方法論記事

インビトロ Phase Separated Giant Unilamellar Vesicles(GUV)内部の細胞骨格ネットワークの再構成

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DOI：

10.3791/68530

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2025年6月20日

 ,  , 
1Department of Cellular and Molecular Biophysics, Max Planck Institute of Biochemistry

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

この記事では、相分離された巨大小胞内の細胞骨格ネットワークの単純なワンポット再構成を紹介します。この方法は一般化でき、広範囲の生体分子のカプセル化または閉じ込めに適用できます。

要約

巨大なユニラメラ小胞(GUV)の形をした生体模倣脂質膜は、GUV内のタンパク質再構成、可視化、および細胞膜-タンパク質ダイナミクスの理解が容易であるため、細胞膜の挙動を模倣するために一般的に使用されています。しかし、細胞膜は、細胞膜中の異なる脂質の存在から生じる脂質ラフト(またはドメイン)を含む。モデルシステムにおけるこのような複雑さの増大は、脂質組成を微調整できる相分離型GUVに組み込むことができます。均質なGUVを作製するためのカプセル化法は広く知られていますが、相分離されたGUV内にタンパク質をカプセル化する方法は限られています。ここで、このプロトコルは、液体無秩序(Ld)ドメインと液体秩序ドメイン(Lo)で構成される相分離GUVの簡略化されたワンポット生産を示し、異なる細胞骨格タンパク質、すなわちFtsZおよびアクチンを効率的にカプセル化し、この方法を最小限の細胞生産のための汎用性の高いツールにします。具体的には、このアプローチでは、エマルジョン転写プロトコルを使用して、カプセル化効率の高いGUVを作製します。この方法では、まず脂質/油混合物中のタンパク質溶液を乳化することにより脂質単分子膜を生成し、相転移温度の異なる脂質を選択して、得られたGUVの相分離を実現します。このエマルジョンは、別のチューブ内の油中脂質溶液の上に穏やかに移され、水と油の界面が形成されます。その後、溶液を高温(タンパク質活性を保持するために理想的には37°C)で遠心分離し、その後、イメージングのためにGUVを回収します。この方法は、面倒な実験室のセットアップを使用せずに、相分離されたGUV内の細胞骨格タンパク質の in vitro 再構成を簡素化するため、閉じ込められた細胞骨格-膜相互作用のメカニズムを研究するための便利な方法として機能します。

概要

巨大小胞は、細胞の機能を理解するためのモデルシステムとして機能します1,2。これらの生体模倣モデルは、生体分子の製造、可視化、調整性、およびin vitro再構成の容易さから、多くの調査研究3,4,5で選ばれるシステムとなっています。GUVを作るには、電気形成6、cDICE 7,8、エマルジョントランスファー、その他のマイクロ流体ベースの方法9,10など、いくつかの既知の方法があります。このような方法によるGUV製造は、文献3,11で報告されています。さらに、インビトロでは、GUV内部の細胞骨格ネットワークの再構成は、複雑なセットアップを必要としないこのワンポット形成法の容易さのために、エマルジョン転写法を用いて以前に記載されている12。しかし、このような再構成は、細胞膜の複雑さを完全に模倣していないシステムである均質なGUVで非常に一般的に報告されています。

このプロトコルは、脂質膜の複雑さを示す、相分離されたGUV内の細胞骨格ネットワークのin vitro再構成を説明しています。このようなネットワークは、膜の表面(外側)に結合することが以前に報告されているが、巨大小胞13,14内には閉じ込められていないが、本エマルジョン転写技術は、相分離をもたらすだけでなく、細胞骨格のネットワーク形成の活性を保持するためのプロトコルに焦点を当てている。この手法の主な課題の1つは温度です。相分離型GUVを生成する標準的な製造方法では、構成脂質の相転移温度によって異なる高温を使用する必要があります。しかし、細胞骨格タンパク質は、そのような高温で高次構造に重合することができない15,16,17。したがって、このプロトコルでは、室温でGUVの相分離をもたらす脂質組成物を採用するだけでなく、生理学的温度で良好なGUVを生成するための条件も最適化します。

再構成されたGUVシステムを製造する際に考慮すべきもう一つの側面は、必要なカプセル化された生体分子の量です。ほとんどのタンパク質では、大量のタンパク質を生産するには、数回の精製ラウンドが必要で、費用と時間がかかることがあります。さらに、 in vitro 再構成実験では、一般に、生体分子の濃度、緩衝組成物などを最初に試験して、最適化された内部溶液含有量を達成する最初の探索段階が必要です。したがって、このプロトコルは、前述の前提に適応する2つの異なるアッセイに対してGUV製造プロトコルを最適化します。一方では、このプロトコルは、比較的大量のタンパク質を含み、チューブ内で高収率のGUV産生を生成し、後でイメージング96ウェルプレートに移される標準的な倒立エマルジョンプロトコルを最適化する1つのアッセイを示しています。一方、ここで説明するアプローチは、イメージングウェルプレートで直接相分離GUVを作製するためのプロトコールも最適化しており、これにより生体分子の量が少なく(チューブ内での作製に必要な量の~1/4)、GUVを連続して生成することができ、1回の遠心分離ステップで多くのカプセル化された条件を達成することができます。したがって、ここで紹介するプロトコルは 1 つのカプセル化方法を示していますが、ユーザーは要件に基づいていずれかのセットアップを選択できます。

さらに、このプロトコルでは、FtsZとアクチンという2つの異なる細胞骨格ネットワークのカプセル化に最適化された方法について説明しています。これら2つのタンパク質は異なるバッファーおよびクラウディング条件を必要とするため、このプロトコルは、最適なネットワーク再構成を達成するために必要なその後の変更に対処します。したがって、ここで紹介するアプローチは、必要な生体分子を相分離GUV内にカプセル化するために使用し、一般化することができます。

プロトコル

この研究で使用した試薬と機器は、 材料表に記載されています。

1.脂質混合物の調製

  1. 5 mLのガラスバイアルに0.5 mLのクロロホルムを入します。.17.5 μL DOPC、7.4 μL DOPG、29.6 μL DPPC(すべてクロロホルムで調製した25 g/L脂質ストックから)、32.2 μLの10 g/L DPPGおよび20.6 μLの18 g/Lコレステロールを加えます。1 g/L Atto655-DOPE 色素 1.2 μL を添加します。脂質混合物を穏やかにボルテックスし、窒素流下でクロロホルムを蒸発させ、薄膜を合計400μLのクロロホルムに再懸濁します。
  2. FtsZのカプセル化のために、調製された最終的な脂質混合物は、0.001 mol%のAtto655-DOPEで標識されたDOPC:DOPG:DPPC:DPPG:Chol(17.499:7.5:31.5:13.5:30 mol比)の比率です。カプセル化されたバンドルアクチンを用いたGUVの作製では、脂質混合物にビオチン化脂質が含まれており、0.001 mol% Atto655-DOPEで標識されたDOPC:DOPG:DPPC:DPPG:Chol:Biotinyl CAP PE(17.499:7.5:30.5:13.5:30:1)の比率で調製されます。
  3. 脂質混合物(32 mM、50 μL)をクロロホルムに溶解し、ガラスバイアル内でN2 ガス流下で~15分間乾燥させます。
  4. その後、ガラスバイアルをデシケーターに真空下で~30分間保存し、残留クロロホルムの痕跡を取り除きます。
  5. ガラスバイアル中のデカン(20μL)と鉱物油(500μL)の混合物に乾燥フィルムを分散させて最終濃度3.2mMにし、バスソニケーターを使用して高温(~50°C)で~30分間超音波処理します。
  6. 脂質中油混合物をチューブに移し、チューブを37°Cで~10分間インキュベートしてから、次のステップに進みます。
  7. タンパク質の内側カプセル化ミックスを準備します。

2. カプセル化のための内部溶液の調製

  1. FtsZフィラメント混合物
    1. FtsZタンパク質混合物をマイクロチューブ内に総容量10μLで調製します。FtsZフィララスネットワークの場合、0.87 μL の 23 μM FtsZ-YFP-mts、1.31 μL の 381 g/L Ficoll70、1.11 μL の 271 g/L BSA、1 μL の 25 mM GTP を 5.71 μL の FtsZ 反応バッファー (RB) に加えます。溶液の総容量は10 μLで、最終溶液中に2 μM FtsZ-YFP-mts、50 g/L Ficoll70、30 g/L BSA、および2.5 mM GTPが含まれています。GUV内でのカプセル化に使用する前に、氷の上に置いてください。
      注:FtsZ反応バッファー(RB)には、50 mM Tris-HCl、pH 7.5、150 mM GluK、5 mM GluMgが含まれています。
  2. アクチン-バンドル混合物
    1. アクチンバンドルをカプセル化するには、まず、86% G-アクチン、10% Atto488-アクチン、および4%ビオチン化アクチンを水に含む10 μLアクチンマスターミックス(A-Mix)を調製します。このステップでは、製造元の指示に従ってタンパク質ストック溶液を調製します。次に、最終濃度が35.42 μM A-Mixになるように、6.39 μ Lの2 g/L G-アクチン、1.48 μLの1 g/L Atto488-アクチン、1.19 μLの0.5 g/Lビオチン化アクチン、および0.9 μL H2Oを添加します。
    2. GUVの外部でのアクチンの予備重合と結合を防ぐために、カプセル化の数分前に最終的なアクチン溶液を調製してください。最終溶液は、アクチン重合バッファー中の 7% ヨウ素酸、0.01 g/L ニュートラアビジン、2.4 μM A-Mix、0.6 μM Fascin、10 g/L BSA、20 g/L Ficoll70、および 5 mM ATP で構成されています。
      1. この最終溶液を調製するには、常に氷上に保管する必要がありますが、次の順序で追加します:2.92 μL の 60% ヨウ素、10.25 μL H2O、2.5 μL の 0.1 g/L ニュートラアビジン、0.92 μL の 271 g/L BSA、1.31 μL の 381 g/L Ficoll70、2.5 μL の 10x アクチン重合バッファー、 1.69 μL の 35.42 μM A-Mix、1.65 μL の 9 μM Fascin、1.25 μL の 100 mM ATP。よく混ぜ合わせ、カプセル化に必要な5μLを素早く取ります。
        注:この内部溶液の浸透圧を浸透計(~430 mOsm/Kg)で測定します。同じ浸透圧を持つ適合する外部溶液混合物は、同じ浸透圧値に達するまでグルコースを水で希釈することによって調製する必要があります(ステップ3.2を参照)。10x Actin重合バッファーには、100 mM Tris-HCl、pH 7.5、500 mM KCl、および50 mM MgCl2が含まれています。

3. GUV製造と in vitro カプセル化

  1. チューブ内GUV製造:FtsZのカプセル化
    1. FtsZカプセル化には、1.5 mLのプラスチックチューブに500 μLのFtsZ反応バッファー(RB)を加え、200 μLの油中脂質混合物(上記のステップ1.6で調製)を穏やかに加えて、油-水界面を形成し、この界面に脂質単層を沈着させます。
    2. エマルジョンを形成するには、まず別の1.5 mLチューブを取り、200 μLの油中脂質を加えます。このチューブを37°Cで~10分間インキュベートしてから、エマルジョンを形成します。
    3. インキュベートしたら、このチューブに5 μLのFtsZタンパク質ミックス(2.1.1で調製)を加えます。水性媒体中の5 μLタンパク質は、液滴としてチューブの底に沈みます。
    4. 溶液が目に見えて濁るまで、チューブの底を5〜6回軽くたたいてエマルジョンを作ります。
    5. このエマルジョンを静かにピペットで動かし、油水界面(上記のステップ3.1.1で調製)の上に置きます。
    6. これを6000 x g で30分間、予熱温度37°Cで遠心分離し、小胞製造が終了するまでこの温度を維持します。
    7. イメージングする前に、サンプルを室温まで約30分間冷却します。
    8. チューブの上部から静かにピペッティングしてオイルの最上層を取り除き、イメージング用に約100〜200μLの溶液を残します。
    9. ピペットの先端をハサミで斜めに切り、チューブの底から50〜100μLのGUV溶液を優しく拾い上げます。このソリューションはイメージングに使用されます。
  2. 96ウェルプレートでの直接のGUV生産:アクチンのカプセル化
    1. アクチンのカプセル化には、まず、内側のアクチンミックスと同じ浸透圧を持つ外部溶液ミックス(水中のグルコース)を調製します。インナーミックスの~430 mOsm/Kgに合わせるには、198 μLの2 Mグルコースを802 μL H2Oに添加して、アウターソリューションミックスを作成します。
    2. ウェルプレート上で直接小胞を作製するには、まず96ウェルプレートの1ウェルを不動態化します。100 μLの10 g/L BSAをウェルに加え、10〜15分間インキュベートします。次に、ピペットチップで不動態化したガラス底部に触れないように注意しながら、ウェルを100μLの外部溶液で5回洗浄します。洗浄完了後、100μLの外溶体混合物をウェルに残します。
    3. 50 μLの脂質中油混合物をウェルに穏やかに加え、外側の溶液の上に脂質単層を調製します。水相の上にオイルが正しく沈着するように、ピペットの先端をウェルの片側に置き、オイルをウェルの壁から滑り込ませます。
    4. エマルジョンを形成するには、まず1.5mLのチューブを取り、100μLの油中脂質を加えます。このチューブを37°Cで~10分間インキュベートしてから、エマルジョンを形成します。
    5. 100 μLの脂質中油性混合物(上記のステップ1.6)を含むチューブに、最終アクチン溶液(ステップ2.2.2)2.5 μLを加えます。水性媒体中の2.5 μLタンパク質は、液滴としてチューブの底に沈みます。
    6. 溶液が目に見えて濁るまで、チューブの底を10〜20回軽くたたいてエマルジョンを作ります。
    7. このエマルジョンを静かにピペットで動かし、油水界面(上記のステップ3.2.3で調製)の上に置きます。ピペットの先端をオイル単層の中央に慎重に沈め、エマルジョンを沈着させます。エマルジョンは、油単層相に閉じ込められた濁った雲を形成します。
    8. 96ウェルプレートを200 x g で20分間、予熱温度37°Cで遠心分離し、小胞製造が終了するまでこの温度を維持します。
      注:小胞の生成時間を短縮するために、400 x g で10分間遠心分離します。ただし、最良の結果を得るには、これらの遠心分離パラメータに固執してください。400 x g を超える遠心分離では、イメージングプレートの底部に脂質凝集体が蓄積する固まった小胞が得られます。
    9. イメージングする前に、サンプルを室温まで約30分間冷却します。
      注:直接イメージングは、オイルの最上層を除去したり、小胞を別のチャンバー/ウェルに移したりすることなく、ウェル上で実行できます。

4. イメージングと3D画像再構成

  1. 96 イメージングウェルプレートを取り出し、BSA で ~10 分間不動態化してから、サンプルをイメージングウェルプレートに移します(ステップ 3.2.2 を参照)。
  2. GUV溶液を不動態化したウェルプレートに移します。
  3. ウェルプレートを倒立共焦点顕微鏡のステージに設置し、40倍水対物レンズに設置します。
  4. 任意の関心領域 (ROI) に注目し、選択した ROI から固定の z ステップ間隔で z スタック画像シーケンスを取得します。このプロトコルでは、5〜30μmサイズのGUVが得られるため、必要に応じて間隔を0.5〜1μmに固定できます。
  5. 各 z-stack イメージ シーケンスを .tiff 形式で保存します。
  6. 画像処理ソフトウェア(ImageJ/Fiji)で目的の画像シーケンスを開きます。最も強度の高い画像を特定します。 ctrl+shift+c を押しながら Brightness & Contrast ウィンドウを開き、 Auto をクリックします。
  7. ImageJ/Fijiメニューから 、分析>スケールの設定 に移動し、各画像ピクセルの既知の物理的距離とその単位を入力します。
  8. ImageJ/Fiji メニューから Image > Stacks > Z project に移動し、Z スタックから 3D 画像を再構築します。 [投影タイプ ] を [標準偏差] に設定します。デフォルトのオプションは、残りの設定([開始スライス]および[停止スライス])に使用できます。
    注: 3D 再構成で Z スタックが重なることによる標準偏差投影アーティファクトに注意してください。アーティファクトが発生しないようにするには、球の下半球の Z スタックを削除して、上半分の投影のみを観察します。

5. サイズに基づくGUV周波数の統計解析

  1. ステップ 4.4 と 4.5 で説明したように、対象の GUV の Z スタック画像を取得します。広い視野でできるだけ多くのGUVを画像化するには、1倍または2倍のズームで共焦点スタックを取得します。
  2. 4.6で説明されているように、画像処理ソフトウェア(この場合はImageJ / Fiji)でZスタックシーケンスを開きます。
  3. 膜蛍光シグナルが取得された表示チャンネルを選択するには、画像の下にある c とラベル付けされたバーをクリックします。4.6で説明されているように、画像の明るさとコントラストを調整します。
  4. 開いている画像の下にある Z バーをクリックして、取得したさまざまな平面をナビゲートします。解析する小胞の直径が最大になる平面を選択します。
  5. ImageJ/FijiでROIマネージャーを開くには 、>ツールの分析>ROIマネージャーをクリックします。
  6. ImageJ/Fijiのメインパネルにあるツールから、 楕円形の選択範囲をクリックします。
  7. GUV膜の蛍光強度を追って、GUVにフィットする円を描きます。円の選択を描画するには、Shift キーを押しながらマウスをドラッグして、円を小胞のサイズまで拡大します。円の選択は、小胞の中心にあるマウスの左ボタンを同時にクリックし、マウスを目的の位置にドラッグすることで移動できます。
  8. ROIマネージャーに描画された円の選択を保存するには、ROIマネージャーのオプションパネルにある [追加[t]をクリックします。
  9. 小胞のサイズをミクロン単位で取得するには、ROI Managerのパネルにある Measure をクリックします。新しいウィンドウがポップアップします。メジャー列またはマイナー列に表示される値(両方の列は楕円軸を参照するため、同じ値である必要があります)を小胞の直径の測定値として取ります。
  10. プロットソフトウェア(Excel、Origin、Prism)を使用して、さまざまなサイズ範囲のGUVの割合が指定されている棒グラフを作成します。

結果

最初のステップとして、膜相分離を有するGUVを、修正逆エマルジョンアプローチに従って作製しました(図1A)。これにより、GUVの収率が高くなり、LdドメインとLOドメインに分離された膜を示すLDドメインと、ラベル化されていないLOドメインに対応する暗領域にAtto 655-DOPEラベルが表されます(図1B)。この方法では、高温で5〜30μm(図1C)の範囲のサイズの位相分離GUVが得られます(すべてのステップを37°Cで実行し、RTでイメージング)。さらに、遠心分離速度は、GUV内に元の成分脂質が取り込まれるように調整され、過剰な過剰増殖を回避しました。

さらに、現在のプロトコルに記載されているエマルジョン法を使用して生体分子のカプセル化が成功することを実証するために、FtsZネットワークとアクチンネットワークの両方を個々の実験で再構成しました。FtsZネットワークはGUVの内部で再現され、2.5 mM GTPおよび50 g/L Ficoll70の存在下で、膜標的配列(MTS)を介してLdドメインに優先的に結合するフィラメントとして出現します(図2を参照)。ネットワークは、カプセル化ステップの約1時間後に観察されました。しかし、アクトミオシンネットワークは、GUV内で再構成した後、(FtsZの厚いネットワークとは対照的に)薄い束として現れます(図3)。ビオチン化脂質は、アクトミオシンネットワークがGUVの膜に結合する上で重要な役割を果たすことに注意する必要があります。ビオチン化脂質がないと、アクトミオシンの束は湾曲した形状をとることができず、長い束の絡み合った網目として膜に付着するのではなく、内腔でまっすぐで短く硬い束として残ります(図4)。

改変エマルジョンプロトコルでは、前述のように、遠心分離速度を調整して相分離GUVを取得します。実際、アクトミオシンネットワークを含むサンプル(600 x g で15分間)の遠心分離速度が速いと、ベシクルが生産ウェル内で組織様に凝集します。したがって、アクトミオシンネットワークのすべての標準的な再構成実験では、最適な遠心分離速度を200 x g に設定して、非凝集GUVを取得しました(図5)。

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図1:ダブルエマルジョントランスファー法による相分離GUVのワンポット作製 (A)ダブルエマルジョントランスファー による ワンポット相分離ベシクル製造のキーステップの実験スキーム。(B)A.で述べた方法により生成されたGUVの共焦点Z投影像。スケールバーは50μm、(C)直径に応じて生成された位相分離GUVの割合を示す棒グラフ。実行された実験はn = 3で、実験ごとに分析されたGUVの総数= 100です。データは平均値として示され、個々のデータポイントは3つの独立した実験です。エラーバーは、3つの実験の標準偏差を表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:カプセル化されたFtsZネットワークを持つ位相分離小胞 (A)FtsZネットワークを含む位相分離GUVの完全取得zスタック上で行われた共焦点3D投影画像。(B)小胞の上半分のみで行われた共焦点Z投影画像。GUVの表面上にドメインが不均一に形成されるため、取得した共焦点スライスの3D再構成では、小胞の上部領域と下部領域からの脂質ドメインの重なりが示されています。重複を防ぎ、ドメインの目視検査を容易にするために、取得した Z スタックの下半分がファイルから削除されます。結果として得られる上半分は、標準偏差 による 3D投影に使用されます。スケールバーは両方とも20μmです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:カプセル化されたアクトミオシンネットワークを持つ位相分離小胞(A)ベシクル生成後のウェルのズームアウトビューを含む、取得したスタック全体の共焦点Z投影画像。得られた小胞の高収率により、小胞内のさまざまなアクトミオシン構造の研究が可能になります。スケールバーは50μmです。 (B)小胞の上半分で行われる共焦点Z投影画像。脂質ドメインの視覚的解析を容易にするために、画像スライスの上半分のみを使用して3D投影を行います。スケールバーは10μmです。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:相分離小胞内の膜結合型アクトミオシンネットワークの生成におけるビオチン化脂質の重要性。 結合していないアクトミオシンネットワークを持つ位相分離小胞を描いた共焦点3Dプロジェクション。ビオチン化脂質が混合物に組み込まれていない場合、アクトミオシン構造は内腔で形成され、小胞の内側のリーフレットに湾曲した形状を獲得しません(右パネル、Atto488で標識されたアクチン)。スケールバーは50μmです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図5:エマルジョントランスファーによる相分離小胞の生成に対する遠心分離速度の影響。600 x gの遠心力で15分間生成したGUVサンプルを示す共焦点2D画像。最適化された200 x gよりも高い遠心分離速度により、小胞がウェル内の組織様に凝集します。スケールバーは100μmです。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

膜ベースのモデルシステムの in vitro 再構成における主要な課題の1つは、高温で調製されたタンパク質のために、相分離されたGUV内にタンパク質をカプセル化することです。実際、ワンポット合成 による この種の相分離小胞の生成は、高温でのタンパク質の分解から生じる困難につながる可能性があります。したがって、このプロトコルでは、カプセル化されたタンパク質の活性を維持しながら、生理学的温度でのGUV製造のためのダブルエマルジョン法に続く膜相分離を観察するための最適化された条件について説明します。このアプローチは、静電相互作用が前提条件である場合に、目的のタンパク質の結合を促進するために、両方のドメインに負の電荷を導入します。FtsZのカプセル化の場合、両方のドメインに負電荷が存在するにもかかわらず、細胞骨格ネットワークはLd ドメインに優先的に発達して結合し、負電荷とともに、膜の流動性がタンパク質結合の必須要件であることを示しています18。さらに、アクチンカプセル化の場合、ネットワークはビオチン化脂質が取り込まれる膜領域上に発達する19。

エマルジョン転写アッセイは文献で広く使用されていますが、均質なGUVの製造にのみ適用されています。したがって、このプロトコルは、アッセイのいくつかの変更された側面で構成されており、これにより膜内のドメイン形成を観察することができます。この点での主要な側面の1つは温度です。ドメインを観察するため、およびタンパク質の機能(特に細胞骨格ネットワーク形成)を維持するために、このプロトコルでは37°Cを使用してGUVを産生します。一方では、GUVがより高い温度で生成されると、カプセル化されたタンパク質は機能を失い、内腔に存在し、高次構造に重合しません。一方、GUVを低温で作製すると、膜内での相分離は観察されません。したがって、実験では37°CがGUV製造に最適な温度になります。

このプロトコルは、同じエマルジョン転写原理に従ってGUVを生成するための2つの可能なアッセイシステムを提供することに注意することが重要です:チューブ内およびウェルプレート内。どちらにも長所と短所があり、ユーザーは実験計画フェーズでこれらを考慮して、どのシステムが自分のニーズに最も適しているかを判断する必要があります。実際、プラスチックチューブはウェルプレート用のローターを装備した遠心分離機を必要とせず、取り扱いが容易で、製造後およびイメージング前に小胞の希釈係数を制御することができます。しかし、GUV抽出のためには、より多くの量(油相と水相の両方)と製造後の油層の除去が必要であり、このステップを慎重に行わないと、イメージングウェルに油の残留物が残る可能性があります。あるいは、ウェルプレートはサンプル量が少なくて済み、異なる内部条件を直列に一度にカプセル化でき、同じ生産ウェルで製造後すぐに小胞をイメージングできるため、GUV抽出が不要です。ウェルプレートの主な欠点は、小胞の凝集と、チューブで観察されるのと同様の小胞生成収率を達成するために遠心分離パラメータを調整する必要があることです。

このアプローチは、採用されているカプセル化システム(チューブまたはウェルプレート)とは無関係に、GUVを製造し、カプセル化されたタンパク質の重合を促進するために、最適なクラウディング条件が必要であることを示しています。特に、このプロトコルに従って、カプセル化されたFtsZを持つGUVの最良の条件は、30 g/L BSAおよび50 g/L Ficoll7018で観察されました。一方、アクチンについては、10 g/L BSA、7% ヨディキサノール、および 20 g/L Ficoll70 の混合物が必要でした19。

GUV製造のもう一つの重要な側面は、遠心分離の速度と時間です。上記の混雑濃度下でのFtsZネットワークの形成では、6000 x g で30分間遠心分離すると、イメージングウェルプレート上に十分に分布し分離されたGUVの集団が得られます。一方、アクチンの場合は、200 x g を20分間使用することで、高いGUV製造収率を得ることができます。遠心分離の速度や時間が遅くなると、GUVの収率に影響が及びますが、上記の値を超えて増やすと、GUVが凝集します。上記の条件下で、このプロトコルは、カプセル化効率が最大のGUVを生成するだけでなく、個々のGUVが互いにくっつかないGUVを生成します。

このプロトコールは、任意の脂質およびカプセル化された生体分子に一般化することができますが、所望の膜組成および小胞の内容物が遠心分離パラメータを決定し、それにより相分離小胞の生成が可能になります。したがって、このプロトコールは、膜ドメインを持つ多様な小胞の産生を可能にするためのガイドラインとして機能します。

このような相分離型GUV内での in vitro 再構成の方法論は、細胞膜の複雑さを考慮しながら、脂質ドメインを介して媒介される複雑なタンパク質-膜ダイナミクスを理解するために重要である14。これらの脂質ドメインはサイズが小さく、非常に動的であるため、 in vivoでの界面相互作用の特性評価は困難です。したがって、GUVは、調製が比較的容易で物理化学的調節が容易であること、および光学顕微鏡による分析に適しているため、重要なツールとして機能します20。

さらに、不均一な生体インターフェース内に機能分子をカプセル化することは、ナノメディシンの分野で有望なアプリケーションを提供します。特に、生体分子の不斉分布と表面上の限られた領域への分配から生じる異なる特性を持つ機能化された薬物送達システムの開発21。薬物と脂質の相互作用は、薬物の輸送、分布、蓄積などの薬物動態学的特性に重要な役割を果たしており、これらは最終的に使用される薬物の有効性に影響を与える22。したがって、これらの相互作用が薬物の薬物動態特性に及ぼす役割を理解することは、効果的な医薬品を開発する上で非常に重要です。モデル脂質膜は、ペプチド、ポリマー、およびナノキャリアとの相互作用のメカニズムを理解するために探索することができる23。したがって、特定の疾患状態における細胞および組織の脂質組成の変化は、生物物理学的相互作用を変化させる可能性があり、これは標的特異的な薬物および薬物送達システムを開発するために探求することができる24。

結論として、ここで説明するプロトコルは、内部の脂質リーフレットに固定されたカプセル化されたタンパク質で相分離されたGUVを生成するための容易な戦略を提供します。これらの小胞系の生成は、バイオテクノロジーや合成生物学などの分野で有望な用途に利用されており、細胞様機能を模倣する複雑な機能を持つ多成分アセンブリが革新的な解決策と新しいアプリケーションをもたらす可能性があります。

開示事項

著者は、競合する利益を宣言しません。

謝辞

著者らは、タンパク質精製の支援を提供してくれたMPIB Core Facility、プラスミドクローニングを提供してくれたMichaela Schaper氏、タンパク質精製を提供してくれたKerstin Röhrl氏、脂質調製を提供してくれたSandra Ortmeier氏に感謝します。また、著者らは、クラウダー条件とタンパク質のカプセル化について有益な議論をしてくださったAdrián Merino-Salomón氏とShunshi Kohyama氏に感謝します。MR-L.は、連邦教育研究省(BMBF)とバイエルン自由州が支援するIMPRS-MLおよびONE MUNICH Projectの一部であり、連邦政府とレンダーのエクセレンス戦略の下にあります。また、ミュンヘンのCenter for Nanoscience(CeNS)の支援にも感謝の意を表したいと思います。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-(1'-rac-グリセロール)(ナトリウム塩)(DOPG)バンティ極性脂質840475ロホルム
1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)バンティ極性脂質850375ロホルム
1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(キャップビオチン)(ナトリウム塩)(18:1ビオチニルキャップPE)バンティ極性脂質870273クロロホルム
1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-(1'-rac-グリセロール)(ナトリウム塩) (DPPG)バンティ極性脂質840455ロホルム
1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン (DPPC)ロホバンティ極性脂質
アク
チン (α-アクチン骨格筋、ウサギ)HYPERMOL8101-01
Atto488-アクチン(α-アクチン骨格筋、ウサギ)HYPERMOL8153-01
Atto655-DOPEATTO-TECAD 655-16粉末
浴超音波処理器Branson 1510R-MTHブランソニック超音波洗浄機
オチンアクチン (α-アクチン骨格筋、ウサギ)HYPERMOL8109-01
BSAシグマ アルドリッチA6003
遠心分離機エッペンドルフ5424R
遠心分離機エッペンドルフ5804 R
クロロホルムシグマ アルドリッチ67-66-3
コレステロール (ヒツジ)Avanti 極性脂質700000クロロホルムデ
カンTCI Deutschland GmbHD0011
ファシン (ヒト、組換え)Cytoskeleton Inc (Tebubio GmbH)CS-FSC01-A
Ficoll70Sigma AldrichF2878
ヨオジキサノール (OptiPrep)Sigma AldrichD1556
LSM800 共焦点レーザー走査型顕微鏡Carl ZeissC-Apochromat 40 &時間; /1.2 水浸対物レンズ。ダイオード励起固体レーザー:488 nmおよび640 海里。
鉱物油Sigma Aldrich8042-47-5
ミオシン II (ウサギ骨格筋)Cytoskeleton Inc (Tebubio GmbH)MY02-A
NeutravidinThermo Fisher Scientific Inc.31000
浸透圧計Fiske AssociatesFiske Micro-Osmometer model 120
Greiner Bio-One GmbH07-000-109
アクロクロロホルム中のアクロアア クロクロルム 96 ウェル平底マイクロプレート (SensoPlate) 中のア850355ビ

参考文献

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