マルチモーダル広視野フーリエ変換ラマン顕微鏡

サマリー

コンパクトで超安定な複屈折干渉計に基づく広視野フーリエ変換顕微鏡により、2D検出器のすべてのピクセルのスペクトルを並列取得できます。時間領域アプローチにより、光発光およびラマン信号の解消が可能となり、空間分解能は約1μm、^{スペクトル} 分解能は23cm1で高速ラマンマッピング(約5 ms/ピクセル)を実現できます。

要約

ラマン顕微鏡は、試料の化学組成を決定する強力な技術です。ポイント走査周波数領域検出に基づく最先端の自発ラマン顕微鏡の主な課題は、通常0.1〜1秒の長いピクセル滞留時間のために広範囲のラマンマップを取得することです。ここで紹介する広視野フーリエ変換(FT)顕微鏡は、空間分解能が約1μm、スペクトル分解能が約23cm1で拡張試料を迅速に測定することを可能にします。これは、超安定でコンパクトな共通経路複屈折干渉計を商業用顕微鏡の検出経路に沿って追加し、2D検出器のすべてのピクセルのスペクトルを並列取得可能にし、測定時間を大幅に短縮(10〜100倍短縮)実現しています。時間領域アプローチは、周波数領域技術のもう一つの制約、すなわちラマン信号を光発光背景から切り離すという点に効果的に対処します。光発光背景にはラマン信号が埋もれている可能性があります。このプロトコルは、アップグレードされた商用顕微鏡を用いたハイパースペクトル測定方法、照明方式の整列、測定パラメータの選択基準、スペクトルの取得と調査のためのデータ解析を説明しています。

概要

スペクトルイメージングはスペクトル情報と空間情報の両方を提供する技術であり、顕微鏡¹ からリモートセンシング²まで様々な分野に応用されています。 マルチスペクトル イメージングと ハイパースペクトル イメージングは、2Dセンサーの各ピクセルに対して数個の離散スペクトルバンドが記録されるか連続スペクトルで区別されます。ラマンイメージングはスペクトルイメージングの特定の実装です。

ラマン散乱顕微鏡法は、系の振動周波数ν_Rを測定する強力な技術です。振動モードは化学結合に関連しており、したがってラマン分光^法3は生物学⁴および材料科学⁵における試料の化学組成の調査を可能にします。自発ラマン分光法では、試料を周波数ν₀の単色放射(ポンプ)で照射します。ポンプ光の一部は振動モードと相互作用し、非弾性散乱を受け、試料内の分子振動周波数ν _R (ν_AS)=ν₀-(+) ν_Rの光子を生成します。低エネルギーの散乱光(ν_S)はストークス放射と呼ばれ、高エネルギーの散乱光(ν_AS)は反ストークス放射と呼ばれます。熱平衡状態では、ほとんどの分子は低いエネルギー状態を占めるため、反ストークス成分はストークス成分よりも著しく弱いです。このため、ラマン散乱顕微鏡は通常ストークス光子を検出します。分子や固体は複数の振動モードを持つため、ラマンスペクトルは独自の化学的特徴を形成する異なるバンドによって特徴付けられ、材料の同定と解析を可能にします。この手法の主な課題は、自発ラマン散乱の断面積が非常に低く、10〜^10/12光子に1つしかこの過程を経験しないことです。

ラマン散乱顕微鏡の標準的な構成では、励起光は試料の一点に強く焦点を合わせます。弾性散乱されたポンプ光子(通常はスペクトルフィルターを用いて)を排除した後、残りの光は周波数領域分光器(例:分散格子)で収集・特性評価されます。これらのデバイスのスペクトル分解能は~0.5〜1 ^cm-1に達することがあります。測定は、試料の視野角(FOV)内の各点(x,y)に対してポイントまたはラスタスキャン6と呼ばれる方法で繰り返し^{行われます。}このアプローチには主に2つの問題があります。(1) 自発ラマン散乱の断面積が小さいため、分光器の各ピクセルごとに十分な光子を集めるのに通常、長い積分時間(0.1〜1秒)が必要であり、したがって拡張試料のラマンマップには長い測定時間が必要になることがある。(2) ポンプ光による励起は光発光(PL)も生じ、これは自発的なラマン信号と重なり、しばしばそれを圧倒することもあります。

取得速度を向上させるために、ライン スキャニング⁷ の手法を採用することが可能です。これは、ポンプをFOVの線(例えば座標 x)に沿って集束し、収集された信号(PLまたはラマン散乱)を2Dセンサー付きの分光器で分散させることで、与えられた座標 x に対して1軸がスペクトル、もう1軸が空間座標 yに対応する2Dデータセットを生成する方法です.それでも、この実装は分光器の入口スリットによる大きな損失に悩まされています。狭幅はスペクトル分解能を向上させますが、集められた光の量を制限します。

広視野構成は測定時間を短縮するのにより適切かもしれません。この方法では試料の広い範囲を照射し、2Dセンサーのすべてのピクセルのスペクトルを同時に取得します。この場合、単色イメージングカメラの前でバンドパス^{フィルター8}または調整可能なスペクトル^{フィルター9} のいずれかを使用することでスペクトル情報を収集できます。また、この手法は周波数領域アプローチに基づいており、離散的なスペクトルバンド数のみを取得します。

スペクトルを測定する別の方法として、フーリエ変換(FT)法があります。これはウィーナー・キンチンの定理¹⁰に基づく時間領域手法であり、信号のパワースペクトル密度がその時間自己相関のフーリエ変換であると述べています。光学では、実際には干渉計を使って波形の2つの遅延複製を生成することで実現されます。それらの干渉は相対遅延の関数として検出器によって測定され、いわゆる 干渉図¹¹が生まれます。FTアプローチは赤外スペクトル領域のスペクトル測定に広く用いられており、ここではフ ーリエ変換赤外分光 法(FTIR)¹²と呼ばれています。FTIRは中赤外スペクトル範囲(~2.5−25μm波長)における振動遷移の吸収スペクトルを測定するために日常的に使用されています。

時間領域FTアプローチは従来の分散分光計と比べていくつかの利点があります。スリットが存在しないため、スループットが向上する(ジャクイノのエテンデューの利点¹²)、これはスキャン範囲のみに依存する柔軟なスペクトル分解能を提供します。さらに、広視野構成にも適しており、実際2D検出器を使用する場合、各ピクセルごとに1つの干渉グラムを並列に測定し、すべてのピクセルにわたる連続スペクトルの同時記録を可能にします。一方で、FTイメージングシステムは2つの難しい要件を満たす必要があります。(1) 2つの光のレプリカ間の相対的な遅延を光学サイクルのごく一部に制御しなければならないこと;(2) 単一のピクセルで干渉する光線間の位相シフトは、良好なコヒーレンスと高いコントラストを保証するために制限されなければなりません。共通経路^13、14、またはほぼ¹⁵の干渉計に基づく解決策も提案されていますが、それらはやや扱いがかさしく、スペクトル分解能が100cm-1を超えることがあります。

本研究では、光発光およびラマン散乱画像の取得を可能にする新しい広視野顕微鏡が記述されています。このシステムの革新的なブロックは、Translating-Wedge-based Identical Pulses eNcoding System(TWINS)¹⁶と呼ばれるコンパクトで超安定な共通経路複屈折干渉計です。数百回の光学サイクルの遅延スキャンを、光学サイクル自体のごく一部に及ぶ位相精度と高い安定性を提供します。2つの光のレプリカは直交する偏光を持ち、同じ共通経路を共線的に通過するため、二重ビーム干渉計に典型的な経路長の変動の影響を受けません。図1の挿入図に示されているこのスキームは、直交する光学軸を持つ2つの複屈折結晶ブロックから成ります。1つは固定長の(B₂)、もう1つは共通斜辺方向に沿って動かせる2つのくさびに分かれています。入射光は複屈折結晶の光軸に対して45°の角度で_P1によって偏光されるため、エネルギーの半分は通常偏光沿いに、半分は異常偏光沿いに集中します。複屈折ブロックに沿って移動する際、直交する2つの成分は相対遅延を蓄積し、くさびの挿入を変えることでブロック_{B 1}の全体の厚さを細かく調整します。2つ目の偏光子P₂は、電場成分を共通の線偏光に投影し、干渉させます。レプリカ間の遅延τは、(式1)のウェッジ変位xに依存し、光速c α、ウェッジの頂点角、Δn= n、n、0_の通常の屈折率と非常屈折率の差(複屈折)に依存します。スペクトル分解能Δvはスキャン範囲T=|T_{2-T 1}|では、干渉計の初期および最終遅延がT ₁,_{T 2}であり、ラマン分光法で求められる高いスペクトル分解能は高い複方屈折と長いウェッジ平行移動を必要とします。最も一般的な複屈折結晶の中で、YVO₄(イットリウム正方バナ酸イオン)は、可視光から近赤外線までの高Δnと透過範囲に特に適しています。くさびは頂点角10°で設計されており、スキャン長15.3mmで干渉計は600 nmで2500 fsの遅延を与え、関心のある全スペクトル範囲(シリコンカメラ感度が上限)で23 ^cm-1のスペクトル分解能を得られます。本研究では、望ましいスペクトル分解能を達成し、広帯域背景を処理してラマン信号を光発光から切り離すための干渉図サンプリング(ステップおよびスキャン範囲)の適切な設定戦略を提示します。

Candeoら¹⁷による説明によれば、この複屈折分光計は市販の光学顕微鏡と組み合わせてハイパースペクトル測定を行うことができます。要件は以下の通りです:再構成可能な光学顕微鏡本体、TWINS複屈折干渉計、低ノイズモノクロカメラ(例:CCDやsCMOS)、および狭帯域レーザー光源。後者の場合、ラマンおよび蛍光分光法の典型的な励起波長は355 nm、488 nm、514 nm、532 nm、633 nm、785 nmです。材料 表 に記載されているような高スペクトル純度レーザーが最良の選択肢であるにもかかわらず、 装置のスペクトル分解能が限られているため、より広い線幅(例えば~0.1 nm)のレーザーも使用可能です。顕微鏡は、チューブレンズとモノクロ検出器の間の検出経路にTWINSを配置することでアップグレードされます。この構成により、視野全体で均一な経路遅延が得られ、平均コントラストは55%です。励起経路は試料の均一な照明を得るために設計されており、実際には大コアのマルチモードファイバーの出力先端が試料面上でイメージされます。機械式スクランブラーを用いることで、モードはファイバーのコア内で強く結合され、試料面上でフラットトップのプロファイルが形成されます。さらに、振動するボイスコイルは単色放射に典型的なスペックルパターンを平均化します。このトップハット照明の特徴は 補足図1に示されています。ビームは無限遠補正された対物レンズによって試料に集束され、検出経路に向けて逆散乱したラマン光や発光光も集めます。照明を拒否するために必要なフィルターは詳細に説明されます。

このハイパースペクトル顕微鏡で広帯域および狭帯域のスペクトル特徴を測定する方法を示すために、特に図示目的で選ばれた試験試料に対して、発光とラマン散乱の両方を測定します。この試料は、よく知られたラマンスペクトルを持つ3種類の粉末顔料の混合物で構成されており、チタンホワイト(TiO₂)の2つの多形、すなわちルタイルとアナターゼ、そしてカドミウム硫化物イエロー(CdS)です。しかし、同じ手順は材料科学から生物学に至るまで、より広範な応用にも応用可能です。

本記事の範囲はハイパースペクトル測定の手順を示すことであり、TWINS干渉計の組み立てと整列についてはCandeoらが詳述^{しています。}したがって、興味のある実験者はこの技術に基づく事前組み立てされた干渉計から始めるべきです。

プロトコルは、試料の準備と顕微鏡の設置方法から始まり、ラマン散乱およびPL光子を励起・収集する方法を説明します。その後、スキャンパラメータ(スキャン長、サンプリングステップ)および取得パラメータ(露光時間、ハードウェアビンニング)が調査対象信号の要件に応じて設定されます。最後に、後処理パイプラインを提示し、取得した時間データセット(時間的ハイパーキューブ、図2A)から各ピクセル(スペクトルハイパーキューブ、図2B)のスペクトルを取得する手順を詳細に説明し、ノイズ低減および高度なスペクトル解析のアルゴリズムを概説します。全体のワークフローは図3に示されています。

プロトコル

本研究で使用される試薬および機器は 材料表に記載されています。

1. サンプルの調製

注意:この調合中は特に吸入時にCdS顔料が有毒であるため、ラテックス手袋を着用してください。

1. スクレーパーを使って、各顔料粉末を20mgずつ精密な天秤に沈着させ、1:1:1の重さ比率を得ます。
   注意:各サンプルごとにスクレーパーの先端を慎重に清掃し、交差汚染を防ぎましょう。
2. 粉末を乳鉢で混ぜて塊を取り除きます。
3. 得られた混合物を顕微鏡スライドに注ぎます。スクレーパーの先端で優しく押し、ほぼ均一な厚さの層を作ります。
4. 顕微鏡のカバースリップの端にネイルポリッシュを塗ります。ネイルポリッシュを下向きにして混合物の上に置き、密閉する程度の圧力をかけます。数秒乾かしてポリッシュを硬化させます。

2. 顕微鏡のセットアップ

注意:レーザーが点灯している間は安全メガネを着用してください。サンプル面で最大出力が300 mWです。

注:ポンプレーザーの性能は、データシートで指定された温度範囲(例: 材料表に記載されたレーザーの10〜40°C)内で動作すれば、温度変動の影響を受けません。

1. TWINS干渉計を顕微鏡の検出経路に沿って整列させます。
   注:Candeoら¹⁷号に詳述されているように、干渉計モジュールはチューブレンズと検出器の間に設置され、適切な距離を確保する必要があります。本研究で使用される顕微鏡では、接眼レンズモジュールを取り外した場合にのみ保証されます。
2. ケーラー照明方式をレーザー励起に適応させるには、顕微鏡の内蔵励起ランプを取り外し、顕微鏡対物レンズを使って大コアのマルチモードファイバーの出力で光を収集します。
   注:対物レンズの倍率は、ファイバーの先端が試料面と共役した際の照明パターンの大きさを設定します。選択肢としては、10倍/0.25〜0.30の対物レンズがあります。
3. 励起波長を選び、励起レーザーを大芯マルチモードファイバーの入力に集中させます。カメラを起動して、ビジュアライゼーションソフトを起動します。
   1. ファイバーの中央部分をボイスコイルの振動膜に取り付けると、スペックルが除去されます。繊維をきつく曲げて機械的にスクランブルし、すべての空間モードを融合させます。レーザーをつけろ。
   2. アライメント用のテストサンプルを準備します。例えば、顕微鏡のカバースリップに蛍光色の赤色マーカーストライプを付けるなど。
   3. ファイバーの先端を精密移動段階で動かすことで、サンプル面上で均一な強度と明確なエッジを持つスポットを得ることで、照明光学系に対する位置を調整します。
      注:報告されたすべての測定には532nmレーザーが使用されています。400μmのコアサイズのファイバーでは、スポットの直径がカメラの視野角幅の82%をカバーします。
4. 励起経路と検出経路にフィルターセットを用い、以下の基準を採用します(補足図2参照):
   1. 532 nm(2.0 nm帯域幅)の狭帯域パスフィルターを用いてレーザーラインをクリーン化し、ファイバー内の伝播による非線形広がりによるポンプサイドバンドを除去します。
   2. 二色性ミラー( 図1のDM)を用いてレーザー光を試料に反射し、対物レンズが収集した赤方偏移後方散乱放射を透過します。
   3. 残留照明光を除去するために、532 nmのロングパスフィルター( 図1のLPF)を使用します。
   4. ラマン散乱測定中は、600nmのショートパスフィルター( 図1のSPF)を用いて背景蛍光を抑制します。
5. 試料面のパワーメーターでパワーを測定します。ポンプビームを減衰させ、試料で損傷を生まない強度(表1に記載された約2 W/cm^²)を得る。レーザーはシャッターを使い、他の測定パラメータを設定すると良いでしょう。
   注:自発ラマン散乱の断面積が小さいため、信号収集を強化するためには高い出力密度が必要です。ただし、サンプル損傷閾値も考慮する必要があります。ポイントスキャンシステムとは異なり、広視野装置は広い範囲を照らすため、電力の消費効率が低く、試料損傷を防ぐために慎重な電力管理が必要です。
6. サンプルを顕微鏡ステージに置き、フォーカスを調整します。
   注意:焦点を簡単に見つけるには、まず白色ランプを透過または反射で照射してください。後者の場合、顕微鏡の横に置かれた電球を使うことができます。その後、サンプルの焦点はポンプレーザー光で最適化されます。

3. 測定パラメータ

1. ウェッジ移動を行うモーターのドライバーをオンにします。ハードウェアコンポーネント(カメラとモーター)を同時に制御し、ハイパースペクトル測定を行います(補 足図3に示すユーザーインターフェースの例)。
2. カメラの取得パラメータ、露光時間、ハードウェアビンニングを設定し、信号強度を最適化し、以下の指示を採用します。
   1. 時間信号の高い信号対雑音比(SNR)は回収スペクトルのSNRも高くなるため、センサーのダイナミックレンジをよりよく満たす長い露光時間を優先します。
      注意:低信号の場合、ラマン散乱と同様に信号レベルと総測定時間の妥協点を見つける必要があります。最長露光時間は現実的でない場合もあります。
   2. ハードウェアビンニングを選択して、読み出す前により多くのピクセルから電荷を集めましょう。
      注:電荷を合計して単一の読み出しを行う方が、複数のピクセルを読み出してから後処理で信号を合計するよりもノイズ性能が向上します。ビンニングの選択は空間解像度の許容範囲の低下にも左右されます。
3. スキャンパラメータ、総スキャン長、サンプリングステップを以下の基準に従って選択します。
   1. ラマンピークの高いスペクトル分解能を得るには、非対称長くさび形平行移動(-2526 fs→-36 fs)を設定します。一方、ゼロ遅延位置(-65 fs → 65 fs)で対称スキャンを行い、PL信号のより広い帯域スペクトル特徴を検出します。
   2. ウェッジ平行移動xの関数として遅延τを用いる式1を用い、対象のスペクトル帯域幅のナイキスト極限を満たすサンプリングステップを選択します。
      注:スペクトルλ_ミニの最小波長が与えられたとき、(式2)を課す。
      
      ここで複屈折 Δn は波長に依存します(セレマイヤー方程式を参照)。
4. シャッターを開けてレーザーをサンプルに当ててください。信号強度が低下した場合は、試料が静止状態(通常は数秒)に達するまで待ちます。
   注意:信号強度の低下を補うために、ビニングと露出時間を調整して良好なSNRを維持してください。
5. 各ウェッジ位置、すなわち2Dセンサーの各点からのレプリカ間の時間的遅延、すなわちモノクロ画像の取得を開始します。
   注意:取得ソフトウェアは2つの変数を保存すべきです:時間的ハイパーキューブ(2D画像セット)と、スキャン中にエンコーダーが記録した運動位置のベクトルです。
6. 測定が終わったらレーザーを停止し、データ解析を進めます。

4. 取得したデータキューブの処理

1. 取得したデータセットから以下の指示に従ってスペクトルハイパーキューブを生成します。
   1. 特定のステッピングモーターの位置補正ファイルを読み込みます(詳細は議論参照)。
   2. 特定の干渉計の周波数キャリブレーションファイルを読み込み、測定された空間周波数(擬周波数)を実際の光学周波数と関連付けます(議論セクション参照)。
   3. すべてのピクセルの干渉グラムをフーリエ変換して計算するスペクトルの周波数範囲を選択します。
   4. 測定された干渉グラムのウィンドウ化に使えるアポダイゼーション関数¹² の中から、回収スペクトルのスペクトル拡大とアーティファクト削減の良いトレードオフを提供するもの(例えばハップ・ゲンゼル(ハミング)窓などを選びます。
   5. すべてのピクセルのアポーズされた干渉グラムをフーリエ変換してスペクトルハイパーキューブを生成する。複雑な値を保存してください。
      注:FTの複素スペクトルは追加情報を含み、データセットのノイズ除去や選択されたピクセルの平均スペクトル抽出に有用です。
2. スペクトルハイパーキューブが計算されたら、さまざまな調査を行います。例えば、選択された領域の平均スペクトルを取得すること、偽色RGB画像を生成すること;マップのスペクトルピーク;背景を差し引く。
3. 特にラマンスペクトルにおける顕著なピークを圧倒するスペクトルノイズを減らすために、特異価値分解(SVD)¹⁸ を以下の手順に従って実装してください。
   1. 時間的ハイパーキューブを行に干渉図を配置した行列Aに再形成します。
   2. 行列のSVDを行い、A = USV^TとなるU、S、V行列を取得します。
      注意:U列はVの固有ベクトルの空間分布であり、Sは特異値(SV)が降順に並ぶ対角行列です。
   3. Uの各列をピクセルの行列に形を変え、その2次元FTを実行して空間周波数を取得します。
   4. 高周波はマップの非常に急激な変化と関連しているため、それらをノイズと考えます。計算されたフーリエ空間を中心とした正方形領域を定義し、低(主に信号)と高(主にノイズ)周波数を分離します。
      注:この領域の選択肢としては、フーリエ空間サイズに対して辺が1/4である場合もあります。
   5. 境界内のピクセル強度(複素率)の合計を境界外の強度の合計で割ることで、各SVの空間信号比(SSR)を計算します。SV数の関数としてSSRをプロットします。
   6. SSRの閾値、すなわちデータセット内のノイズ寄与を減らしアーティファクトを避けるために保持すべき有意SVの数を定義します。
      注:SSRは通常、特異数が増えるにつれて横ばいになる減少傾向を示します。経験則として、プラトーが始まる地点までは特異値を保持するのが良いでしょう。
   7. 対角行列Sの下位SVをすべてゼロに設定し、Sを_{デノイズ化し、} 脱ノイズされた時間的超立方体をUS_{消ノイズV} ^Tとして計算します。
      注:SVDは行列分解法であり、再形成されたスペクトル超立方体(干渉図ではなくスペクトルを含む行)にも適用可能です。
4. デノイズ処理された時間的ハイパーキューブでステップ4.1-4.2を繰り返し、スペクトルを取得します。
5. 多変量曲線分解法-交互最小二乗法(MCR-ALS)アルゴリズムでデータセットのより詳細な解析を行うには、参考文献¹⁹ のリンクからプログラムをダウンロードしてください。
   注:ソフトウェア開発者はアルゴリズム²⁰の詳細な説明を提供します。これは混合解析問題を解く反復的な手法であり、各スペクトルは純粋なスペクトルプロファイルの線形結合として表現されます。行列表現では、B = C R^T+E(ここでBはデータセット、Cは各スペクトルの濃度、Rの列は構成要素の参照スペクトル、Eは誤差を表します)。
   1. スペクトルハイパーキューブをN_ピクセル×Nピクセルの_行列に再構成し_{、ピクセル数}Nピクセル、周波数ベクトル長Nピクセルの合計を割り当てます。
   2. 試料に含まれるとされる種の数を選択し、それらの基準スペクトルを読み込みます。
      注:基準スペクトルは各顔料ごとに個別に測定可能です。そうでなければ、プログラムはデータセットのSVDを作成し、選ばれた成分だけ多くの主成分を初期推測に使用します。
   3. 制約条件の選択:回収されたスペクトルプロファイルは非負で、参照スペクトルにできるだけ近いものでなければなりません。
   4. 各種ごとに濃度マップ(Cの再形状カラム)とスペクトル(Rのカラム)をプロットします。
   5. これらのマップをエクスポートし、偽色画像(図4A)を作成し、解析を締めくくります。
      注:ここで提示された結果を得るために使用されたプログラムは公開されていませんが、著者から要望があれば入手可能です。

結果

図4Aは粉末混合物の選択領域におけるラマンマップを示しています。これは、ステップ4.5で説明されているように、MCR-ALSで取得した存在量マップの偽色表現です。この方法により、3種がFOV内で明確に区別できるため、サンプルの組成に関する情報を提供します。図4Bは、マップの選択領域における平均スペクトルを示しており、選択されたスキャン長によって定義されるスペクトル分解能は23 ^cm-1です。選択したフィルターセットでは105〜2130 ^cm-1の範囲を測定できます(補足図2参照)が、主な種識別ピークが存在する285〜750 ^cm-1しか報告されていません。文献^21,22の参照スペクトルと比較すると、各顔料の特徴的なピークは識別可能です(縦...

ディスカッション

自発的なラマン散乱および発光画像の取得のために広視野FTマルチモーダル顕微鏡が導入され、材料科学にも応用可能です。生物学的サンプルへの適用性は、Candeoら¹⁷によって示されており、染色されたヒト細胞のハイパースペクトル蛍光画像を示しています。この分野におけるラマン散乱測定の主な課題は、広く照らされた領域からの非効率的な熱放散による光損傷を防ぐことです。一つの解決策としては、より長い励起波長(例:785 nm)を用いて電力吸収を減らす方法があり、その代わりにラマン散乱断面積が低下するという欠点があります。あるいは、水浸しの目的物を用いて熱の放散をより効果的にすることも可能です。

マルチモーダリティは時間領域アプローチに本質的に組み込まれています。これにより、調査対象の信号(光発光またはラマン散乱)に応じてサンプリング戦略を選択できます。概念を説明するために、フーリエ変換演算の2つの性質を思い出します( 図6...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
八瀬	クロノス	1200	白色TiO2 顔料の多形
カドミウム硫化物粉末	クレマー・ピグメンテ有限会社&中隊	21060	カドミウムイエロー、色指数暗/PY35
カメラ	アンドール	ルカ・R	1004×1002ピクセルの8&マイクロ電子増殖CCDカメラ;m x 8µm
クリーンアップフィルター	セムロック	LL01-532-12.5	Ø1/2インチ 2.0 nm- FWHMレーザーラインフィルター、532 nm
カバースリップ	BRAND GmbH &コロニー	4700 55	ホウケイ酸ガラス 22x22x0.15mm 顕微鏡カバースリップ
二色鏡	セムロック	Di02-R532-25x36	532nmの25.2x35.6 mm単一エッジレーザー二色性ビームスプリッター
ファイバー	ソーラブ	M74L05	400µmコアサイズ、NA 0.39マルチモードファイバー
レーザー	フブナー・フォトニクス	コボルト・サンバ1000	CWダイオードポンプレーザーは532nm、最大出力1000mW
ロングパスフィルター	セムロック	LP03-532RU-25	532 nmの超急勾配ロングパスエッジフィルタ
顕微鏡	ライカ	DMRBE	三目鏡研究用顕微鏡
目的	ライカ	PL-フルオター、10倍/0.30	励起・集光対物レンズ(10倍倍率、0.3NA)
目的	ニューポート	M-10X	照明経路中の対物レンズ、10倍倍率、0.25NA
ルチル	クロノス	2900	白色TiO2 顔料の多形
ショートパスフィルタ	ソーラブ	FESH600	Øカットオフ波長600の25.0 mmショートパスフィルター
スライド	マリエンフェルト	1000612	76x26x1mmの顕微鏡スライド