ここでは、NMDA誘発性興奮毒性下でのマウス網膜の解剖学的特徴と表現型を調査するための遺伝的指向アルカリホスファターゼ(AP)標識法の使用について説明します。いくつかの網膜神経節細胞(RGC)サブタイプ特異的レポーター株と組み合わせて、変性プロセス全体を通じて死にかけているRGCの新しい表現型を明らかにします。
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この記事について
サマリー
要約
網膜神経節細胞 (RGC) は網膜の出力ニューロンであり、視覚情報を脳に伝達する役割を果たします。成熟マウス網膜では、ゲノム、形態学的、機能的特徴に基づいて、40以上のRGCタイプが同定されています。RGC 変性は、緑内障や外傷性視神経障害など、さまざまな衰弱性網膜疾患の特徴です。RGC の変性、生存、さまざまな疾患状態にわたる回復力の根底にある細胞および分子メカニズムについてより深い洞察を得ることは、効果的な治療介入を開発するために非常に重要です。RGC変性を調査するために、RGCの形態と中心投起のための網膜発達研究で以前に使用されていたシンプルかつ強力な技術を採用しました。ここでは、この方法を適用して、NMDA誘発性興奮毒性下でのRGCの解剖学的表現型を評価します。このアプローチにより、多数の変性 RGC を経時的に視覚化できるため、変性イベントのシーケンスをマッピングし、死にかけている RGC の特徴的な表現型を特定し、NMDA 誘発性損傷に耐性のある RGC を区別することができます。
概要
外傷性脳損傷 (TBI) は、脳に神経損傷を引き起こす突然の損傷です。自動車事故やスポーツ衝突、爆発による爆風による損傷など、重度の外傷性脳損傷では、機械的な力が細胞構造を破壊し、炎症、酸化ストレス、興奮毒性を引き起こし、最終的には神経細胞死を引き起こす可能性があります1,2。
中枢神経系 (CNS) の最もアクセスしやすい部分である網膜は、興奮毒性の根底にある分子メカニズムを研究し、治療介入の戦略を開発するためのモデル TBI システムとして機能してきました 3,4,5。外傷性脳損傷研究に最も適切な網膜モデルは、視神経クラッシュモデルと網膜のN-メチル-D-アスパラギン酸(NMDA)誘発性興奮毒性です。NMDA誘発性興奮毒性網膜モデルでは、RGCが主要な興奮性神経伝達物質としてグルタミン酸を利用し、AMPA受容体(AMPAR)、KAPA受容体(KAPAR)、NMDA受容体などのさまざまな種類のグルタミン酸受容体を利用して軸索電位を誘発するため、網膜神経節細胞(RGC)が最も感受性の高いタイプの網膜ニューロンとして同定されました6。RGCに加えて、他の網膜細胞および神経回路もNMDA治療の影響を受ける可能性があります7,8,9。NMDA の硝子体内適用は、NMDA 受容体の長時間の開放を誘発し、細胞へのカルシウムの過剰な流入につながり、過剰な興奮性ニューロン活動と不均衡なカルシウム恒常性を引き起こします 10,11,12,13。
NMDA受容体は、GluN1、GluN2、およびGluN3の3つのサブユニットで構成されるヘテロマー複合体です14,15,16,17,18。Grin1によってコードされるGluN1は、Grin1の選択的スプライシングにより、マウスに8つのアイソフォームが含まれています。4つの異なるGluN2サブユニット(a-d)があり、これらは4つの別々の遺伝子によってコードされています:Grin2a-2d。Grin3aと3bによってコードされる2つの異なるGluN3サブユニット(aとb)があります。scRNA-seqデータ19,20によると、Grin1は、ほとんどのRGCサブタイプ(図1A)および弱発現レベルから中程度の少数の無軸細胞(AC)サブタイプ(図1B)で高度に発現しています。Grin2aは、より少ないRGCおよびACサブタイプに富んでいますが、Grin2bはほとんどのRGCおよび多くのACサブタイプで中程度に発現しています(図1A、B)。RGCおよびACにおけるGrin2c、Grin2d、およびGrin3bの発現レベルは非常に低いです(図1A、B)。Grin3aの発現は、いくつかのRGCサブタイプで見られ、いくつかのACでは弱く見られます(図1A、B)。NMDA 受容体の役割に加えて、カルシウム透過性 AMPAR を介したカルシウム流入誘発興奮毒性は、複数の疾患モデルで報告されています21。NMDA受容体サブユニットの発現は、NMDA誘発性興奮毒性が主にRGCおよびACを標的とする理由についての手がかりを提供する可能性があります9、10、14、22、23。
NMDA誘発性網膜表現型の肉眼的評価の従来の方法には、組織学的異常を検出するためのヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色、細胞死のためのTUNELアッセイ、および細胞型特異的バイオマーカー8,10,24,25,26を使用した免疫蛍光(IF)染色が含まれます.細胞レベルでは、共焦点イメージングと色素充填技術を使用して、NMDA 誘発網膜モデルにおける死滅 RGC における一連のイベントを調査しています。これらの方法は、瀕死のRGCの細胞内コンパートメントに関する貴重な洞察を提供し、NMDAの侮辱下で生き残る回復力のあるRGCの種類の同定を可能にしました27,28。
ここでは、遺伝的に活性化されたアルカリホスファターゼ(AP)染色を使用して、NMDA誘発性興奮毒性下でのマウス網膜ニューロンの解剖学的特徴と表現型を調査します29,30,31。この方法を選択する理論的根拠は、その単純さ、費用対効果、および網膜全体にわたるニューロンサブタイプの解剖学的特徴の包括的な概要を取得できるため、肉眼的評価や大規模な比較分析に適しているためです。このアプローチは、遺伝的にマークされた異なる網膜ニューロンが肉眼的レベルと細胞内レベルの両方でNMDAにどのように反応するかについての新しい洞察を提供します。この戦略は、ニューロン構造とシナプス組織に影響を与えるさまざまな疾患モデルの形態学的変化を評価するために広く適用できると予想されます4,26,32,33。
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プロトコル
すべての動物処置は、実験動物の人道的ケアと使用に関する米国公衆衛生局の方針に従い、ヒューストンのテキサス大学マクガバン医学部の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。溶液の組成は 、材料表に記載されています。
1.タモキシフェンの注射
- 30 mgのタモキシフェンと30 μLのエタノールを混合します。沸騰したお湯に、ヒマワリ種子油1mLとタモキシフェン/エタノール混合物を加熱します。
- タモキシフェンがエタノールに溶解したら、加熱したヒマワリ種子油1mLをタモキシフェン溶液にすばやく加えます。ピペッティングでよく混ぜます。
- 2〜6か月のさまざまな年齢の男女のマウスを使用しました。タモキシフェン溶液を100μg/g体重の用量でインスリン注射器を使用して腹腔内に注射します。マウスラインに基づいてタモキシフェン注射の回数を決定します。このプロトコルでは、タモキシフェンを 1 日 1 回、4 日間連続して投与しました。
注:タモキシフェン溶液は高密度のオイルと混合されているため、取り外し可能な針を備えた注射器での取り扱いは困難です。したがって、タモキシフェン注射には、針が取り付けられたインスリン注射器が好ましい。 - マウスを5匹以下のグループで個別に換気されたケージに入れます。NMDA注射まで。
2. マウスの眼へのNMDA溶液の注入
- 滅菌1x PBS中に20 mMのNMDA溶液を調製します。100%エタノールを使用して取り付けられた35G針でナノインジェクターを20倍洗浄し、滅菌超純水でさらに20倍洗浄します。ナノインジェクターに1 μLのNMDA溶液を充填します。
- 1X PBS(体重あたり80/10 mg)溶液混合物にケタミン/キシラジンを腹腔内注射することにより、マウスを麻酔します。尻尾とつま先をつまむことに対する反射的離脱反応によって無意識を評価します。
- 麻酔をかけたマウスを実体顕微鏡に置きます。マウスを右目を上に向けて、鼻を右側に向けて配置します。局所麻酔のために、0.5%プロパラカイン塩酸塩溶液を右眼球に一滴塗布します。
- 滅菌30G注射針を使用して、7時位置の輪部に穴を開け、小さな穴を開けます。実体顕微鏡下で針の位置と方向を監視します。挿入しやすいように、注射針のサイズがナノ注射針よりわずかに大きいことを確認してください。
- 注射針を眼球から慎重に取り外し、適切に廃棄してください。実体顕微鏡を誘導に使用し、ナノ注射針を輪部を通して硝子体に45°の角度で挿入します。
- 1 μLのNMDA溶液を硝子体にゆっくりと注入します。注射後、注入液の流出を防ぐために、ナノ注射針を硝子体内に約10秒間保持します。
- ナノ注射針を慎重にゆっくりと目から引き抜きます。0.5%エリスロマイシン点眼軟膏を注射した眼の角膜に塗布します。
- マウスを加熱パッドの上のケージに入れます。マウスが麻酔から完全に回復するまで、15分ごとにマウスを監視します。組織採取まで1〜2週間マウスを収容します。
3. 組織採取とアルカリホスファターゼ(AP)染色
- CO2窒息でマウスを安楽死させ、続いて子宮頸部脱臼を行います。眼球と視神経に接続している筋肉をヴァンナハサミで慎重に切ります。
- 次に、眼球を鉗子で拾い上げ、別々の標識された2.0mLチューブに移しました。
- 眼球を10%中性緩衝ホルマリンに室温で10分間固定します。以下に説明するように、網膜を硝酸セルロース膜フィルターにフラットマウントします。
- 眼球を1x PBSを含む10 cmのペトリ皿に移します。鉗子を使用して眼球に付着した筋肉組織を持ちます。30Gの注射針を使用して輪部に穴を開けます。の先端を穴に挿入します ヴァンナハサミ オラセラタの周りを切ります。鉗子を使用してアイカップからレンズを取り外します。
- アイカップに3〜4個の切り込みを入れ、鉗子を使用してRPEを保持し、網膜からRPEをそっと取り除きます。
- 硝酸セルロース膜フィルターの小片を切り取り、1x PBSに浸します。分離された網膜をフィルターの上に置きます。細い絵筆の先端で網膜の周辺領域をそっと押して、網膜の端をフィルターに取り付けます。
- フィルターの端を持ち、1x PBSからゆっくりと引き出し、網膜が付着したままフィルターに平らになるようにします。網膜/フィルターをペーパータオルの上に1分間置き、取り付けられた網膜をフィルターに固定します。
- 網膜/フィルターを1x PBSを含むシャーレに戻します。鉗子や細い絵筆を使用して、網膜から破片、髪の毛、硝子体をできるだけ慎重に取り除きます。注入された網膜と注射されていない網膜を区別するには、フィルターをさまざまな形状にトリミングします。
- 網膜/フィルターをペトリ皿に戻します。網膜を10%中性緩衝ホルマリンに室温で5分間固定し、穏やかに攪拌します。
- 65°Cのウォーターバスを準備します。50 mLのガラスビーカーで30 mLの1x PBSを予熱します。網膜/フィルターを予熱した1x PBSに直接移します。網膜を65°Cで30分間インキュベートします。
注:熱処理は内因性AP活性を不活性化し、網膜にバックグラウンド染色を引き起こします。この背景を効果的に除去するには、加熱した溶液で網膜を処理することが重要です。 - 熱処理後、網膜をAPバッファー(100 mM Tris、pH 9.5、100 mM NaCl、50 mM MgCl2)を含む30 mmペトリ皿に移します。
- 網膜をAPバッファー中で室温で5分間、穏やかに攪拌しながらインキュベートします。
注:このステップでは、網膜内のバッファーを1x PBSからAPバッファーに交換し、発色中の化学沈殿を防ぎます。 - APバッファーを染色液(10 mLのAPバッファーに30 μLの10 mg/mL BCIPおよび60 μLの10 mg/mL NBP)に置き換えます。
- シャーレを遮光箱に入れます。AP染色の強度がイメージングに満足のいくものになるまで、穏やかに撹拌しながら室温で1〜2日間AP反応を展開します。
- 網膜を1x PBSで室温で5分間、2回洗浄し、穏やかに攪拌して反応を停止します。
- 網膜に10%中性緩衝ホルマリンを室温で10分間、穏やかに撹拌します。
- 網膜を1x PBSで室温で5分間、3回、穏やかに撹拌しながら洗浄します。網膜を30%エタノールでインキュベートし、続いて50%エタノールを室温で30分間穏やかに攪拌して脱水します。
- 細い絵筆を使用して、濾紙から網膜をそっと取り除きます。フィルターフリーの網膜を70%エタノールで30分間脱水し、続いて室温で100%エタノール中で穏やかに攪拌しながら30分間インキュベーションを2回行います。
- ガラス製ペトリ皿で、ベンジン酸ベンジル/ベンジルアルコール(2:1、v / v)透明化溶液で、室温で30分から2時間、穏やかに攪拌しながら網膜を透明化します。
注:長時間のインキュベーションはAP染色の喪失につながることが多いため、このクリアリング手順は一晩で実行しないでください。透明化溶液はプラスチックを溶かす可能性があるため、手順はガラス容器で行う必要があります。 - 網膜をスライドガラスに取り付けるには、スライドに両面テープを貼り付けて、カバーガラスと網膜用のプラットフォームを作成します。網膜をスライドの上に置き、クリアリング溶液でスペースを満たし、カバーガラスを塗布し、スライドをマニキュアで密封して網膜とカバーガラスを固定します。
- AP染色網膜をZeiss Apotome顕微鏡を使用して画像化します。
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結果
硝子体へのNMDAの適用はRGC死を誘発しますが、これは従来、RGCマーカーによる組織学的染色または免疫蛍光(IF)染色を使用して検出されてきました。私たちの実験設定では、汎RGCマーカーRBPMSを用いた従来のIF戦略を使用することにより、NMDA注入の1週間後にRGCの数が約65%減少することを確認しました(図2E-G)。以前の研究では、Tbr2 を発現する RGC が実際に ipRGC であることが発見されています34,35。Tbr2CreER2 での AP 染色の使用。RosaiAP網膜では、少数のTbr2発現RGCのみが生き残ったのに対し、Tbr2発現RGCおよびACの大部分は注射後1週間で消失したことを観察しました(図2A、Bを比較)
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ディスカッション
この研究では、遺伝的に指示されたスパースAP標識システムを多数の遺伝子操作されたマウス系統と組み合わせて利用して、さまざまなRGCおよびACサブタイプにおけるNMDA誘発性変性イベントを調べ、いくつかの特徴的な表現型を明らかにしました29、31、39。最も顕著な表現型は、NMDA注入網膜におけるRGCおよびACの有意な減少であり(図2A-D)、細胞型特異的レポーターラインまたは汎RGCマーカーによるIF染色のいずれかを使用した以前の研究での観察と一致しています(図2E-F)。Tbr2を発現するRGCは本質的にipRGCである34,35,40であることを以...
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開示事項
著者らは、競合する利益はないと宣言している。
謝辞
この研究は、国立衛生研究所-国立眼科研究所から C.A.M. (EY024376) への助成金と、一部は国立眼科研究所ビジョン コア助成金 P30EY028102 (UTHealth) によって支援されました。また、スティーブン・ラッシャー基金(UTHealth)とレイ・ホワイト基金(UTHealth)からの財政的支援にも感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.5%エリスロマイシン点眼軟膏 | バウシュ+ロンブ | 24208-910-55 | |
| 0.5%プロパラカイン塩酸塩 | バウシュ+ロンブ | 24208-730-06 | |
| 10%中性緩衝ホルマリン&nBSP; | VWRの | 89370-094 | |
| 10cmのペトリディッシュ | コーニング | 430167 | |
| 10 倍の PBS | フィッシャーサイエンティフィック | BP399 | 水で希釈して1x PBSとオートクレーブを作成します。 |
| 2.0mlチューブ | VWRの | 525-1136 | |
| 30ゲージ注射針 | エクセリントインターナショナル | 26437 | |
| 30 mm ペトリディッシュ | 隼 | 35208 | |
| ベンジルアルコホル | アクロスオーガニック | 447000010 | |
| ベンジルベンゼート | アクロスオーガニック | 105860010 | |
| 硝酸セルロース膜フィルター | サイトバ | 7188-002 | |
| カバー伝票 | 電子顕微鏡科学 | 72204-01 | |
| 両面テープ | スコッチ | 597020 | |
| エタノール | デコンラボ | 2716 | AP染色後の脱水にはFisher Bioreagents(Cat#:BP2818)を使用しないでください。この試薬は網膜を歪めます。 |
| 鉗子 | テッド・ペラ | 505 | |
| 加熱パッド | セラサーム | 710298-001 | |
| インスリン注射器 | BDの | 329424 | |
| ケタミン | デクラ | 17033010110 | |
| 顕微鏡 | ツァイス | アクシオイメージャー2 | |
| ネールポリッシュ | 電子顕微鏡科学 | 72180 | |
| ナノフィルインジェクター | 世界の精密機器 | ナノフィル | |
| ナノフィル針 | 世界の精密機器 | NF25BLシリーズ | |
| NBT/BICP試薬キット | インビトロゲン | N6547 | |
| NMDAの | シグマ・アルドリッチ | M3262 | |
| ペイントブラシ | キングアート | 6650 | |
| スライドガラス | フィッシャーサイエンティフィック | 12-550-15 | |
| 実体顕微鏡 | モティック | DM143 | |
| ヒマワリ種子油 | シグマ・アルドリッチ | S5007 | |
| タモキシフェン | シグマ・アルドリッチ | T5648 | タモキシフェン溶液を4°Cで保管します。Cは遮光箱に入っています。タモキシフェン溶液を1週間以内に使用してください。 |
| ヴァンナハサミ | ファインサイエンスツール | 15000-00 | |
| ウォーターバス | ラボライン | 18052 | |
| キシラジン | デクラ | 17033-0099-05 | 製品名:ロンプン |
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