ここでは、NMDA誘発性興奮毒性下でのマウス網膜の解剖学的特徴と表現型を調査するための遺伝的指向アルカリホスファターゼ(AP)標識法の使用について説明します。いくつかの網膜神経節細胞(RGC)サブタイプ特異的レポーター株と組み合わせて、変性プロセス全体を通じて死にかけているRGCの新しい表現型を明らかにします。
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この記事について
サマリー
要約
網膜神経節細胞 (RGC) は網膜の出力ニューロンであり、視覚情報を脳に伝達する役割を果たします。成熟マウス網膜では、ゲノム、形態学的、機能的特徴に基づいて、40以上のRGCタイプが同定されています。RGC 変性は、緑内障や外傷性視神経障害など、さまざまな衰弱性網膜疾患の特徴です。RGC の変性、生存、さまざまな疾患状態にわたる回復力の根底にある細胞および分子メカニズムについてより深い洞察を得ることは、効果的な治療介入を開発するために非常に重要です。RGC変性を調査するために、RGCの形態と中心投起のための網膜発達研究で以前に使用されていたシンプルかつ強力な技術を採用しました。ここでは、この方法を適用して、NMDA誘発性興奮毒性下でのRGCの解剖学的表現型を評価します。このアプローチにより、多数の変性 RGC を経時的に視覚化できるため、変性イベントのシーケンスをマッピングし、死にかけている RGC の特徴的な表現型を特定し、NMDA 誘発性損傷に耐性のある RGC を区別することができます。
概要
外傷性脳損傷 (TBI) は、脳に神経損傷を引き起こす突然の損傷です。自動車事故やスポーツ衝突、爆発による爆風による損傷など、重度の外傷性脳損傷では、機械的な力が細胞構造を破壊し、炎症、酸化ストレス、興奮毒性を引き起こし、最終的には神経細胞死を引き起こす可能性があります1,2。
中枢神経系 (CNS) の最もアクセスしやすい部分である網膜は、興奮毒性の根底にある分子メカニズムを研究し、治療介入の戦略を開発するためのモデル TBI システムとして機能してきました 3,4,5。外傷性脳損傷研究に最も適切な網膜モデルは、視神経クラッシュモデルと網膜のN-メチル-D-アスパラギン酸(NMDA)誘発性興奮毒性です。NMDA誘発性興奮毒性網膜モデルでは、RGCが主要な興奮性神経伝達物質としてグルタミン酸を利用し、AMPA受容体(AMPAR)、KAPA受容体(KAPAR)、NMDA受容体などのさまざまな種類のグルタミン酸受容体を利用して軸索電位を誘発するため、網膜神経節細胞(....
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プロトコル
すべての動物処置は、実験動物の人道的ケアと使用に関する米国公衆衛生局の方針に従い、ヒューストンのテキサス大学マクガバン医学部の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。溶液の組成は 、材料表に記載されています。
1.タモキシフェンの注射
- 30 mgのタモキシフェンと30 μLのエタノールを混合します。沸騰したお湯に、ヒマワリ種子油1mLとタモキシフェン/エタノール混合物を加熱します。
- タモキシフェンがエタノールに溶解したら、加熱したヒマワリ種子油1mLをタモキシフェン溶液にすばやく加えます。ピペッティングでよく混ぜます。
- 2〜6か月のさまざまな年齢の男女のマウスを使用しました。タモキシフェン溶液を100μg/g体重の用量でインスリン注射器を使用して腹腔内に注射します。マウスラインに基づいてタモキシフェン注射の回数を決定します。このプロトコルでは、タモキシフェンを 1 日 1 回、4 日間連続して投与しました。
注:タモキシフェン溶液は高密度のオイルと混合されているため、取り外し可能な針を備えた注射器での取り扱いは困難です。したがって、タモキシフェン注射には、針が取り付けられたインスリン注射器が好ましい。 - マウスを5匹以下のグループで個別に換気さ....
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結果
硝子体へのNMDAの適用はRGC死を誘発しますが、これは従来、RGCマーカーによる組織学的染色または免疫蛍光(IF)染色を使用して検出されてきました。私たちの実験設定では、汎RGCマーカーRBPMSを用いた従来のIF戦略を使用することにより、NMDA注入の1週間後にRGCの数が約65%減少することを確認しました(図2E-G)。以前の研究では、Tbr2 を発現する RGC が実際に ipRGC であることが発見されています34,35。Tbr2CreER2 での AP 染色の使用。RosaiAP網膜では、少数のTbr2発現RGCのみが生き残ったのに対し、Tbr2発現RGCおよびACの大部分は注射後1週間で消失したことを観察しました(図2A、Bを比較)
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ディスカッション
この研究では、遺伝的に指示されたスパースAP標識システムを多数の遺伝子操作されたマウス系統と組み合わせて利用して、さまざまなRGCおよびACサブタイプにおけるNMDA誘発性変性イベントを調べ、いくつかの特徴的な表現型を明らかにしました29、31、39。最も顕著な表現型は、NMDA注入網膜におけるRGCおよびACの有意な減少であり(図2A-D)、細胞型特異的レポーターラインまたは汎RGCマーカーによるIF染色のいずれかを使用した以前の研究での観察と一致しています(図2E-F)。Tbr2を発現するRGCは本質的にipRGCである34,35,40であることを以.......
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開示事項
著者らは、競合する利益はないと宣言している。
謝辞
この研究は、国立衛生研究所-国立眼科研究所から C.A.M. (EY024376) への助成金と、一部は国立眼科研究所ビジョン コア助成金 P30EY028102 (UTHealth) によって支援されました。また、スティーブン・ラッシャー基金(UTHealth)とレイ・ホワイト基金(UTHealth)からの財政的支援にも感謝します。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.5%エリスロマイシン点眼軟膏 | バウシュ+ロンブ | 24208-910-55 | |
| 0.5%プロパラカイン塩酸塩 | バウシュ+ロンブ | 24208-730-06 | |
| 10%中性緩衝ホルマリン&nBSP; | VWRの | 89370-094 | |
| 10cmのペトリディッシュ | コーニング | 430167 | |
| 10 倍の PBS | フィッシャーサイエンティフィック | BP399 | 水で希釈して1x PBSとオートクレーブを作成します。 |
| 2.0mlチューブ | VWRの | 525-1136 | |
| 30ゲージ注射針 | エクセリントインターナショナル | 26437 | |
| 30 mm ペトリディッシュ | 隼 | 35208 | |
| ベンジルアルコホル | アクロスオーガニック | 447000010 | |
| ベンジルベンゼート | アクロスオーガニック | 105860010 | |
| 硝酸セルロース膜フィルター | サイトバ | 7188-002 | |
| カバー伝票 | 電子顕微鏡科学 | 72204-01 | |
| 両面テープ | スコッチ | 597020 | |
| エタノール | デコンラボ | 2716 | AP染色後の脱水にはFisher Bioreagents(Cat#:BP2818)を使用しないでください。この試薬は網膜を歪めます。 |
| 鉗子 | テッド・ペラ | 505 | |
| 加熱パッド | セラサーム | 710298-001 | |
| インスリン注射器 | BDの | 329424 | |
| ケタミン | デクラ | 17033010110 | |
| 顕微鏡 | ツァイス | アクシオイメージャー2 | |
| ネールポリッシュ | 電子顕微鏡科学 | 72180 | |
| ナノフィルインジェクター | 世界の精密機器 | ナノフィル | |
| ナノフィル針 | 世界の精密機器 | NF25BLシリーズ | |
| NBT/BICP試薬キット | インビトロゲン | N6547 | |
| NMDAの | シグマ・アルドリッチ | M3262 | |
| ペイントブラシ | キングアート | 6650 | |
| スライドガラス | フィッシャーサイエンティフィック | 12-550-15 | |
| 実体顕微鏡 | モティック | DM143 | |
| ヒマワリ種子油 | シグマ・アルドリッチ | S5007 | |
| タモキシフェン | シグマ・アルドリッチ | T5648 | タモキシフェン溶液を4°Cで保管します。Cは遮光箱に入っています。タモキシフェン溶液を1週間以内に使用してください。 |
| ヴァンナハサミ | ファインサイエンスツール | 15000-00 | |
| ウォーターバス | ラボライン | 18052 | |
| キシラジン | デクラ | 17033-0099-05 | 製品名:ロンプン |
参考文献
- Blennow, K., et al. Traumatic brain injuries. Nat Rev Dis Primers. 2, 16084(2016).
- Zetterberg, H., Blennow, K. Fluid biomarkers for mild traumatic brain injury and related conditions. Nat Rev Neurol. 12 (10), 563-574 (2016).
- Mohan, K., Kecova, H., Hernandez-Merino,....
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