル-CoAシンテターゼ長鎖ファミリー4;GPX4 = グルタチオンペルオキシダーゼ4;NRF2 = 核因子 E2 関連因子 2;HO-1 = ヘムオキシゲナーゼ-1;FTH1 = フェリチン重鎖 1。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:ヘミン刺激後のPC12細胞の酸化ストレスに対するRKIP阻害の効果。(A、C)ヘミン(80μM、24時間)および/またはロコスタチン(5μM、24時間)で処理したPC12細胞における活性酸素種産生のフローサイトメトリー分析。(B、D)ヘミン(80 μM,24時間)および/またはロコスタチン(5 μM,24時間)で処理したPC12細胞における脂質過酸化のフローサイトメトリー分析。すべてのデータは、平均± SD (n = 3) として表示されます。*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001。略語:ROS =活性酸素種;LPO =脂質過酸化。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:RKIP阻害によって媒介される抗フェロプトーシス効果におけるNRF2の役割。(A)さまざまな条件下でPC12細胞を処理するための実験手順の概略図。(B-D)ヘミン(80 μM、24時間)および/またはロコスタチン(5 μM、24時間)および/またはML385(5 μM、24時間)を使用したPC12細胞における異なる処理条件下でのNRF2およびHO-1のタンパク質発現変化のウェスタンブロット分析。(E、F)ヘミン(80 μM、24時間)および/またはロコスタチン(5 μM、24時間)および/またはML385(5 μM、24時間)で処理したPC12細胞におけるNRF2およびHO-1のmRNA発現レベルのRT-qPCR分析。(G-J)ヘミン(80 μM、24時間)および/またはロコスタチン(5 μM、24時間)および/またはML385(5 μM、24時間)で処理したPC12細胞におけるNRF2およびHO-1発現の免疫蛍光分析および平均蛍光強度の定量化。スケールバー= 50 μm。すべてのデータは、平均± SD (n = 3) として表示されます。*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001。略語:WB =ウェスタンブロット;RT-qPCR = 定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応;IF染色=免疫蛍光染色;NRF2 = 核因子 E2 関連因子 2;HO-1 = ヘムオキシゲナーゼ-1。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6:RKIP阻害 によって媒介される酸化ストレスの抑制におけるNRF2の役割。(A、C)ヘミン(80 μM、24時間)および/またはロコスタチン(5 μM、24時間)および/またはML385(5 μM、24時間)を使用したPC12細胞における活性酸素種産生のフローサイトメトリー分析。(B、D)ヘミン(80 μM、24時間)および/またはロコスタチン(5 μM、24時間)および/またはML385(5 μM、24時間)で処理したPC12細胞における脂質過酸化のフローサイトメトリー分析。すべてのデータは、平均± SD (n = 3) として表示されます。*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001。略語:ROS =活性酸素種;LPO =脂質過酸化。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図7:NRF2 / HO-1経路 を活性化することにより、自発的ICH後のニューロンフェロトーシスを弱めるRKIP阻害の概略図。私たちの発見は、RKIP阻害がNRF2核転座を効果的に促進し、脂質ROSの蓄積を抑制し、その結果、ヘミン誘発性フェロトーシスと酸化ストレスから保護することを示しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:定量的逆転写-PCR用のプライマー。

補足ファイル1:CCK-8アッセイ、ウェスタンブロット、RT-qPCR、フローサイトメトリー分析など、最初の6桁を裏付ける生および処理された定量データ。 データは図サブパネルごとに編成され、統計分析に使用されるすべての反復値が含まれます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

著者らは、この論文で報告された研究に影響を与えると思われる競合する経済的利益や個人的な関係が知られていないことを宣言します。