精密な運動分類を持つラットにおけるセボフルランの最小肺胞濃度を推定するためのDixonの上下設計の適用

サマリー

本明細書に提示されたプロトコルは、標準化された疼痛刺激を受けた鎮静ラットにおけるディクソンの上下デザインを利用して麻酔の深さを評価することを目的としています。さらに、観察されたさまざまな動きパターンの分類を描写します。

要約

揮発性麻酔薬を使用する場合、効力の標準的な尺度は最小肺胞濃度 (MAC) であり、被験者の 50% が痛みを伴う刺激に対して運動反応を示さない肺胞濃度として定義されます。臨床研究および実験研究では、現在のコンセンサスでは、「意図的な全体的な動き」のみが肯定的な運動反応としてカウントされ、したがって、鎮静が軽すぎることを示している可能性があると述べています。ただし、人間と動物の両方における適切な麻酔レベルは、投与される他の薬剤などのさまざまな影響要因に基づいて個別に異なります。最も一般的に使用される揮発性麻酔薬の1つであるセボフルランに対するテトラヒドロカンナビノールとエタノールの効果を調べるために、ラットを対象とした2つの動物実験が実施されました。MACを推定するために、ディクソンの上下設計が採用されました。最初の動物には、所定の用量のセボフルランが選択されました。15 分間の平衡期間の後、外科用クランプを使用して、ラットの尾の遠位 3 分の 1 に標準化された疼痛刺激を加えました。刺激に対する動物の反応は、肯定的または否定的として記録されました。陽性の運動反応が起こった場合、次の動物の用量を増量しました。逆に、ラットが運動反応を示さなかった場合、以下の動物の用量を減量した。等張回帰とブートストラップ法を使用して、MAC と 95% 信頼区間を推定しました。この記事では、アップおよびダウンデザインを使用してラットの麻酔深度を評価するための詳細なプロトコルの概要を説明します。また、将来の研究の再現性を高めるために、標準化された痛みを伴う刺激が適用された場合の鎮静ラットの運動パターンの斬新で詳細な説明と分類を提供します。

概要

セボフルランは、最も頻繁に使用される揮発性吸入麻酔薬の 1 つです¹。その効力は、患者の 50% が痛みを伴う刺激に対して運動反応を示さない肺胞濃度として定義される最小肺胞濃度 (MAC) を使用して評価されます ^2,3,4。MACを確立するために、ラットはヒトに比べて均質性が高いため、動物モデルとして使用できます。痛みの刺激は、通常、ラットの尾の遠位3分の1に外科用クランプを使用して適用^{されます2。}疼痛検査に代替方法を使用しても、以前に実施された研究との比較可能性は保証されないため、異なる結果が生じる可能性があります。刺激に反応する動きのパターンは非常に多様であるため、現在のコンセンサスでは、「全体的な意図的な動き」のみが正の運動反応と見なされるべきであると述べています³。しかし、この定義には、どの特定のカテゴリーが「総たに目的がある」とみなされるのか、また運動がこの基準をどの程度満たすべきかについて、さらなる洗練が欠けています。刺激に対する運動反応は、臨床現場では鎮静の深さが不十分であることを示している可能性があるため、これは最も重要です。

年齢⁵、併存疾患⁶、肝機能障害⁷、低体温症⁸ など、さまざまな要因が麻酔状態に影響を与えます。さらに、麻酔薬と一緒に投与される薬剤は、麻酔の深さに大きな影響を与えます。たとえば、導入段階でよく使用されるフェンタニルとプロポフォールは、セボフルラン ^9,10 の必要量を減らします。さらに、リドカインまたはプレガバリンがセボフルラン^11,12 の MAC を低下させる可能性があることが示されています。さらに、アルコールやテトラヒドロカンナビノール (THC) などの物質の最近の摂取も MAC を減少させる可能性があり、麻酔の深さを高める可能性があります^13,14。逆に、交感神経刺激薬は中枢神経系を刺激することにより鎮静を軽減する可能性があることが示唆されています¹⁵。

将来の研究の再現性を高めるために、Dixonの上下デザイン¹⁶ を使用してラットのMACを評価するための詳細なプロトコルとビデオの説明が提供されます。以前の MAC 研究とは対照的に、このプロトコルは、ラボ間の再現性をサポートするための詳細な手順の概要を示しています。さらに、以前に発表された 2 つの研究のビデオ映像が再分析され、運動反応がその程度とパターン (調整された動き - ローリング、ストレッチ、塩性、および調整されていない動きのカーリング) に基づいて分類されました。したがって、この研究は、標準化された痛みを伴う刺激に反応する鎮静ラットの運動パターンの革新的かつ徹底的な説明と分類も提供し、将来の研究の再現性を向上させることを目的としています。

プロトコル

すべての実験動物研究は、ウィーン医科大学の動物実験のための学内委員会および管轄の規制当局(オーストリア連邦女性科学研究省)によって承認されています。実験は、常に維持された麻酔下で行われました。動物は、たとえ動きが起こったとしても、意識的に痛みを知覚しません¹⁷.81〜95日齢の成体Wistarラットを使用しました。

1. 動物と住居を研究する

1. 体重と性別に応じて動物を飼育します。オスとメスを分離し、順応できるように実験を開始する前に最低14日間収容します。ケージあたり最大3匹のラットを400g以上、または4匹のラットを400g未満に配置します。
2. 12時間の明暗サイクル、周囲温度22°C、湿度レベル45%から65%で環境条件を維持します。
3. 各動物の体重を定期的に測定し、各手順の前に体重を記録します。
4. 動物を住宅エリアから試験施設まで個別に輸送します。視覚的ストレスを軽減するために各ケージを布で覆い、実験手順にさらされないように、テストされていない動物を別の部屋に収容します。

2. 機器のセットアップ

1. 実験を開始する前に、必要なすべての機器が機能し、利用可能であることを確認してください。該当する場合は、リークテスト、校正、電源機能テストなど、組織のガイドラインまたは標準操作手順に従って機器チェックを実行します。
2. ラットを配置するには、気密性のある透明なチャンバー(15 cm×20 cm×9 cm)を使用してください。ガス漏れを最小限に抑えながらテールを外部からガイドするために、チャンバーに 15 mm の開口部が装備されていることを確認してください。
3. 流入ラインをセボフルラン気化器と酸素源に接続します。
4. チャンバーの反対側にある流出ラインをガス抽出システムと麻酔モニターの両方に接続して、セボフルラン濃度を記録します。
5. 直腸体温計、加熱ブランケット、赤外線加熱ランプが動作していることを確認します。基準装置に対して温度計をテストし、加熱ブランケットが目標温度範囲に達していることを確認し、赤外線ランプが点灯して安定した出力を維持していることを確認します。地域の安全手順に従って、ランプを試験室の真上に安全な距離を保ちます。
6. 標準化された痛みの刺激に使用する 25 cm の動脈クランプを準備します。

3.薬剤の調製

1. THCの調製(オプション)
   1. 濃度25mg/mLのTHC製剤を使用してください。体重(キログラム)に(10 mg / kg / 25 mg / mL)を掛けて、各動物に必要な体積を計算し、体重1kgあたり0.4 mLになります。
   2. 容積式ピペットを使用して、各動物の正確な計算量を作成します。この段階では投与しないでください。ピペットを準備し、薬物投与ステップで後で投与するために取っておきます(ステップ4.6を参照)。
   3. 最大0.3 mLの液体を安全に保持できるものなど、強制経口投与に適したピペットチップを使用してください。ロードされたピペットを使用して直接経口強制検挙を行います。相互汚染を防ぐために、使用後は毎回ピペットチップを廃棄してください。
2. エタノール調製(オプション):
   1. エタノールを1 g / kgまたは2 g / kgの必要な用量濃度で調製します。高濃度のエタノール製剤(例えば、96-100%)をベースとして使用し、それを0.9%生理食塩水に溶解して、個々の動物の総体積10 mL / kg体重にします。対応するプラセボと同じ量の生理食塩水を単独で使用してください。すべての機関の安全ガイドライン、特に可燃性物質の取り扱いと保管に関連するガイドラインに従ってください。
   2. 適切な注射器 (動物の体重に応じて 5 mL または 10 mL) を使用して、個々の動物ごとに正確に計算された量を作成します。この段階では物質を投与しないでください。注射器を準備し、薬物投与ステップ中に腹腔内注射のために取っておきます(ステップ4.6を参照)。投与用の23G針を取り付け、使用まで怪我を防ぐために対応するキャップで覆います。

4.薬物の適用

1. ラットをチャンバーに入れ、3 L / minで100%酸素中の3.5vol%セボフルランをフラッディングすることにより、薬物投与のための麻酔を誘導します。
2. 動物が視覚的に意識を失うまで約3〜5分待ちます。
3. チャンバーをゆっくりと傾けて動物を仰向けに転がして、正心反射テストを実行します。10秒以内に正そうとしない場合は、適切な麻酔深度を想定してください。
4. セボフルラン濃度を一時的に0に下げ、チャンバーを100%酸素で15秒間洗い流して、実験者の麻酔ガスへの曝露を最小限に抑えます。
5. 動物をチャンバーから取り出し、投与中に麻酔を維持するために、同じセボフルラン濃度を供給するガス供給チューブの前に置きます。麻酔からの回復を避けるのに十分な時間の試験物質の投与が短い場合は、このステップをスキップしてください。
6. 実験計画に従って物質を投与する:胃強制経口を介して10 mg / kgのTHCを投与するか、1 g / kgまたは2 g / kgのエタノールを腹腔内に投与します。準備の詳細についてはセクション3を参照し、強制経口投与手順と腹腔内投与手順の両方を実行するための施設のガイドラインに従ってください。
7. 動物をケージに戻して回復します。
8. 手順を続行する前に、エタノールの場合は 1 時間、THC の場合は 2 時間待ちます。

5. MAC検査のための麻酔導入

1. 待機期間の後、ラットを気密試験室に戻し、決定されたセボフルランと酸素の混合物を注ぎます。酸素流量を3L/minに一定に保ちます。各グループの最初の動物について、各動物の個々のセボフルラン濃度(ステップ9.1)を2.6vol%(または統計計画に基づいて別の所定の開始点)から始めて決定します。アップアンドダウンデザインの詳細な説明を以下に示します。
2. 赤外線加熱ランプをオンにします。
3. 動物が視覚的に意識を失うまで約3〜5分待ちます。
4. チャンバーをゆっくりと傾けて動物を仰向けに転がして、正心反射テストを実行します。10秒以内に正そうとしない場合は、適切な麻酔深度を想定してください。
5. セボフルラン濃度を一時的に0に下げ、チャンバーを100%酸素で15秒間洗い流して、実験者の麻酔ガスへの曝露を最小限に抑えます。
6. チャンバーをすばやく開き、直腸体温計を挿入します。処置中は深部体温を監視し、それに応じて赤外線加熱ランプと加熱ブランケットの強度を調整します。
7. チャンバーの小さな開口部から尾を外に導きます。
8. チャンバーをすばやく閉じます。
9. 続行する前に、すぐに目的のセボフルラン濃度を再確立してください。

6. 平衡化時間

1. 平衡化のために15分間の期間を待ちます。
2. 動物の深部体温(37.2°C±0.3°C)を継続的に監視し、それに応じて加熱装置を調整して正常体温を維持します。

7.痛みの刺激

1. 尾の遠位3分の1を特定します。
2. クランプを3番目の位置(約50Nの力)にロックして、痛みの刺激を加えます。
3. ラットが肯定的な動きの反応を示すまで、クランプを3番目の位置にロックしたままにしますが、最大1分間。
4. 運動反応の有無をプロトコルに記録します。観察された動きのパターンと範囲の観点から簡単に説明します。移動パターンの分類については、ポイント11を参照してください。

8. 回復

1. 気化器と加熱ランプをオフにし、ネズミをケージに戻します。

9. 上下デザイン

1. DixonのUp-and-Down-Designを使用して、次の実験のセボフルラン濃度を決定します。前の動物が刺激に対して運動反応を示した場合は、次の動物の濃度を0.2%pt増やします。逆に、前の動物が運動反応を示さなかった場合は、濃度を0.2%pt下げます。

10. 安楽死(該当する場合)

注:安楽死は本質的に実験の必要な部分ではありません。動物実験のための管轄の学内委員会に相談する必要があります。参照された2つの研究では、心臓内採血を行い、その後動物を安楽死させることが決定されました。動物はステップ8.1で説明されているようにケージに戻されず、代わりに手順がステップ9.1で直接続行されました。

1. 300mgのペントバルビタールを1mLの生理食塩水に溶解して安楽死溶液を調製します。溶液を注射器に引き込み、採血後すぐに使用できるようにしておきます。
2. ラットを箱から取り出し、一定の麻酔を維持するために、100%酸素で3.5vol%のセボフルランを供給する呼吸チューブの前に置きます。胸部に遮るものなくアクセスできるように、動物を仰向けに配置します。
3. 23 G 針と 5 mL 注射器を使用して心臓内採血を行います。指で心拍をそっと触診して心臓の位置を確認します。針を剣状突起のすぐ尾側、正中線の少し左に浅い角度で挿入します。
4. 血流が観察されるまで、針の位置を調整しながら穏やかに吸引します。必要なボリュームを収集します。
5. 採血が完了したら、注射器を針から慎重に取り外し、ペントバルビタール溶液が入ったプリロードされた注射器を取り付けます。施設の倫理ガイドラインに従って安楽死を確実にするために、溶液 1 mL 全体を心臓内に投与します。

11. 実験の継続

1. 各研究動物について、ステップ3から始まる実験を個別に繰り返します。

12. 移動パターンの分類(オプション)

1. 行動反応を次のカテゴリに分類します。
   1. ローリング: 行動反応が体の軸方向の回転 (通常は縦軸に沿って) を伴う場合、ローリングとして分類します。
   2. ストレッチ: 行動反応が手足と体の両側の対称的な外側への伸展によって特徴付けられる場合、ストレッチとして分類されます。
   3. 塩性運動: 行動反応が、全身の短く飛び跳ねるようなバーストに似た、突然の後肢に焦点を当てた蹴りやけいれんで構成されている場合、塩性運動として分類されます。
   4. カーリング: 行動反応にさまざまな強度の調整されていない内向きの動きが含まれ、体が中心に向かって曲がる場合、カーリングとして分類されます。

結果

THC研究では、MACのブートストラップ推定値は、対照群で2.8 vol%(95%CI:2.7-2.9 vol%)、10 mg / kg THC群で2.1 vol%(95%CI:1.8-2.4 vol%)でした¹³。

エタノール研究では、推定 MAC は対照群で 2.24 vol% でした (95% CI: 1.97-2.94 vol%)。1 g / kgエタノール群では、1.65 vol%(95%CI:1.40-1.98 vol%)であり、2 g / kgエタノール群では、1.08 vol%(95%CI:0.73-1.42 vol%)でした¹⁴。小数点以下の桁数が異なるのは、2つの研究の元の報告規則を反映しています。さまざまなグループの MAC 曲線を 図 1 に示します。

合計で、38 匹の動物が THC 研究に、48 匹がエタノール研究に含まれました。2つの研究のビデ...

ディスカッション

この研究は、重要な方法論的ステップを詳述し、一般的な課題に対処することで、ラットにおけるセボフルランの MAC を決定するためのプロトコルを改良し、麻酔深度を評価するためのより標準化された再現性のあるアプローチに貢献します。

正確な MAC 測定は、実験的麻酔と臨床麻酔の両方の実践に不可欠です。この研究は、動物モデルにおけるセボフルランの効力を評価するための明確で再現性のある方法を提供することにより、既存の文献に貢献します。洗練されたプロトコルは、麻酔の深さの正確な制御が重要な薬理学的および神経科学的研究にとって特に価値があります。MAC 測定へのアプローチを標準化すると、研究間の比較可能性が向上し、麻酔効果のより正確な評価をサポートできます。

一貫性と正確性のために特定された主なステップには、次のものが含まれます。(i) 一貫した麻酔薬の分布を確保するための 15 分間の平衡期間。(ii) 尾の遠位 3 分の 1 に外科用クランプを使用した疼痛刺激の標準化さ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
気密透明チャンバー	該当なし	該当なし	ジェネリック
動脈クランプ	KLSマーティン	13-410-22-07	25センチ
博士äゲル・プリムス	博士äger Austria GmbH (英語)	プライマス
博士äゲルヴェイパー2000	博士äger Austria GmbH (英語)	ヴェイパー 2000
恒温ブランケットコントロールユニット	ハーバード・アパレータス、米国マサチューセッツ州ホリストン	50-7137	230 V
手動式モバイル幼児用ウォーマー	Fisher/Paykle、オークランド、ニュージーランド	IW9210/920