神経毒性のリードアウトとしての Drosophila melanogaster の自発運動機能障害の行動解析

サマリー

このプロトコルは、従来の哺乳類モデルに代わるものとして、自発運動機能障害の定量化を通じてショウジョウバエの神経毒性を評価するためのハイスループットで費用対効果の高い方法を提供します。これは、高感度で再現性があり、倫理的に有利なモデルを使用して、医薬品化合物、環境剤、または遺伝子組み換えの神経毒性効果を評価することを目的としています。

要約

このプロトコルは、自発運動機能障害を定量化することにより、ショウジョウバエ(Drosophila melanogaster) の神経毒性を評価するためのハイスループットで費用対効果の高い方法を提供します。従来の哺乳類モデルは効果的である一方で、資源を大量に消費し、倫理的に制約されているため、代替の in vivo モデルの必要性が浮き彫りになっています。現在のアプローチは、従来のクライミングアッセイとリアルタイムのモニタリングプラットフォームを統合して、個々のハエの運動障害を捕捉します。この組み合わせたシステムにより、感度、自動化、再現性が向上し、神経毒性スクリーニングのためのスケーラブルな戦略が実現します。重要な手順には、標準化された飼育条件、ハエの死亡率や行動の変化を最小限に抑えるための慎重な麻酔と取り扱い、およびシステムの適切なキャリブレーションが含まれます。マイクロキャピラリーベースのフィーディングにより、摂取定量化をオプションとして統合し、自発運動分析を補完し、必要に応じて化合物摂取量を評価できます。この手法は、リアルタイムおよび長期的な行動モニタリングをサポートし、観察者のバイアスを減らし、実験を中断することなく日々の進捗評価を可能にします。光嗜好性試験は、直接測定を使用して組み込むことができます。このプラットフォームは、動作の解像度、スループット、およびデータの一貫性において大きな利点を提供します。一部の代替システムに見られるリアルタイムの蛍光機能はありませんが、大規模な行動スクリーニングには非常に効果的です。このプロトコールは、高感度で再現性があり、倫理的に有利な in vivo モデルを使用して、医薬品化合物、環境剤、または遺伝子組み換えの神経毒性効果を評価することを目指す研究室にとって特に価値があります。

概要

神経毒性の評価は、環境化合物や医薬品化合物が発達中の神経系に及ぼす潜在的な悪影響を評価するために重要です¹。従来の神経毒性試験は、げっ歯類などの哺乳類モデルに依存しており、高価で時間がかかり、倫理的に制約されています²。したがって、神経毒性物質の迅速でハイスループットなスクリーニングを可能にする代替モデルが必要です³。研究によると、ショウジョウバエは、その特徴付けられた遺伝学、保存された神経発達経路、および短いライフサイクルにより、神経毒性を研究するための強力なモデル生物として浮上しています^4,5。行動評価項目の中で、運動機能障害は神経発達障害の感度が高く定量化可能なバイオマーカーとして機能し、ヒトの神経障害と相関する可能性のある神経毒性作用の早期検出を可能にします⁶。

ハエの自発運動アッセイは、神経毒性の定量化可能な尺度を提供し、用量反応評価を可能にするため、ヒトの神経毒性リスク低減に関連性があります⁷。ネガティブジオタクシスアッセイ(クライミング)は、ハエがバイアルの底にタップされた後、本能的に登る広く使用されているアプローチであり、これはハエの運動発達、協調、およびバランスのレベルを反映しています^8,9。この方法はシンプルで費用対効果が高く、重度の自発運動異常や明白な障害の評価に役立ちますが、運動の一次評価しか提供せず、神経毒性物質によって誘発される症状の微妙な運動障害、洗練された変化、および長期的な行動モニタリングの検出に感度が不足している^{可能性があります8。}これらの制限に対処するために、Ethoscopeシステムなどのより高度なモーショントラッキング技術が開発されました¹⁰。この自動録画システムは、ハエの行動を高精度かつ再現性よく分析するために特別に設計されたハイスループットのビデオ追跡デバイスです¹¹。従来の自発運動アッセイとは異なり、このシステムは、動きの継続的なリアルタイムモニタリングを提供し、従来のクライミングアッセイでは見落とされがちな微妙な行動異常を捕捉します11,12,13。この技術は、ハエの動きを高解像度で連続的に記録する赤外線照射カメラシステムを使用した自動ビデオトラッキングを特徴としており、観察者バイアスを排除し、実験の再現性を向上させます¹³。さらに、微小な動きを検出し、歩行、休息、およびグルーミング、摂食、けいれんなどの細かい動きを区別し、運動行動のより詳細な分析を提供します¹³。長期的な行動モニタリングが可能であり、長期間にわたる継続的な追跡が可能であり、進行性の神経毒性影響の評価に理想的です¹⁰。ビデオ録画システムのスケーラビリティとハイスループット容量により、複数のハエの並行追跡が可能になり、複数の神経毒性化合物と遺伝的状態の同時スクリーニングが容易になります¹⁰。さらに、このシステムはオープンソースソフトウェアを統合しているため、研究者は睡眠覚醒サイクル、概日リズム、詳細な運動指標^10,14などの実験ニーズに基づいて分析パイプラインをカスタマイズできます。PythonベースのフレームワークであるEthoscopyの統合など、最近の進歩により、データ分析が強化され、行動研究のアクセシビリティと再現性が向上しました¹⁴。このフレームワークにより、研究者はより複雑な移動解析を実行しながら、専門家でないユーザーの障壁を減らすことができます。Jupyterベースの環境であるethoscope-labは、シームレスなデータ処理をさらに容易にし、共同研究を促進し、実験の再現性を確保します¹⁴。

この研究では、従来のクライミングアッセイと並行してハイスループットビデオトラッキングプラットフォームを活用することで、発達神経毒性物質曝露後の運動機能障害を包括的かつ高感度に評価します。微細な自発運動障害を解析する能力は、神経発達と運動協調を混乱させる化合物をスクリーニングするための強力なツールとなります。神経毒性スクリーニングのためのショウジョウバエの使用は、コストの制約のために大規模なスクリーニングがしばしば制限される脊椎動物モデルと比較して、費用対効果やハイスループット能力など、いくつかの利点を提供する¹⁵。ハエモデルは、迅速な遺伝子操作を可能にして、病状を模倣し、神経毒の影響を受ける分子経路を特定する¹⁶。ハエは哺乳類の神経系よりも単純ですが、神経発達と運動制御に関与する主要な保存された経路を保持しています¹⁷。リアルタイムビデオレコーダーシステムなどの高解像度追跡方法により、データの精度と再現性が向上し、毒物曝露によって引き起こされる運動障害の早期検出が可能になります¹¹。

トラッキング技術と従来のクライミングアッセイの統合により、継続的な高解像度の行動モニタリングが可能になり、神経毒性物質への曝露によって引き起こされる微妙な運動障害を検出するための堅牢でスケーラブルな方法が提供されました。遺伝ツール、短いライフサイクル、高度な行動解析の組み合わせにより、ショウジョウバエは神経毒性スクリーニングのための脊椎動物モデルの強力な代替手段として位置付けられ、最終的にはより安全な医薬品開発と環境リスク評価の改善に貢献します。

プロトコル

一例として、このプロトコルは、 Physalis physalis 毒画分の神経毒性の可能性を評価するために使用されました。対照群は、試験化合物を含まない生理学的緩衝液とショ糖溶液のみを受け取りました。すべての実験はW¹¹⁸ 株で行われました。ショウジョウバエの実験は、動物飼育規制の対象外であるため、倫理的クリアランスは必要ありません。

1. 試薬とサンプル調製

1. 特定のアッセイの要件に応じて、PBS(10 mM、pH 7.0)またはHEPES(10 mM、pH 7.0)などの生物学的緩衝液と、ショ糖の10 Mストック溶液を調製します。反復回数と実験の期間に基づいてサンプル量を計算します。
2. 生物学的緩衝液を使用してサンプルを所望の濃度に希釈し、最終濃度1 Mまでスクロース溶液を補充します。サンプルが透明な場合は、適切な食用色素(0.1 mg/mLの青色または赤色の色素など)を添加して、摂食行動を視覚的に評価できます。本研究では、 Physalia physalisの 毒分画をPBSを使用して最終濃度10μg/μLに希釈し、さらにショ糖溶液と食用色素を補給しました。
3. 緩衝液のみを含むネガティブコントロール溶液を調製し、溶液にショ糖を最終濃度1 Mまで補充し、食用色素を添加します。本研究では、ネガティブコントロール溶液としてショ糖と食用色素を添加したPBSを用いた。
4. ショウジョウバエ培地については、¹⁸に記載されているプロトコルに従ってください。

2.生体材料のメンテナンス

1. 健康で性的に成熟した成虫のハエを、作りたての食品培地が入ったボトルに移します。続行するには、ハエをボトルの底に軽くたたいて開け、ボトルを反転させてハエ媒体を含む新しいボトルに移します。ボトルを25°Cに設定したインキュベーターに置き、明暗サイクル12時間、湿度50%にします。ハエが一晩(約16〜22時間)卵を産むのを待って、十分な同期卵を収集します。
2. 産卵後、70%エタノールを含む新しいボトルを使用して、成虫のハエを捨てます。これにより、追加の産卵が防止され、年齢の同期が確保されますが、これは年齢の変動が最小限に抑えられた成虫のコホートを取得するために重要です。
3. 均一な開発をサポートするには、ボトルを同じ制御された条件(25°C、12時間の明暗サイクル、50%の湿度)で維持します。成虫は9日目または10日目頃に羽化し始めます。発達の進行を監視することは、成虫の出現のタイミングを予測するのに役立ちます。
4. 採取したハエを、アッセイの所望の年齢に達するまで、同じ制御条件下で維持します。発芽後24〜48時間以内に使用してください。この制御されたエージングプロセスにより、ばらつきを最小限に抑え、実験結果の信頼性を高めることができます。

3. ネガティブジオタキシスアッセイ

注:ネガティブジオタキシスアッセイの概略図を 補足図1に示します。

1. 実験当日は、ハエを空のボトルにそっと移します。
2. ハエは、移動と取り扱いのストレスを最小限に抑えるために、移動前に氷上で短時間麻酔をかける必要があります。この目的のために、ハエが入ったボトルを氷の箱の中に入れ、ボトル全体を覆います。
3. 1分後、ボトルを軽くたたいて、すべてのハエが麻酔されていることを確認します。さらに1分間氷の上に置いて、ストレスを引き起こしたり、クライミング能力に影響を与えたりすることなく完全な麻酔を確保します。
   注:CO₂などの特定の麻酔薬は、クライミング行動の障害を含むその後の行動に影響を与え、陰性のジオタキシスキャンアッセイの結果に影響を与える可能性があることに注意してください。
4. ハエに麻酔をかけている間に、氷で満たされた小さな容器を準備し、氷の上にペトリ皿または平らできれいな表面を置いて、冷えたプラットフォームを作成します。この設定は、選別中に麻酔を維持し、回復時のハエの動きを最小限に抑えるのに役立ちます。
5. 氷上で2分後にハエが完全に固定されることを確認して麻酔を評価します。完全に麻酔をかけたら、冷やしたペトリ皿の上にチューブを反転させ、軽くたたいてハエを放出することにより、ハエを静かに移します。冷たい表面は、取り扱い中にハエを固定するのに役立ちます。
6. 細い絵筆を使用し、実体顕微鏡(利用可能な場合は10倍と20倍の倍率)で、サイズや色素沈着パターンなどの特徴的な特性に基づいて、オスとメスのハエを優しく分離します。男性は一般的に小さく、幅の広い黒い帯がありますが、女性は大きく、腹部が軽くて細長いです。ハエに対する麻酔の影響を最小限に抑えるために、この手順をできるだけ早く実行してください。
   注:実験に性分化が不要な場合は、分離ステップを省略してください。曝露時間を最小限に抑え、ハエを優しく扱って、ストレスや潜在的な行動の変化を減らします。
7. 選別されたハエを適切な割り当てで空のバイアルに慎重に移します。アッセイを進める前に、制御された環境(25°C、12時間/12時間の明暗サイクル、湿度50%)で約30分間麻酔から回復させます。
8. マイクロキャピラリーフィードの調製では、ピペットを使用して、各マイクロキャピラリーチューブに10μLの試験溶液を手動でロードします。すべてのサンプルで容量が一貫していることを確認し、供給条件を標準化します。
9. ピペットを使用して、マイクロキャピラリーの開放端に3〜5μLの鉱油を加えます。これにより、実験中にサンプルが蒸発して漏れるのを防ぎます。
10. 事前に充填されたマイクロキャピラリーを綿バイアルプラグの穴に挿入し、しっかりと配置されていることを確認します。必要に応じて、事前にカットしたチップを使用して、空気の流れを妨げずに綿をしっかりとフィットさせます。
11. ハエの入ったバイアルを25°Cに設定したインキュベーターに、12時間/12時間の明暗サイクルで入れます。実験中はそのままにし、マイクロキャピラリーを毎日手動で作りたての食品と交換して、一貫した曝露を確保します。曝露期間は、サンプルの毒性と性質によって異なり、通常は2〜7日間です。
12. 12時間間隔で、ハエを清潔な空のバイアルに移し、自発運動活動を評価します。
13. 油性マーカーを使用して、バイアルの底から7 cmの線を測定し、印を付けます。この高さがクライミングターゲットとして機能します。
14. カメラまたは電話を安定した場所に置いて、登山行動を記録します。分析のために、適切な照明と透明な背景を確保します。実験セットアップがカメラの視野と互換性があることを確認します。
15. バイアルを軽くたたいてハエを底に持ってきてから、すぐに録音を開始します。ハエを傷つけたり、方向感覚を失わせたりする可能性のある過度の力は避けてください。
16. 記録を確認し、各フライがマークされた7cmラインに到達するのにかかる時間を測定します。最大制限時間を設定します(例:30秒)。この時間は、ラインに到達できなかったフライに割り当てます。
17. 協調性のない動き、クライミングの開始の遅れ、不規則なクライミングパターンなどの異常な行動には細心の注意を払ってください。これらの徴候は、試験された化合物の神経毒性作用を示している可能性があります。
    注:飼料調製の詳細な手順については、キャピラリーフィーダー(CAFE)アッセイプロトコル¹⁹を参照してください。この方法は、ショウジョウバエの液体食品源を調製するための正確なガイドラインを提供し、食物摂取量の正確な定量を確保し、摂食実験のばらつきを最小限に抑えます。

4. リアルタイムモニタリングアッセイ

注意: トラッキングシステムコンポーネントの概略図とキャリブレーションプロトコルを含むセットアップについては、以前の出版物^11,12に従ってください。実験の一般的な概要を補足図2に示します。

1. リアルタイムロコモーションアッセイ(トラッキングアッセイ)
   1. 手順3.8〜3.9を繰り返して、サンプルと鉱油シールを使用して供給マイクロキャピラリーを準備します。
   2. 透明なプラスチック製のストローを使用して、それぞれ約6cmの長さの個々の移動チャンバーを準備します。これらのストローは、録音に適した費用対効果の高い透明なエンクロージャとして機能します。チューブは、ハイスループット行動研究のために20本のチューブを収容する睡眠アリーナ¹¹と互換性がある必要があります。
   3. 各ストローの一方の端を透明なフィルムで密封し、気密性を確保します。密閉された端の近くに、供給マイクロキャピラリーの挿入を収容するための小さな穴を作ります。穴が十分に大きく、アッセイ中に漏れや動きを引き起こすことなくマイクロキャピラリーをしっかりと保持できることを確認してください。
   4. 手順3.1〜3.6を繰り返して麻酔をかけ、オプションで分離し、細い絵筆を使用して各チューブに麻酔をかけたフライを1匹静かに配置します。各チューブの開放端を透明フィルムまたは綿のプラグで密封し、空気の流れを確保し、ハエを封じ込めます。
   5. 組み立てたチューブをアリーナに配置し、各マイクロキャピラリーが毎日交換できるように外部からアクセスできるようにします。あらかじめ充填されたマイクロキャピラリーを各チューブに挿入します。ハエが回復し、順応するまで約30分間待ってから、アッセイを開始します。
   6. デバイスを制御された環境条件(例:25°C、12時間/ 12時間の明暗サイクル、湿度50%)のチャンバーに置きます。デバイスをネットワークまたはローカル追跡システムに接続します。
   7. プラットフォームにアクセスし、実験に割り当てられたデバイスを見つけます。マーカーで示されているように、システムが各フライを正確に追跡していることを確認します。関連するすべての実験メタデータを入力し、アッセイの記録を開始します。高度なデータ分析のためには、ハイスループットの行動データ分析^11,12のために設計されたRパッケージであるrethomicsフレームワークを使用する。
   8. マイクロキャピラリー内の食品を毎日、作りたての溶液と交換してください。各フライを毎日目視検査して、通常3〜5日間続く実験期間中の生存と適切な行動を確認します。
2. 概日リズム評価
   1. ハエの概日リズムとその潜在的な変化を調査するには、実験が定義された明暗サイクルと同期して開始されることを確認してください。記録フェーズ全体で12時間の明るい日長/12時間の暗い日長を維持して、内因性リズムの乱れを防ぎます。条件を設定したら、手順4.1.1〜4.1.8を繰り返し、すべての手順が明暗相全体で一貫して実行されることを確認します。
3. 明暗選好行動の評価
   1. 手順3.1〜3.11を繰り返して、ハエを準備し、マイクロキャピラリーを供給します。
   2. 給餌バイアルを調製したら、インキュベーターに入れて、ハエが試験サンプルを2時間(または以前の自発運動活動データによって決定される別の期間)摂食できるようにします。
   3. 光の好みの挙動を評価するには、各チューブの50%をアルミホイルで覆う個々のロコモーションチャンバーを準備して、明確な暗領域を作成します。標準化された比較を可能にするために、すべてのチューブで一貫したカバレッジを確保します。
   4. 手順4.1.2-4.1.4を繰り返して、ハエを個別に移動チャンバーに移し、マイクロキャピラリーの挿入を省略します。
   5. 準備したチューブをアリーナに置き、ハエが約30分間順応するのを待ちます。
   6. 手順4.1.6〜4.1.7を繰り返し、ハエの行動を60分間記録します。動きの減少が記録されているチューブは、追跡システムが箔で覆われた領域にあるハエを検出して障害物を知らせないため、暗い好みを示している可能性があります。

5. データ分析

1. ID、処理、化合物の詳細、アッセイ期間、その他の関連変数など、必要な情報をすべて含めてメタデータテンプレートを準備します。テンプレートの例と対応するデータ処理パイプラインは、 補足表 1 に含まれています。
2. 完成したメタデータファイルをCSV形式で保存します。互換性を確保するには、テキスト エディターで CSV ファイルを開き、不要な文字や書式設定の問題が含まれていないことを確認します。無関係な文字がある場合は、削除します。
3. データ分析を進める前に、データのバックアップを作成してください。ターミナルを開き、次のコマンドを実行します: sudo python backup_tool.py。この手順により、分析中の潜在的な損失や破損からデータが保護されます。
4. 実験に対応するデータファイルの場所を特定し、メモします。これらのファイルが分析のためにアクセス可能であることを確認してください。
5. Rethomicsを使用してデータを分析します。RStudio を開き、行動データ分析に必要な Rethomics パッケージを読み込みます。詳細な手順とチュートリアルは、RethomicsのWebサイトで入手できます https://rethomics.github.io/scopr.html

結果

一例として、このプロトコルは、 Physalis physalis 毒画分の神経毒性の可能性を評価するために使用されました。治療群は、ショ糖溶液(最終濃度1Mまで)を添加した生理学的緩衝液と試験毒画分を与えられたハエで構成されていました。対照群は、試験化合物を含まない生理学的緩衝液とショ糖溶液のみを受け取りました。すべての実験はW¹¹⁸ 株で行われました。

記載された方法では、未処理のハエ、対照群は、典型的な移動行動および上昇行動(陰性の表現型)を示し、一方、毒性画分に曝露されたハエは、治療された群(陽性の表現型)を表し、しばしば運動活動障害を示した。代表的な結果には、プラットフォームによって記録されたように、上昇速度の低下、登山マークに到達するまでの時間の増加、および総移動距離の減少が含まれます。

クライミングパフォーマンスは、ネガティブジオタキシスキャンアッセイを使用して評価されました。本研究では、 図1に見られるように、2...

ディスカッション

主に、非致死量(亜致死量)を確立することは、神経毒性実験を実施するための重要な最初のステップです。これにより、ハエは研究全体を通じて生存可能であり、死亡の交絡因子なしに行動および自発運動の影響を観察することができます。私たちの研究では、 Physalia physalis venom 画分の亜致死量は 10 μg/μL と決定されました。堅牢で再現性のある結果を得るためには、処理群ごとに最低3回の生物学的レプリケートが推奨され、それぞれが10匹のハエと少なくとも3回のテクニカルレプリケートで構成されます。これは、実験条件ごとに最低30匹のハエが、3つの独立した実験でテストされたことに相当します。この設定により、統計検出力が向上し、ばらつきが最小限に抑えられるため、治療による行動変化を確実に検出できます。このプロトコルでは、さまざまなデータを使用して数値を作成し、神経毒性の変化を検出するためのこのメソッドの感度を実証しました。実験の初期に死んだハエや統計的な外れ値は、データの正確性を確保するために取り除く必要があります。広範なデータセットを収集することで...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アルミホイル	-	-
青い染料	レイナー	-	レイナーズ ブルー染料 28ml
カメラモジュール2 NoIR	ラズベリーパイ	096-4062	Mauser.pt に供給
綿ロービング	シグマ・アルドリッチ	BR28205
ショウジョウバエストックボトル	VWRの	VWRI734-1249	ボトルフライラウンド 60Z
ショウジョウバエのバイアル	VWRの	WRI734-2255
ガラス製ペトリ皿	シグマ・アルドリッチ	BR455701
マイクロヘマトクリット毛細血管	シグマ・アルドリッチ	BR749321
MicroSDカード	-	-	Raspberry Pi OSのインストールには、少なくとも32GBのストレージを備えたSDカードを使用することをお勧めします
Micro-USB電源	ラズベリーパイ	096-4585	Mauser.pt に供給
鉱物油	バイオラッド	#1632129
ペイントブラシ	-	-
リン酸緩衝サリイン(PBS)	さまざまな会社から調達されたコンポーネント	-	対照群の食品を調製するために使用され、サンプルの希釈に使用される緩衝液。10 mM pH 7
ショウジョウバエのバイアルおよびボトル用プラグ	VWRの	VWRI734-2875
ショウジョウバエのバイアルおよびボトル用プラグ	VWRの	VWRI734-2673
シーリングフィルム	シグマ・アルドリッチ	HS234526C
シングルボードコンピュータ (3 モデルB)	ラズベリーパイ	096-5700	Mauser.pt に供給
サクロース	シグマ・アルドリッチ	S9378
透明プラスチックストロー	-	-	エトスコピック睡眠アリーナ(6.5cm×0.5cm)に対応できるもの