方法論記事

13C2-レチニル酢酸の合成とレチノール同位体希釈試験のための用量調製

603 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/68535

⸱

2025年8月22日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nutritional Sciences, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Otolaryngology - Head and Neck Surgery, University of Wisconsin-Madison

この記事について

サマリー

酢酸レチニルは、ガスクロマトグラフィー-燃焼同位体比質量分析を血清および母乳分析に使用する場合、通常、2つの 13°Cで標識されます。この論文では、 酢酸13C2-レチニルの合成と、容積式ピペットまたはツベルクリン注射器によって送達されるレチノール同位体希釈試験の用量の調製について説明します。

要約

レチノール同位体希釈 (RID) テストは、参照標準と見なされる総肝臓予備量を推定することにより、ビタミン A の状態を評価する最も感度の高い方法です。ガスクロマトグラフィー-燃焼-同位体比質量分析検出では、レチノール部分に 13Cを添加します。 13C-レチニル酢酸の合成手順は、天然に存在するβ-イオノンから始まります。簡単に言えば、C18-テトラエンケトンはβ-イオノンから合成され、精製されます。 13C4-レチニル酢酸が必要な場合は、 13C2標識トリエチルホスホノ酢酸のカルバニオンを使用して、アセトンの3つの炭素を添加してC18-テトラエンケトンを合成する前に、β-イオノン部分に2つの 13Cを添加することができます。 13Cの3-レチニル酢酸が望ましい場合、アセトンの3つの炭素を 13Cで標識することができます。

ガスクロマトグラフィー-燃焼同位体比質量分析による将来の分析のために最も一般的に使用される 13C2-レチニル酢酸については、修正されたWittig-Horner法が使用され、標識されていないC18テトラエンケトンを 13C2標識トリエチルホスホノ酢酸のカルバニオンと反応させて、レチノール分子の14および15位に2-13Cを付加します。得られたエチルエステルはアルコールに還元され、無水酢酸で 13C2-レチニル酢酸にエステル化されます。オールトランス 異性体は、比較的無害で揮発性の高い溶媒(ヘキサンおよびジエチルエーテル)を使用して、8%水不活アルミナ上で精製され、これらは回転蒸発および油投与量の超音波処理によって除去されます。この製品は、分析標準に対する紫外可視 (UV-Vis) 分光法、薄層クロマトグラフィー (TLC)、および高圧液体クロマトグラフィー (HPLC) によって特徴付けられます。濃縮した用量は、-80°Cで大豆油に溶解して保存されます。 最終用量は大豆油で希釈され(~200 μL/用量)、ビヒクル大豆油に対する紫外可視分光法によって定量されます。RID テスト用の容積式ピペットまたはツベルクリン注射器を使用してヒトに送達するための用量が測定されます。適切な仮定を使用して、総体貯蔵量が計算され、総肝臓予備量が推定されます。

概要

レチノール同位体希釈 (RID) は、全身ビタミン A 貯蔵量 (TBS) を定量的かつ適切な仮定に基づいて測定し、総肝臓予備量 (TLR) を推定できるビタミン A 状態の唯一のバイオマーカーです。これは、ビタミンAの状態と、事前に形成されたレチノールまたはプロビタミンAカロテノイドのいずれかを含む介入の影響を測定する最も感度の高い方法です。技術的には困難ですが、RID は肝生検とは対照的に血液サンプルのみを必要とするため、正確で低侵襲です1。RID テストには、質量分析計プラットフォームに応じて、重水素化または 13C 標識酢酸レチニルの投与が含まれます。用量投与の前に、ベースラインの血液サンプルが収集されますが、 これは 13の C ラベルを使用する場合に不可欠ですが、ランダムに選択されたサブグループで行うこともできます。2番目のサンプルは、 13C標識酢酸レチニルをTBS1と混合した後に収集されます。

ビタミンA欠乏症を防ぐための介入には、食品強化、生物強化、食事の多様化、サプリメントなどがある。しかし、一部の国では、同じ人々を対象とした介入が重複しており、ビタミン A2 過剰症につながっているため、プログラムの結果を評価するためのモニタリング フレームワークが必要です。そのため、ビタミンAの状態を定量的に測定する方法が必要です。国際原子力機関(IAEA)は加盟国と協力して、研究と評価における同位体の平和利用を促進し、RIDテストの適用を支援しています。RID テストは勢いを増しており、ビタミン A 介入を実施している国でビタミン A の状態を欠乏から過剰まで評価するために、間もなく大規模な人口調査で使用される可能性があります3.

以前は、重水素化酢酸レチニル4,5のBergenらからの修飾を使用して、10,11,14,15-13 C4-レチニルアセテートが合成されました。この化合物は、ラット6およびガスクロマトグラフィー-燃焼-同位体比質量分析法(GCCIRMS)を分析に適合させたヒト実験で使用されました7。これらの貴重な実験から、GCCIRMSは非常に感度が高いため、GCCIRMSを使用したRIDテストに4つの13Cは必要ないことが判明しました。したがって、レチノール分子の14位と15位に2つの13Cのみを使用することで、トレーサーの費用が削減されます(図1)。この修飾により、合成に関連するコストが削減され、合成経路による収量の増加につながります。本明細書では、その合成のためのスケールアップされたプロトコルが説明される。

GCCIRMSは、安定同位体8の測定において他のタイプの質量分析よりも感度が高く、食事の変化や血清レチノールの自然な13C濃縮変化に応答できます。これは、トウモロコシを消費するスナネズミ9とヒト10、および野菜介入11に登録されたヒトで説明されました。実際、13C の自然存在量は集団によって異なり、RID 評価に登録された被験者で決定する必要があります12。しかし、ガーナとタイの子供13,14 とタイの女性15 の RID による自然濃縮測定には、小さなサブグループが使用されています。個々のベースライン 13C 濃縮は、個々のレベル12 で TBS を最も正確に測定するために決定する必要があります。

プロトコル

注: 研究、介入、または評価研究にヒト被験者を登録する場合、適切なインフォームドコンセント手順を踏んで治験審査委員会 (IRB) の承認を得る必要があります。

1. 酢酸13C2-レチニルの合成(図2)

注:すべての合成手順と定量は、化合物の分解と異性化を防ぐために、金蛍光灯の下で行われます。

  1. 市販のβ-イオノンから酢酸β-イオニルを大量に合成します。たとえば、水素化ナトリウム(NaH)(4 g、0.16モル)を100 mLのエーテルで覆います。非標識ホスホノ酢酸トリエチル(36 g、0.16モル)を100 mLのエーテルに滴下し、2時間撹拌します。H2 が放出され、最初の懸濁液が透明で琥珀色になります。
    注意: 水素化ナトリウム (NaH) は、幅広い化学反応に役立つ強力な還元剤です。ただし、実験室の火災は、大気中の水との発熱反応が高いため、発生する可能性があります16,17。安全データシートにアクセスすることをお勧めします。NaHなどの中程度の自然発火性の固体を取り扱うための追加のガイドラインが公開されています18。取り扱い中は油または非反応性溶媒に懸濁して保管し、反応容器や保存容器を不活性ガス(窒素やアルゴンなど)で洗い流し、反応容器を冷却し、乾燥した環境に保管した密閉容器に保管してください。当研究室では、NaHを窒素環境下で少量(~1g)バイアルに移し、密閉乾燥機で使用するまで保存しています。
  2. 40 mLのエーテルにβ-イオノン(21 g、0.12モル)を加え、一晩(20°Cで~15時間)反応させます。2日目に、反応を水で急冷し、酢酸エチル-β-イオニリデンをヘキサンに抽出し、一連の分離漏斗で水で繰り返し洗浄して回収率を最大化します。有機層(無水MgSO4)を乾燥させ、ろ過し、濃縮します
    注:薄層クロマトグラフィー(TLC)は通常、合成のこの段階で微量の不純物のみを検出します。これは、次のステップに進む前に、-80°Cで長期間保存できます。
  3. 酢酸エチル-β-イオニリデン(28 g、0.11モル)を120 mLの1モル水素化リチウムアルミニウム(LiAlH4)をジエチルエーテル中で反応させます。反応容器をドライアイスアセトン浴に沈め、溶液を連続的に撹拌してβ-イオニリデンエタノールを生成します。
    注意: 水素化アルミニウムリチウム (LiAlH4) は強力な還元剤です。安全データシートにアクセスし、LiAlH418,19などの中程度の自然燃性固体を取り扱うための追加のガイドラインを参照してください。ほとんどの安全対策の主な目的は、LiAlH4が大気にさらされるリスクを最小限に抑え、暴走反応を防ぐことです。これには通常、取り扱い中にこれらの化合物を油または非反応性溶媒に懸濁させ、反応容器や貯蔵容器を不活性ガス(窒素やアルゴンなど)で洗い流し、反応容器を冷却し、乾燥した環境に保管された密閉容器にLiAlH4を保管することが含まれます。私たちの研究室では、水素化アルミニウムリチウムは、粉末状ではなく密封された1モルボトルで購入され、必要な量は注射器で除去され、ボトルの雰囲気は窒素に置き換えられます。
  4. 28 g(0.12モル)のβ-イオニリデンエタノールを300 mLのヘキサンに溶解します。1日あたり約50 gの90%MnO2 を3日間(51 g、52 g、および54 g)加え、反応混合物をさらに長時間撹拌します(多くの場合、20°Cで2日間)。最後に、35 gのMnO2 を加え、約15時間一晩放置します。反応は約90%完了します。MnO2 からβ-イオニリデンアセトアルデヒドをジクロロメタンでろ過し、洗浄します。
  5. 粗β-イオニリデンアセトアルデヒド(22 g、0.10モル)を150 mLのアセトンに一定の攪拌で溶解し、10 mLの1N水酸化ナトリウムを滴下します。反応を6時間放置します。
  6. C18テトラエンケトンをヘキサンで抽出し、一連の分離漏斗を使用して水で繰り返し洗浄し、回収率を最大化します。得られた溶液をロータリーエバポレーターで乾燥させ、粗シス トランス C18テトラエンケトンを生成します。 トランス 異性体はヒトの研究に最も望ましいため、ヘキサン中の0〜10%酢酸エチルのゆっくりとした勾配を使用して、4%水不活性化シリカゲル(300 g)で混合物を精製します。
  7. NaH(1.2 g、0.05モル)を50 mLのエーテルで撹拌します。50 mLのエーテルに溶解した 13Cの2-トリエチルホスホノ酢酸(11 g、0.049モル)を滴下し、2時間撹拌します。C18テトラエンケトン(12 g、0.044モル)を50 mLのエーテルに溶解し、20°Cで約15時間一晩反応させます。
  8. 反応を水で急冷し、14,15-13 C2-レチノイン酸エチルエステルをヘキサンで抽出し、分離漏斗で水で洗浄します。有機層を無水MgSO4で乾燥させ、濃縮します。8%水不活性化中性アルミナ(400 g)をヘキサン勾配中の0〜3%ジエチルエーテルでゆっくりと精製し、シス/トランス異性体を生成します。
    注:多くの場合、最初の精製にはTLCによって判断された汚染物質が含まれています。汚染物質は、TLCプレートをヨウ素蒸気と反応させることによって視覚化されます。汚染物質が存在する場合は、純粋な 14,15-13 C2-レチノイン酸エチルエステルを得るために、400 g の 8% 水不活化中性アルミナを 100% ヘキサンで再精製することが重要です。
  9. 14,15-13 C 2-レチノイン酸エチルエステル(3.7 g)を15 mLの1モルリチウム水素化リチウムをドライアイスアセトン浴で還元し、攪拌しながら14,15-13 C2-レチノールを生成します(図1)。
  10. 14,15-13 C 2-レチノール(3.5 g)を20 mLのトリエチルアミンに溶解します。溶液を撹拌しながら、3.5 mLの無水酢酸と7 mLのトリエチルアミンを混合し、フラスコに滴下します。フラスコを冷蔵庫に一晩置いて、14,15-13 C2-酢酸レチニルを形成します(約15時間)。
  11. 粗14,15-13 C2-レチニル酢酸3.9 gをヘキサンに抽出し、乾燥、濃縮、および500 gの8%水不活化中性アルミナとヘキサン勾配のゆっくりとした0〜3%ジエチルエーテルで精製します。325 nmの紫外可視(UV-Vis)分光光度計で画分をモニターします。回転蒸発器で残りの溶媒をすべて除去します。HPLCおよびフォトダイオード検出で最終製品を評価し、シス/トランス比を決定します。超圧液体クロマトグラフィーを使用してcis/transプロファイルを分離する高度なグラジエントシステムの例は、補足図S1に記載されています。
    注:この段階では、 シス/トランス 比は通常>95%オールトランス です。
  12. 保管する場合は、オールトランス 14,15-13 C2-レチニル酢酸を他の添加物を含まない食品グレードの大豆油に溶解し、-80 °C で窒素で洗い流した琥珀色のガラスに保管し、濃縮ストックとしてラベルを付けます。

2. 安定同位体標識酢酸レチニルの油性溶液の用量調製

注:同位体標識酢酸レチニルは、カプセル20 または250 μL容積式ピペット21 または医療用シリンジ22 で送達される油溶液で投与されています(図3)。以下に説明するカプセルの安定性(図4)をテストしました。

  1. 合成直後に、標識された酢酸レチニルを~15 mLの強化されていない植物油(食品グレードの大豆油など)に溶解してから結晶化し始め、最終用量を調製する準備ができるまで-30〜-80°Cの24 mLの琥珀色のバイアルに保管します。
    1. ラベル付きの酢酸レチニルを購入した場合は、ヤスリで傷をつけて真空密封アンプルの上部を慎重にはねつけるか、スクリュートップボトルのシールを破ります。必要な質量に応じて、24 mLの茶色の琥珀色のボトルに計量量を入れ、少量の植物油を加えます(10 mLで十分です)。混合物が透明な溶液になるまで超音波処理します。
  2. 被験者数に200μLを掛けて、最終的なオイルの量を推定します。たとえば、60人の被験者を登録する場合は、約70回の用量を補って、無駄に十分な量(約10〜20%)を確保します。したがって、70 × 200 μL は 14 mL です。
    注:合成油や結晶の質量に頼らないでください。分光光度計を使用して線量を定量化する必要があります。すべての合成ビタミンAには残留溶媒が含まれています。これらは、超音波処理または穏やかな窒素の流れの下で消散できますが、質量だけで同位体線量を決定できない主な理由です。
    標識された酢酸レチニル溶液を使用せずに冷凍庫に長時間保管する場合は、再分析して、大幅な劣化が発生したかどうかを判断する必要があります。
  3. 酢酸レチニルを定量するには:
    1. 紫外可視分光光度計(走査型ダブルビーム分光光度計が推奨)と付属のコンピュータ(該当する場合)の電源を入れます。製造元の指示に従ってUV-Vis分光光度計を起動します。分光光度計を読み取りの前に、少なくとも30分間ウォームアップします。
    2. 2つの25 mLメスフラスコとキャップをセットアップし、それぞれに25 mLのヘキサンをほぼラインまで充填します。一方のフラスコに「オイル」または「ブランク」、もう一方のフラスコに「ビタミンA」または「用量」のラベルを付けます。次に、ブランクが実行されるまでビタミンAフラスコを脇に置きます。
    3. 純粋な大豆油を使い捨てのプラスチックカップに注ぎ、オイルフラスコに20〜40 μLを加えてシステムをブランクにします。
      注:20 μLを使用することがよくありますが、ブランクと同位体の投与量が同じである限り、それ以上使用できます。
    4. 4〜5倍反転させてオイルとヘキサンを混合し、両方の分光光度計石英キュベットをこの溶液ですすぎ、両方を~75%満杯に満たします。
    5. 両方のキュベットを分光光度計に入れ、透明な前面と背面に触れないように注意します(つや消し面のみでハンドルを握ります)。最高の精度を得るには、一致する各キュベットの番号の付いた前面をユーザーの方に向けます。
    6. サンプルの遮光ドアを閉めます。
    7. [ ブランク] または [ベースライン ]機能をクリックして、システムがオイルとヘキサンのベースライン吸光度を測定できるようにします。これにより、オイルブランクヘキサン溶液の吸収が補正されます。260〜400nmでスキャンします。このプロセスが終了した後、400 nmで読み取り値が「ゼロ」であることを確認します。そうでない場合は、 ゼロ ボタンを押してスキャンを再実行します。完了すると、システムは酢酸レチニルの線量吸光度を測定する準備が整います。
    8. サンプルキュベットの内容物を廃棄し、Doseヘキサン溶液で満たします。サンプルを適切な場所に置き、スペクトルをスキャンします。ピークを選択し、吸光度を読み取ります。純粋な酢酸レチニルは、325 nmで最大ラムダが1つしかありません。
      注:複数のピークがある場合、または280 nmに1つのピークがある場合、酢酸レチニルは分解されているため、投与に使用しないでください。
  4. ステップ2.3の計算
    注:レチノールのE 1%、1 cmは、ヘキサン中で325 nmで1,810です。レチノール当量の酢酸レチニルを定量します。
    1. 吸光度を0.181で割って、μg/mLの溶液を求めます。
    2. 25 mLを掛けて、20マイクロリットルの油溶液中のμgを取得します。
      注: 例:25 mLのヘキサン中の20 μLの油の吸光度は0.295です。
      0.295/0.181 = 1.630 μg/mL × 25 mL = 40.75 μg(オイル20 μL)
      用量に286μgが必要な場合、それは140.4μLです。これは1μmoleですが、ラベルのため腸内で288μgの 13°C2-レチノールが作られます。希釈して200 μLの用量に近づけ、上記の定量をやり直すことをお勧めします。
  5. 安定性をテストするためのカプセルの調製
    1. カプセルを大きな白い底と小さな青いキャップに分けます。
    2. 白いカプセルの底をピペットチップボックス(1箱あたり96カプセル)に入れ、ほこりがカプセルに入るのを防ぐために閉じ、青いキャップをジッパー付きのビニール袋に一晩入れます。ひびの入ったカプセルは廃棄してください。
    3. 酢酸レチニル油溶液を室温にします。少量(~5 mL)を小さな未使用のプラスチックカップに注ぎます。
    4. 5 mLシリンジ(1 = 100 μL)をロードし、トリガープレスごとに200 μLを分注するように「2」に設定して、リピータピペットを準備します。
    5. ローディングアームを引き上げて、酢酸レチニルオイルをリピーターピペットにロードします。少なくとも4 x 200 μLのアリコートをカップに戻して、チップから気泡を取り除きます。
    6. ピペットの先端をカプセルの内壁に軽く触れ、トリガーを押して、白いカプセルの底あたり1 x 200 μLのアリコートを分注します。
    7. リピーターピペットが空に近づいたら、さらにオイルを吸い上げます。
    8. 96カプセルのセット全体が完成したら、オイルをカップに戻し、キャップにひびが入らないように注意しながら、青いキャップを各白い底に軽くスライドさせ始めます。
    9. すべてのキャップをカプセルに装着したら、各カプセルを持ち上げて取り出し、キャップがしっかりと装着されていることを軽く確認してから、チップボックスに交換します。
    10. カプセルは選択した温度と条件で保管してください。カプセルをアルミホイルの下のラックに保管することで、暗闇を実現できます。以下に例を示します。
      ある。 冷凍庫で:暗所で-20°C
      b. 冷蔵庫内:暗所で4°C
      c. ベンチ上:暗所で20°C(室温)
      d. ベンチ上、しかし放置されている:20°C(室温)標準蛍光灯にさらされる
      e. オーブンで、他の場所でより高い周囲温度を再現:暗所で37°C

3. 用量投与

注:容積式ピペットは、技術者の間で精度と精度を判断するために、ツベルクリン注射器と直接比較されています(図5)。

用量は、250 μL Rainin 容積式ピペットまたは 1 mL ツベルクリン注射器を使用して投与されます。

  1. 冷凍した用量を解凍するか、現場に行く場合は保冷剤を入れたクーラーに入れてください。輸送中、線量は通常解凍されます。
  2. 琥珀色のガラスバイアルをクーラーから取り出し、開きます。バイアルが転倒しないように、バイアルを「マグカップ」またはビーカーに入れて保管してください。
  3. ピペットチップまたはツベルクリン注射器をオイルに挿入し、少量を吸い上げます。プランジャーをすばやく押し下げて、形成された可能性のある気泡を移動させます。必要な量をピペットまたはシリンジにゆっくりと引き込みます。気泡がないことを確認してください。
  4. 先端の外側をティッシュで拭きます。ピペットチップやシリンジの端に触れると液体が引き出されますので、触れないでください。
  5. 先端を参加者の口に入れ、オイルを口に放出し、口を閉じて飲み込むように指示します。
    注: 参加者が投与のために頭を少し後ろに傾けることができれば役に立ちます。
  6. 投与後、少なくとも10 gの脂肪を提供する「チェイサー」または脂肪分の多いスナックを投与します。幼児には、プラスチック製のスプーンに配達された強化されていないオイル1mLをチェイサーとして投与します。年長の子供と大人には、ピーナッツバターサンドイッチの半分、揚げた白いジャガイモ、またはチョコレートスプレッドのバゲットがフォローアップのおやつとして適しています。
    注: どのスナックが地元で受け入れられるかを判断するには、有益な調査を実施する必要があります。

結果

市販のβ-イオノンを皮切りに、酢酸エチル-β-イオニリデン28gを合成しました。還元後、塩基性条件下で22gのβ-イオニリデンアセトアルデヒドをアセトンと反応させて、C18-テトラエンケトンを生成しました。精製されたC18-テトラエンケトン12gが得られ、これは~90%がオールトランスでした。その後、これを修正されたWittig-Horner法を使用して 13C2-トリエチルホスホノ酢酸のカルバニオンと反応させ、レチノール分子の14、15位に2つの 13Cを添加しました。得られたエチルエステル(収率3.7 g)をアルコールに還元し、トリエチルアミンに溶解した無水酢酸で 13C2-レチニル酢酸にエステル化した。合成ビタミンは、揮発性の高い有機溶媒であるヘキサンとジエチルエーテルを使用して、8%水不活化アルミナ上で精製されました。得られた調製物は、紫外可視分光法、TLC、およびHPLCを使用して特徴付けられました。長期保存のために、標識された酢酸レチニルは、-80°Cで大豆油に溶解して保存されます。

上記の14,15-13 C2-レチニル酢酸の成功した合成スキームを図2に示します。β-イオノンから始まる経路全体は、7つのステップで構成されています。最初の収量は、0.9 gのオールトランス14,15-13 C2-レチニル酢酸でした。シス/トランス異性体画分(1.2 g)を結合し、300 gの8%水不活性化中性アルミナで再精製し、さらに0.3 gのオールトランス14,15-13C2-レチニル酢酸を得ました。

カプセル中の酢酸レチニルの安定性を決定するために、酢酸レチニル(1 g)をヘキサンに溶解し、ヘキサンを溶媒とする300 gの8%水不活化アルミナを使用してオープンカラムクロマトグラフィーによって精製しました。酢酸レチニルは、TLCおよびUV-Vis分光法によって監視され、純粋な画分のみが使用されました。このプロセスは、上記のRIDテストのためにTanumihardjo研究室で 13C2-レチニルアセテートの合成および精製に使用されるプロセスと同じです。精製した酢酸レチニルを大豆油に溶解し、有機溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、さらに油を最終濃度7.5μMまで添加しました(200μLあたり1.5μmol、GCCIRMSを分析に使用した場合のRIDテストの成人と子供の用量の中間点)。濃度は、上記のように紫外可視分光法によって決定されました。

安定性試験のために、200 μL のオイルのアリコートをサイズ 3 のセルロース カプセル(最大容量 300 μL)に分配しました。各用量のカプセルは 5 つの条件下で保存されました。カプセルをアルミホイルの下のラックに保管することで暗闇を実現しました。カプセル(150)を条件ごとに調製し、合計750カプセルを調製しました:i)冷凍庫中:暗闇で-20°C。ii) 冷蔵庫内: 暗所で 4 °C。iii) ベンチ上: 暗所で 20 °C (室温)。iv) ベンチ上にあるが除外: 20 °C (室温) 標準蛍光灯にさらされる。v)オーブンで、他の場所でより高い周囲温度を再現します:暗闇で37°C。

カプセル安定性試験では、各時点(-20°C、4°C、室温暗、室温明、37°C)で各条件の3カプセルを測定しました。すべてのカプセルを室温に戻しました(室温のカプセルが最初に分析されました)。温度変化は吸光度変動を引き起こします。カプセルは 480 日間測定されました。カプセルは、-20°Cと4°Cで9か月間安定していました(図4)。

標準として、シングルユース ツベルクリン注射器と Rainin 容積式ピペットを比較するために、方法比較を実施しました。Rainin容積式ピペットは、局所的な温度と圧力を考慮して水で校正され、3つのチップで3回テストされ、風袋計量ボートに200 μLの設定で分注された目標オイル量を決定しました。調剤プロトコルは、経験レベルの異なる 10 人の技術者によって実施されました。各技術者について、8 つのシリンジを 3 回テストし、ピペットのリファレンスと比較しました。ピペットの側面をティッシュで拭き取り、オイルを斜めに計量ボートに分配し、オイルを最大限に放出しました。技術者は、プロトコル全体を通じて分注された質量の結果を知らされませんでした。油塊は別の技術者によって記録されました。このプロセスは、8本のツベルクリン(Norm-Jectなど)シリンジを使用して、200 μLの大豆油で繰り返しました。

R 統計ソフトウェアを使用して、分散成分モデル (FitVCA)22 を適合させました (図 5)。測定された変動要因には、技術者、技術者内の注射器、および反復エラーが含まれていました。ピペットの送達量と比較した場合の平均(95%CI)正規化シリンジ送達値は0.996(0.912、1.08)でした。反復誤差からの分散は総分散の 64.8% を占めており、変動の最大の原因は同じシリンジ内での繰り返し測定によるものであることを示しています。技術者と技術者内の注射器からの分散率ははるかに低く、それぞれ22.9%と12.3%に寄与しました。

サブグループ分析は、経験に基づいて技術者を 2 つのグループ (n = 5/グループ) に分けることによって実行されました。正規化された注射器の平均送達は両グループ間で同様でしたが、95%CIは経験の多い技術者ほど狭かった。それぞれ1.001(0.939、1.063)と0.998(0.900、1.100)。経験豊富な技術者では、ほとんどの差異は技術者内の注射器 (57.0%) と複製エラー (42.9%) によるものでしたが、経験の浅い技術者では、ほとんどの差異は技術者 (32.7%) と複製エラー (67.2%) によるものでした。

figure-results-1
図1:炭素に番号が付けられたレチノールの構造。 13C は通常、ガスクロマトグラフィー燃焼質量分析で使用するために 14 位と 15 位に追加されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2
図2:ガスクロマトグラフィー-燃焼同位体比質量分析を血清または母乳分析に使用した場合のレチノール同位体希釈試験で使用される14,15-13 C2-レチニルアセテートの合成スキーム。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-3
図3:先端にデッドボリュームのない1 mLツベルクリンシリンジと、トレーサー研究での投与に使用される250 μL容積式ピペット。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-4
図4:5つの異なる条件でカプセルに保存された酢酸レチニルの分解曲線。 条件は、暗所で-20°C、4°C、20°C(室温)、標準蛍光灯で20°C(室温)、37°Cです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-5
図5:評価中に結果を知らされていない10人の技術者を対象に、1 mLのツベルクリン注射器と250 μLの容積式ピペットを比較した用量供給量の分散成分分析。 値は、容積式ピペットに正規化されたシリンジから分注されたオイル質量(200 μL)です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足図S1:超圧液体クロマトグラフィーによる酢酸14,15-13C-レチニルの最終純度チェックの例。 対応するスペクトルは、ビタミンの シス/トランス 型に特徴的です。UPLC 条件は、溶媒 A 70:25:5(アセトニトリル:水:イソプロパノール)と 10 mM 酢酸アンモニウム、溶媒 B は 75% アセトニトリル、25% イソプロパノールでした。使用したカラムは、Acquity UPLC、BEH C18 1.7 μM、2.1 × 100 mm カラムでした。カラムは29°Cに設定され、流速は0.4 mL/minでした。グラジエントは100%溶媒Aから始まり、5.0分間保持し、続いて98%溶媒Bに7分間移行し、8分間保持した後、1分間かけて100%溶媒Aに戻り、4分間平衡化を保持しました。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

重水素化および13C標識酢酸レチニルの商業的な供給源がありますが、熟練した有機化学者向けの文献には、レチノールの複数の合成経路があります。重水素化酢酸レチニルがたどる合成経路を選択し、上記のようにレチノール部分の骨格に13°Cを加えるように適切な調整を行いました。14,15-13 C2-レチニル酢酸の合成は、市販のβ-イオノンから始まる7段階の手順を使用して達成されました。β-イオノンは天然に存在する植物成分であり、バラなどの香りに貢献します。合成経路における最も重要なステップは、C18 テトラエン ケトンの形成です。この中間化合物は、後続のステップで良好な収率を生み出すために少なくとも 90% の純度である必要があります。

標識は、市販の 13C2-トリエチルホスホノ酢酸を使用した修正されたWittig-Homer手順を使用して実行されました。標識された化合物は、TBSを決定し、TLRを推定するためにRIDテストで使用されます。この方法は、標識化合物の生理学的レベルを投与された個人の血清または母乳から精製されたレチノールの分析に GCCIRMS を利用します。最も一般的な用量は、子供の場合は 1 μmol、成人の場合は 2 μmol です。GCCIRMS分析は同位体濃縮に敏感ですが、血清分析では、GCに導入するのに十分なレチノール質量を得るために最低400 μLの血清が必要です。

13C-RID 検査は、臨床研究23,24 とアフリカの子供たちのグループ25 で使用されており、将来的には人口ベースの作業に利用できるようにする予定です。カプセルと注射器で実験を行い、これらの修飾が集団研究に適しているかどうかを調査しました。カプセルは直立位置にある必要があり、そうしないと漏れます。私たちは、現場で使用するために通常の琥珀色の錠剤ボトルに保管できるという考えをすぐに破棄しました。カプセルは、冷蔵庫と冷凍庫の温度で~9か月間しか安定していませんでした。密封されたカプセルの製造は、保管中の大気へのわずかな曝露を減らすことにより、安定性を向上させる可能性があります。カプセルの使用は、実装前にユーザーグループによってテストおよび検証する必要があります。

最終的な油溶液は室温で~2ヶ月間安定しますが、一度分解し始めると、劣化は急速に続きます。投与量は TBS の計算に使用されるため、RID テストで許容される部分的な活動はありません。使用中は溶液を現場の保冷剤に保管し、投与が完了したらできるだけ早く再凍結することをお勧めします。その日の必要量よりも数回だけ持参し、残りは冷凍しておくのが最善です。オイル自体に抗酸化物質が含まれているため、凍結と解凍はこれらの溶液に影響を与えません。油溶液は血液サンプルよりも堅牢ですが、常に暗所に保管し、使用しないときは冷凍する必要があります。

用量は、250 μL Rainin 容積式ピペットまたは 1 mL ツベルクリン注射器を使用して投与されます。空気置換ピペットは、油に溶解した用量には適していません。私たちの研究室は、これら2つの方法を実験的に比較しました(代表的な結果を参照)。ピペットまたはシリンジによる投与は、いくつかの偏差を除いて同様です。研究や臨床研究にはRainin容積式ピペットが推奨されますが、シリンジは集団ベースの作業にも使用できます。用量精度を最大化するために、チップのデッドボリュームが少ないシリンジ (Norm-Ject など) をお勧めします。

RID テストの計算には投与された用量が含まれ、投与された用量の誤差は、結果として得られる TBS 推定値の誤差に比例します。ツベルクリン注射器と容積式ピペットの使用では、平均正規化注射器送達は 1 に近く、注射器が集団研究に正確な線量送達を提供できることを示しています。95% の信頼限界は、目標線量の約 8% ±でした。シリンジの既往経験が多い技術者は、経験の少ない技術者と比較して、95%CI(±6%)が狭く、技術者からの分散寄与度が低かった(±10%)。これは、現場で実装する前に、車両オイルを使用したトレーニングプロトコルと検証を実行する必要があることを示唆しています。これらの結果は、集団ベースの研究における用量反応およびRID試験で用量を投与するための費用対効果が高く時間を節約できる送達方法として、使い捨てツベルクリン注射器を使用したい各検査室でさらなる検証に値します。

報告された精度と精度が ≤1% であるため、RID テストを使用した研究および臨床研究には容積式ピペットを選択し、個人レベルの精度を最大化しました。比較すると、修正された相対線量反応試験は定性的であり、与えられた線量1 に基づく計算はありません。したがって、集団ベースの調査では、試験に注射器を使用し、用量を約 0.7 mL のビヒクルに溶解することを推奨しています。

RID検査は、TBSを定量化し、ビタミンAの状態を評価するための参照標準であるTLRを推定するための高感度の方法です。重水素または 13C標識のいずれかを使用して、多くの研究用途で使用されています。現在および将来のアプリケーションでは、臨床現場で RID テストを使用し、調査では母集団サブグループを使用します。これらのアプリケーションでは、投与の簡素化が重要になります。

開示事項

著者は、この原稿の内容と利益相反はありません。

謝辞

この研究は、NIH-R01 DC019357と IAEA 調整研究プロジェクト E43035 によって資金提供されました。ウィスコンシン大学マディソン校の統計コンサルティンググループのニコラス・キューラー氏に、使い捨て注射器法の比較の分析を支援してくださったことに感謝します。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
無水酢酸シグマ・アルドリッチ242845
アセトンシグマ・アルドリッチ179124
酸化アルミニウムシグマ・アルドリッチ199974
ビーカー任意ガラス供給会社 
ベータイオノンシグマ・アルドリッチW259500
エーテルシグマ・アルドリッチ673811
ガラスパスツールピペット任意ガラス供給会社 
ヘキサンシグマ178918
標識ホスホノ酢酸トリエチルシグマ・アルドリッチ293202
リチウム水素化アルミニウム溶液アクロスオーガニック199511000
酸化マンガンシドマ・アルドリッチ310700
容積式ピペットレイニン17008579
酢酸レチニルシグマ・アルドリッチR4632
セパレーションファンネル任意ガラス供給会社 
シリカゲルシグマ・アルドリッチ1.07734
水素化ナトリウムオールドリッチ223441
水酸化ナトリウムフィッシャーサイエンティフィックS318-100
分光 光度 計任意のスキャンダブルビームが好ましい
トリエチルアミンシグマ・アルドリッチ471283
トリエチルホスホノ酢酸オールドリッチT61301
ツベルクリン注射器Norm-Ject19G334
植物油大豆乾物屋
メスフラスコ(25 mL)任意ガラス供給会社 

参考文献

  1. Tanumihardjo, S. A., et al. Biomarkers of nutrition for development (BOND) - Vitamin A review. J Nutr. 146 (9), 1816S-1848S (2016).
  2. Tanumihardjo, S. A., Kaliwile, C., Boy, E., Dhansay, M. A., van Stuijvenberg, M. E. Overlapping vitamin A interventions in the United States, Guatemala, Zambia, and South Africa: case studies. Annals NY Acad Sci. 1446 (1), 102-116 (2019).
  3. Sheftel, J., Loechl, C., Mokhtar, N., Tanumihardjo, S. A. Use of stable isotopes to evaluate bioefficacy of provitamin A carotenoids, vitamin A status, and bioavailability of iron and zinc. Adv Nutr. 9 (5), 625-636 (2018).
  4. Bergen, H. R., Furr, H. C., Olson, J. A. Synthesis of tri-, tetra-, and penta-deuterated forms of vitamin A. J Labelled Cpd Radiopharm. 25 (1), 11-21 (1988).
  5. Tanumihardjo, S. A. Synthesis of 10, 11, 14, 15-13C4- and 14, 15-13C2-retinyl acetate. J Labelled Cpd Radiopharm. 44 (5), 365-372 (2001).
  6. Tanumihardjo, S. A. Vitamin A status assessment in rats using 13C4-retinyl acetate and gas chromatography-combustion isotope ratio mass spectrometry (GCCIRMS). J Nutr. 130 (1), 2844-2849 (2000).
  7. Gannon, B. M., Valentine, A. R., Davis, C. R., Howe, J. A., Tanumihardjo, S. A. Duration of retinol isotope dilution studies with compartmental modeling affects model complexity, kinetic parameters, and calculated vitamin A stores in US women. J Nutr. 148 (8), 1387-1396 (2018).
  8. Preston, T. Existing and emerging technologies for measuring stable isotope labelled retinol in biological samples: isotope dilution analysis of body retinol stores. Int J Vitam Nutr Res. 84 (Suppl 1), 30-39 (2014).
  9. Gannon, B. M., et al. 13C natural abundance of serum retinol is a novel biomarker for evaluating provitamin A carotenoid-biofortified maize consumption in male Mongolian gerbils. J Nutr. 146 (7), 1290-1297 (2016).
  10. Sheftel, J., Gannon, B. M., Davis, C. R., Tanumihardjo, S. A. Provitamin A-biofortified maize consumption increases serum xanthophylls and 13C-natural abundance of retinol in Zambian children. Exp Biol Med. 242 (15), 1508-1514 (2017).
  11. Howe, J. A., Valentine, A. R., Hull, A. K., Tanumihardjo, S. A. 13C natural abundance in serum retinol acts as a biomarker for increases in dietary provitamin A. Exp Biol Med. 234 (2), 140-147 (2009).
  12. Gannon, B. M., et al. Comparison of total body vitamin A stores using individual versus population 13C-natural abundance of serum retinol in preschool children and women residing in 6 diverse African countries. J Nutr. 153 (4), 949-957 (2023).
  13. Newton, S., et al. Vitamin A status and body pool size of infants before and after consuming fortified home-based complementary foods. Arch Public Health. 74, 10(2016).
  14. Pinkaew, S., et al. Triple-fortified rice containing vitamin A reduced marginal vitamin A deficiency and increased vitamin A liver stores in school-aged Thai children. J Nutr. 144 (4), 519-524 (2014).
  15. Nimmannun, K., et al. Breast milk retinol concentrations reflect total liver vitamin A reserves and dietary exposure in Thai lactating women from urban and rural areas. J Nutr. 152 (12), 2689-2698 (2023).
  16. A campus laboratory fire involving lithium aluminum hydride. , https://ehs.stanford.edu/reference/campus-laboratory-fire-involvinglithium- aluminum-hydride (2025).
  17. Merlic, C. A., Ferber, C. J., Schroder, I. Lessons learned− lithium aluminum hydride fires. ACS Chem. Health Saf. 29 (4), 362-365 (2002).
  18. Chandra, T., Zebrowski, J. P. A safety guidance document for lithium aluminum hydride (LAH) reduction: A resource for developing specific SOPs on LAH manipulations. ACS Chemical Health & Safety. 31 (2), 162-171 (2024).
  19. Procedures for safe use of pyrophoric solids accessed. , https://ehs.ucsc.edu/programs/research-safety/documents/ucla-pyrophoric-solid.pdf (2025).
  20. Tang, G., et al. Green and yellow vegetables can maintain body stores of vitamin A in Chinese children. Am J Clin Nutr. 70 (6), 1069-1076 (1999).
  21. Gannon, B., et al. Biofortified orange maize is as efficacious as a vitamin A supplement in Zambian children even in the presence of high liver reserves of vitamin A: a community-based, randomized placebo-controlled trial. Am J Clin Nutr. 100 (6), 1541-1550 (2014).
  22. R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2024).
  23. Valentine, A. R., Davis, C. R., Tanumihardjo, S. A. Vitamin A isotope dilution predicts liver stores in line with long-term vitamin A intake above the current Recommended Dietary Allowance for young adult women. Am J Clin Nutr. 98 (5), 1192-1199 (2013).
  24. Sheftel, J., et al. Findings in 3 clinical trials challenge the accuracy of the Institute of Medicine's estimated average requirements for vitamin A in children and women. Am J Clin Nutr. 113 (5), 1322-1331 (2021).
  25. Suri, D., et al. Association between biomarkers of inflammation and total liver vitamin A reserves estimated by 13C-retinol isotope dilution among preschool children in five African countries. J Nutr. 153 (3), 622-635 (2023).

再版と許可

タグ

ビタミンAの状態13Cレチニルアセテート肝臓ビタミンAガスクロマトグラフィー同位体比質量分析法ウィッティグ・ホーナー合成薄層クロマトグラフィー紫外可視分光法高速液体クロマトグラフィー

この記事は公開されました

動画は近日公開

お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。