インビボ 共焦点顕微鏡法:眼瞼縁の デモデックス ダニを検出するための標準的な操作手順

サマリー

In vivo共焦点顕微鏡は、高解像度の有望なイメージング技術です。臨床医がin vivoで眼瞼の縁でDemodexを検出するための次の手順を紹介します。

要約

デモデックスダニの蔓延はまぶたの縁の炎症を引き起こす可能性があり、デモデックス眼瞼炎は臨床例で一連の眼の状態を引き起こす可能性があります。多くの医師が、まつげの脱毛とin vitroの光学顕微鏡下でのまつげの観察を通じて、Demodexダニの眼の侵入を診断しています。.ただし、まつげ除去後の残留ダニの存在と手順に伴う痛みは、標準的な臨床ケアの限界です。

In vivo 共焦点顕微鏡(IVCM)は、臨床医が脱毛せずにまぶたの縁にある Demodex ダニを詳細に観察できるようにする非侵襲的なイメージング技術です。この技術により、<30分で完了できる痛みのない分析が可能になります。この検査への注目が高まっているにもかかわらず、豊富な経験がない多くの眼科医にはアクセスできない可能性があります。この論文では、臨床研究におけるこの方法の採用を促進するために、IVCM を使用してまぶたの縁にある Demodex ダニを視覚化するための標準的な操作手順を示します。

概要

眼瞼炎は、臨床診療で最も一般的に遭遇する眼科診断の1つです。証拠は、デモデックスダニの存在と眼瞼炎¹との間に有意な関連があることを示唆しています。ダニの蔓延には、デモデックス²によって引き起こされる直接的な損傷と、その分泌物によって引き起こされる免疫反応の両方が関与しており、細菌のベクターとして機能し、眼瞼炎³の発症に寄与する可能性があります。デモデックス眼瞼炎(DB)は、角膜や眼表面^の損傷1など、さまざまな不満足なイベントを引き起こし、患者の生活の質^4,5に悪影響を及ぼします。

デモデックスは、毛包や皮脂腺、およびそれらの近くの領域に生息する寄生ダニです⁶。まつげ毛包内またはまつげ周囲でデモデックスを検出すると、DB⁷の診断に役立ちます。DBの臨床診断には、まつげの脱毛と光学顕微鏡下でのDemodexの観察が含まれます。しかし、卵胞の奥深くに生息する多くのダニが、まつげの除去^8,9,10後に開口部に留まる可能性があり、ダニの数を過小評価する可能性があることが認識されています。眼科における非侵襲的イメージングツールである In vivo 共焦点顕微鏡法 (IVCM) は、in vivo¹¹ でまつげ毛包内またはまつげ周囲の Demodex を視覚化するための代替アプローチを提供します。この手法は、組織学のような解像度¹¹で眼表面とまぶたの微細構造に関する洞察を提供します。ダニは、その特徴的な形態と運動性に基づいて視覚的に識別できます。ただし、IVCM は、この画像診断法¹² の広範な経験が不足している眼科医にとって技術的な課題を提示する可能性があります。

健康なまぶたやDBの鑑別診断やフォローアップなど、日常的な臨床アプリケーションでのIVCMの採用を促進するために、まぶたの縁でDemodex ダニを観察するための標準操作手順(SOP)を提案します。このプロトコルは、臨床医に in vivoでのダニ検出のための体系的なアプローチを提供します。

プロトコル

このプロトコルは、IVCMによる眼瞼縁での Demodex の観察に使用されるSOPに焦点を当てています(図1)。この研究は、温州医科大学眼科病院の治験審査委員会 (IRB) によって承認され (IRB 承認番号 H2023-022-K-20)、このレトロスペクティブ分析に対する個々の同意の要件は、レトロスペクティブな性質のために免除されました。ここで説明する手順は、以前に報告された^{説明11、13、14、15、16}を参照しています。

図 1: 断層撮影装置。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

1.デバイスとプログラムを準備します

1. コンピュータの電源を入れます。
   1. デスクトップが表示されたら、デバイスの背面にあるロッカースイッチをOからIに切り替えます。検査を開始する前に、デバイスの電源がオンになっていることを示すロッカースイッチの緑色の光を探します。
      メモ: コンピュータを起動する前にデバイスの電源を入れると、接続に失敗する場合があります。
   2. 検査前にソフトウェアを起動し、プログラムの設定を行ってください。 [セットアップ ]メニューで、[ オプション ](補足ファイル1:補足図S1)を選択します。次に、[ 画像番号を表示 ] ボックスをオンにして、各画像の画像番号を表示します。さらに、[ 終了時に情報を表示する ] ボックスをオンにして、ソフトウェアが意図せずにシャットダウンするのを防ぎます。
      注:画像のサムネイルを大きなアイコンで表示すると、結果を直接観察しやすくなります。設定を頻繁に変更しないでください。
2. 試験前の準備
   1. レンズクリーニングワイプでレンズを清掃します。ヘッドレストとあご当てをアルコールに浸したコットンボールで消毒し、汚れたデバイス部品から伝染する病原性細菌による感染を防ぎます。
   2. あご当てを調整します。あご当ての水平位置が正しいことを確認してください:2つの黒いレバーを一緒に押して、あご当てが引っかかるまで前方に引きます。
   3. カメラを後方に動かします。検査前に調整ネジを回して、患者から離れることを確認してください。
   4. デバイスの顕微鏡レンズの前面に、カルボマーベースの眼科用ゲルをコンタクトジェルとして一滴(約0.02 mL)塗布します。.
      注意: コンタクトジェルに気泡がなく、少量しか使用されていないことを確認してください。デバイスの顕微鏡レンズの前面に塗布された接触ゲルが多すぎると、対物レンズに流れ込み、機械部品に付着し、デバイスが損傷する可能性があります。
   5. 滅菌済みの使い捨てポリメチルメタクリレート(PMMA)キャップを保護カバーから取り外し、キャップの前面に触れないように、キャップの側面をデバイスの顕微鏡レンズにしっかりと押し付けます(図2)。
      注意: PMMAキャップを正しく装着するには、接触ゲルが気泡なしでキャップの後面に接触していることを確認してください。キャップは専用容器に収納し、滅菌パッケージの損傷を防ぎます。検査中に感染のリスクを伴い、パッケージが損傷したキャップは使用しないでください。
   6. キャップとまぶたの間のゲルブリッジとして、キャップの前面にゲル涙液代替品を1滴塗布します(図2)。
      注:ゲル間の混同を避けるために、ゲル涙液代替品と顕微鏡レンズとキャップの間の薬剤として使用されるゲルと、両方のアプリケーションに同じカルボマーベースの眼科用ゲルを使用します。
   7. 新しい患者ファイルを作成するか、既存の患者ファイルを選択します。

図2:PMMAキャップとジェルアプリケーションの正しいフィッティング。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

2.患者を準備します

注:角膜の完全性が疑わしい場合は、この検査を行わないでください。

1. 患者の協力を得て潜在的なリスクを最小限に抑えるために、患者に次のことを説明してください。
   1. デバイスを使用した検査は、まぶたに触れても安全であることを患者に保証します。まぶたの縁に局所麻酔薬を一滴垂らすことで目が麻酔されることを患者に伝えます。
   2. 検査を開始するときは、患者にあごをあご当てに置き、検査手順全体で額を額に当てるように依頼すると、最高の画質が得られます。
   3. PMMAキャップが触れるまで、デバイスをまぶたに近づけることを患者に伝えます。デバイスがまぶたに触れている間は痛みを感じませんが、PMMAキャップの接触を感じることはあると彼らに保証してください。検査中に痛みを感じた場合は、すぐに臨床医に知らせるように依頼してください。
   4. 臨床医が Demodexの観察のためにまぶたの縁の画像を取得している間、患者に視線を安定させる必要があることを伝えます。.患者に、倦怠感を感じるかどうかを臨床医に知らせるように依頼します。彼らは、検査が続行される前に、しばらく座って休むことが許されます。試験が終了すると、彼らに通知されます。
2. 薬物禁忌を避けるために、局所麻酔薬および/またはアイジェルのパッケージの指示に従ってください。.患者のアレルギーが局所麻酔薬および/またはアイジェルの禁 ?? ではないことを確認するために、アレルギーがあるかどうかを患者に尋ねます。.
   注:局所麻酔薬および/またはアイジェルに対するアレルギー反応は、未確認のアレルギーの結果として発生する可能性があります。.
3. 局所麻酔薬である塩酸プロパラカインを、検査するまぶたの縁に一滴塗布します。.
   注:アレルギー反応が発生した場合は、すぐに生理食塩水ですすいでください。

3. 検査を行う

1. まず右目を観察します。スキャンカメラをオペレーターの視点から左に移動します。 OD は、カメラの左右認識により、 設定 セクションで自動的に選択されます。
2. CCDカメラを左に動かします。CCDカメラの対物レンズを回して、スキャナーレーザーカメラの光軸に対してCCDカメラの画像(制御画像)を垂直に調整します。
3. 新しい検査を開始します。
   1. [Examination Data] ダイアログボックスの [Examination Data] タブで、[Device] ドロップダウンリスト (Supplemental File 1: Supplemental Figure S2) から [Heidelberg Retina Tomograph-Cornea] を選択し、表示される [Cornea Module Settings] ダイアログボックスを確認します。
   2. [Field Lens] ドロップダウンリストから [FOV 400] を選択し、[OK] をクリックして確定します (補足ファイル 1: 補足図 S3)。
   3. 取得ウィンドウが開くまで待ちます。スキャニングレーザーカメラのライブ画像と制御画像が表示されます。制御画像が表示されない場合は、CCDカメラケーブルがCCDカメラに正しく接続されていることを確認してから、取得ウィンドウを再開してください。
4. 取得ウィンドウで係数を設定します(補足ファイル1:補足図S4):CCDズーム係数ドロップダウンリストから1倍を選択して、制御画像サイズを設定します。「自動輝度」ボックスと「自動」ボックスにチェックを入れると、ライブ画像の輝度と制御画像の輝度が自動的に制御されます。ただし、自動輝度制御が無効になっている場合は、スライダーを使用してコントロールとライブ画像の明るさを制御します。スキャンタイプがセクションが選択されていることを確認して、フットスイッチを押すたびに1つの画像が取得および保存されるようにします。
5. 参照画像を取得します。
   1. 取り込みを開始する前に、自動輝度制御をオフにし、スライダーを左に動かして画像の明るさを調整します。調整ピンで焦点面を調整して、暗くなった後のスキャンレーザーカメラのライブ画像に最初の明るい反射が表示され、PMMAキャップの前面を示すようにします。
      注:顕微鏡では10μmの焦点調整が可能です。
   2. [フォーカス位置[μm]セクションで[リセット]をクリックし、[フォーカス位置[μm]の値が0に変わるのを待ちます。現在のイメージは参照イメージとして示されます。自動リセットをオフにし、[自動明るさ]ボックスをオンにします。ライブ画像の明るさは自動的に制御されます。
   3. [フォーカス位置[μm]セクションの値の代わりに破線が表示される場合、または焦点面を調整しても表示される値が表示されない場合は、顕微鏡レンズケーブルが正しく接続されているか確認してください。
      注:パキメトリーの フォーカスポジション[μm] は、現在表示されている画像の焦点面位置をミクロン単位で表示します。その後、焦点面を移動すると、参照画像の位置を基準にして実際の焦点面の位置が計算されます。
6. 患者のために診察台の高さを上げたり下げたりします。患者のあごをあご当てに置き、額を額当てに当てます(図3A、B)。デバイスの指定された黒い調整ネジを使用してあご当ての高さを調整し、患者の上まぶたがヘッドレストコラムの赤いマークと一致するようにします。
7. ポインターの固定光源の前方を見下ろし、視線を安定させるように患者に指示します(図3A、B)。
   注意: 画像収集中に目を動かすと、画質が悪くなったり、眼球表面が損傷したりする可能性があります。
8. 綿棒を使用して上まぶたを裏返し、まつげの根元と眼瞼の縁を完全に露出させます。レーザービームの反射を患者の上まぶたのレベルに配置するには、デバイスの調整ネジを回します。スキャニングレーザーカメラを患者の上まぶたの縁に向かってゆっくりと動かし、PMMAキャップの中央に垂直にそっと触れます(図3C)。患者が不快感を訴えた場合は、一時停止してPMMAキャップの位置合わせを確認します。
   注:患者のまぶたに過度の圧力をかけないでください。ゲルブリッジが不十分であること、患者の目と頭の動き、および/またはオペレーターのカメラの動きが強すぎることによるPMMAキャップと患者のまぶたとの接触は、眼表面とまぶたを損傷する可能性があります。
9. まつげの根元を側頭側から鼻側に向かって眼瞼縁の微妙な水平方向に動かしながら慎重にスキャンし、まつげとその毛包の評価を可能にします。デバイスの顕微鏡レンズを時計回りまたは反時計回りに回して画像をスキャンして取得し、焦点面を徐々に変更して毛包全体とまつげの根元を観察し、スキャンレーザーカメラのライブ画像に表示されるさまざまな深さをメモします。片目あたり6〜10個のまつげ毛包をスキャンし、まぶたの縁の側頭領域、中央領域、鼻領域にサンプリングを分散させて画像を取得します。
   注意: 走査型レーザーカメラのライブ画像に小さな反射が表示され、焦点面の位置を変更しても続く場合は、コンタクトゲルに気泡が存在することを示している可能性があります。この問題を解決するには、コンタクトジェルを交換します。
10. 画像を手動で保存し、フットペダルを押して Demodex ダニの疑わしい画像をすべて記録します。ペダルのオーディオフィードバックを有効にして、画像取得が成功したことを確認します。まぶたの構造が表示されず、スキャン レーザー カメラのライブ画像に反射率の高い境界層のみが見える場合は、PMMA キャップと患者のまぶたの縁との接触が中断されていることを示している可能性があります。この問題を解決するには、PMMAキャップが患者のまぶたの縁に正しく触れるまでカメラの位置を合わせ直します。
11. ライブ画像がぼやけたり、歪んだり、毛包の構造が表示されなくなったりする場合、これらの問題は、患者が頭を動かしているかまばたきをしていることを示している可能性があります。動きを最小限に抑えるために、固定ライトに集中するように患者に思い出させます。可能であれば、明るさ、焦点面、スキャン位置を調整して、画質を向上させます。
12. スキャニングレーザーカメラの調整が必要な場合、または患者が疲労や痛みを感じた場合は、患者に座ってスキャニングレーザーカメラを後方に動かし、カメラを再調整するように依頼してください。患者が検査中に不快感を感じ続け、安静後も症状の緩和の兆候が見られない場合は、患者の安全を確保するために手順を中止してスケジュールを変更してください。.
13. 患者が一日を通して複数回診察される場合は、画像表示ウィンドウの同じ検査タブにすべての画像を保存します。
14. 左目で確認し、オペレーターの視点からカメラを右に動かし、 OS が自動的に選択されるのを待ちます。デバイスからPMMAキャップを取り外し、新しいPMMAキャップをデバイスの顕微鏡レンズに取り付けて、前の手順を繰り返します。

図3:患者のポジショニング。 (A,B)患者が体位を合わせます。(C)キャップがまぶたに触れるように調整しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

4. 審査後

1. 試験をやめます。まつげ毛包の画像が保存されていること、および取得した画像が画像表示ウィンドウに表示されていることを確認します。そうでない場合は、画像取得に失敗したか、データが保存されていない可能性があります。まず、ソフトウェア接続の問題やペダルの故障など、潜在的な機器の誤動作を除外します。トラブルシューティング後、患者様に状況を説明し、検査を繰り返してください。
2. 検査後、局所麻酔の効果が薄れるまで目をこすらないように患者に依頼してください。
3. デバイスからPMMAキャップを取り外します。
4. レンズクリーニングワイプで顕微鏡レンズを清掃します。
5. オプションダイアログで[取得時間順(高速)]を選択し、まつげの根元をまぶたの縁に沿ってスキャンする順番に表示されたまつげ毛根の取得画像を観察します(補足ファイル1:補足図S5)。すべての画像を確認し、分析する高品質の画像を選択し(図4)、低品質の画像を削除します。観察者にダニの存在について画像を評価してもらい、各眼の合計でDemodexダニを含むまつ毛包の数を記録してもらいます。
   注:高品質の画像は明確なダニの形態を示しており、ダニの画像化された部分はできるだけ大きく、理想的には100μm以上である必要があります。高品質の画像が利用できない場合は、2人目のオブザーバーによる独立した評価が必要です。2人のオブザーバーの結果に一貫性がない場合、3人目のオブザーバーが裁定して不一致を解決し、レポートに含めるための最終結果を確立する必要があります。
6. レポートを作成するには、時間側から鼻側までの高画質な画像をレポート用のライトボックスに配置します。レポートテンプレートとダニカウント形式( 補足ファイル2を参照)から、検査結果に基づいて結果を説明するための適切なレポートテンプレートを選択します。

図4:まつげ毛包内のデモデックス(画像:400μm×400μm)。(ア)毛包内には3匹のデモデックスダニが観察され(黄色の矢印)、1本のまつげが印が付けられています(白矢印)。ダニは異なる深さを移動する可能性があるため、単一の焦点面でのイメージングでは、個々のダニの断片化された部分がキャプチャされ、その結果、不完全な形態学的表現が生じる可能性があります。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

5.毎日仕事が終わったらデバイスの電源を切ります

1. すべてのダイアログボックスとウィンドウを閉じたら、ソフトウェアを閉じます。
2. コンピュータの電源を切ります。
3. デバイスの背面にあるロッカースイッチをIからOに切り替えて、デバイスをシャットダウンします。最適なシステムパフォーマンスとデータセキュリティを得るには、最初にソフトウェアをシャットダウンしてから、デバイスの電源を切ります。
   注意: デバイスは、特に丸一日以上、長時間連続してオンにしないでください。
4. 機器に接続されている無停電電源装置(UPS)を定期的に保守し、適切な動作を確認して、突然の停電によるデータの損失やデバイスの誤動作を防ぎます。
5. ネットワーク接続ストレージ(NAS)ストレージの利用など、定期的なバックアップを実行します。

結果

上記のSOPに続いて、2024年に デモデックス の蔓延が疑われる患者を調査しました。また、このSOPが適用されていなかった2023年のデータも比較しました。 図5に示すように、2024年に Demodex 検出のためのIVCMを受けた患者数は、前年よりも大幅に増加しています。このSOPは、4歳から92歳までのさまざまな年齢の患者の検査を可能にします。

図5:2023年と2024年にDemodex観察のためにin vivo共焦点顕微鏡検査を受ける被験者の数と年齢層。

ディスカッション

外部寄生虫のデモデックスは、人間に最も一般的な寄生虫の1つです。これらのダニは、まつげ毛包、マイボーム腺(MG)、および皮脂腺に生息し、透明で細長い形状をしており、長さは0.15〜0.4mmです¹⁷。このデバイスを使用して実行されるIVCMは、1μm/ピクセルの横方向の解像度と800倍の倍率で400μm x 400μmのリアルタイム画像を提供します。IVCMを通じて、まつげ毛包のDemodexの詳細な画像を取得できます。まぶたの縁での治療に対する患者の反応の変化も監視することができる^11,13。非侵襲的技術として、IVCMは、眼科におけるイメージングツールとして提示され、まぶたの縁¹⁸のダニを迅速に視覚化する。まつげの脱毛や光学顕微鏡下での微生物の観察と比較して、IVCMは痛みがなく、頻繁な検査、簡単なフォローアップ、高解像...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
カルボマー系点眼用ジェル、Vidisic	Bausch and Lomb、ベルリン、ドイツ	8187195
ハイデルベルク アイ エクスプローラー ソフトウェア	Heidelberg Engineering GmbH、ハイデルベルク、ドイツ	バージョン 1.3.3.0
ハイデルベルク網膜断層撮影装置III	Heidelberg Engineering GmbH、ハイデルベルク、ドイツ	HRT3-08398
塩酸プロパラカイン	Alcon Laboratories、米国テキサス州フォートワース	8387271
トモキャップ	Heidelberg Engineering GmbH、ハイデルベルク、ドイツ	18829	PMMAキャップ