過分極 13C NMRを用いた生細胞のリアルタイム代謝検出

サマリー

このプロトコルは、カスタムメイドのバイオリアクターシステムと過分極¹³C NMR分光法を統合して、生細胞内のピルビン酸代謝をリアルタイムで測定し、代謝研究や薬物スクリーニングアプリケーションの再現性と速度論的精度を向上させます。

要約

このプロトコルは、自社製のバイオリアクターシステムと過分極 ¹³°C核磁気共鳴(NMR)分光法を統合して、生細胞のピルビン酸代謝をリアルタイムで測定する方法を提示します。このプロトコールは、安定した細胞培養環境を維持しながら、過分極基質注入とNMRシグナル取得の正確なタイミングを可能にするバイオリアクターシステムの構築を概説しています。この方法は、プロセス全体で十分な信号対雑音比を維持しながら、60秒の測定ウィンドウ内でピルビン酸から乳酸への代謝変換を確実に検出します。このシステムの in situ ミキシング機能により、NMRシグナルの検出が加速され、T₁の緩和損失が減少します。このプロトコルには、細胞をカプセル化してバイオリアクター内に配置するためのアルギン酸ゲルの調製に関する詳細な指示も含まれています。提案法は、従来法に比べて再現性と動態精度が向上しており、がん代謝研究や薬物スクリーニングへの応用が期待されています。代替ゲルマトリックスの採用など、システムのさらなる改良により、さまざまな生物学的研究におけるその汎用性が向上する可能性があります。

概要

過分極NMRは、特に動的核分極(DNP)により、NMRのシグナル強度¹を大幅に増強し、感度を大幅に向上させて代謝変化のリアルタイム追跡を可能にします^2,3。この技術は、酵母^4,5、がん細胞モデル^6,7,8、微生物^9,10など、さまざまな生物学的システムに適用され、成功を収めています。また、解糖^系11,12、酸化還元ホメオスタシス^13,14、pH調節^15,16などの主要な代謝経路のモニタリングにも使用されています。基礎研究を超えて、過分極NMRは現在、MRIによる臨床画像に利用されており、細胞スケールから全身スケールまでの代謝評価を可能にしています¹⁷。これらの開発は、多様な生物学的状況での超分極NMRの広範な使用を促進するアクセス可能なプロトコルに対する需要が高まっていることを強調しています。

その汎用性にもかかわらず、過分極NMRを使用して生細胞のリアルタイム代謝測定を実施することは、技術的に依然として困難です。従来のシステムは、再現性に欠け、^{広範な専門知識}8,18,19,20なしでは操作が困難な、複雑でラボ固有のセットアップに依存することがよくあります。これは、この技術を生物学研究やトランスレーショナル研究に採用しようとする研究者にとって大きな障壁となっています。光学イメージングや質量分析などの代替方法と比較して、過偏光^13CNMRは、破壊的なサンプリングを行わずに、特定の代謝反応を非侵襲的に時間分解してモニタリングすることができます。時間的な精度で直接的な生化学情報を提供するため、細胞代謝の動的研究に適しています。

これらの制限に対処するために、この研究では、研究者が最小限の技術的ハードルで生細胞代謝の過分極NMR測定を実行できるように特別に設計された実用的で再現性のあるプロトコルを提示します。生細胞におけるピルビン酸代謝の基本的な測定について、包括的な方法が説明されています。このプロトコルは他の ¹³C標識プローブに適用することができますが、ピルビン酸は、その急速な細胞取り込み、十分に特徴付けられた代謝経路、および細胞代謝におけるその中心的な役割のために特に適しています。この手順は、(i)細胞サンプルの調製、(ii)アルギン酸ゲルへのカプセル化、(iii)DNP偏光子を使用した超分極、および(iv)400MHz分光器でのリアルタイムの ¹³C NMR測定で構成されます(図1)。さらに、バイオリアクターシステムを構築するための主要なパラメータが提供されており、標準的なNMRハードウェアとの再現性と互換性を確保しています。このプロトコルは、市販のコンポーネントを使用して簡単に実装できるように最適化されており、研究者、特にこの技術に不慣れな研究者が実験ニーズへの適合性を判断するのに役立つことを目的としています。

プロトコル

1. バイオリアクターのセットアップ(図2A-B)

1. NMRチューブの組み立て
   1. チューブ挿入には、スクリューキャップ付きNMRチューブ(直径10mm、長さ178mm)とオープントップキャップをご使用ください。
   2. シリコン/PTFEバイアルセプタム(直径9 mm)を準備し、それを通してPEEKチューブを挿入してしっかりと密封します(補足図1)。
   3. 耐薬品性PEEKチューブ(内径1.0mm、外径1.6mm、壁厚0.3mm、長さ1m)を改造したキャップの開口部に挿入します。
   4. NMRチューブとオープントップキャップの間にセプタムを置き、キャップをしっかりと閉めて固定します。このセットアップにより、セプタムが所定の位置に保持され、灌流または注入中の漏れを防ぐのに十分なシールが提供されます。
2. ミディアムデリバリーチューブのセットアップ(図2C)
   1. PEEKチューブをNMRチューブの入口ポートと出口ポートに接続すると、連続灌流が可能になります。漏れを防ぐために、フランジレスフィッティングセットを使用して接続を固定します。
3. 中温暖化コンポーネントの取り付け
   1. PEEKチューブを約0.2 mL/minの安定した流量に調整可能なペリスタルティックポンプに接続し、外部循環キットを介して連続的な培地循環を確保します。温度を維持するために、中型リザーバーを37°Cに設定されたウォーターバスに入れます。
4. ゲル漏れ防止成分の添加
   1. NMRチューブの直径に合うように高密度のスポンジをカットします。スポンジをチューブの底に挿入して、アルギン酸ゲルの漏れを防ぎ、中程度の流れを確保します。
5. 3Dプリントされたスポンジ固定部品の製作と挿入(図2D-F)
   1. 立体造形3Dプリントに対応したフォトポリマー樹脂を用いて、円筒形ホルダー(外径9.1mm、長さ20mm、中央穴径1.5mm)を3Dプリントします。設計仕様は、添付の 補足ファイル1に記載されています。
   2. ホウケイ酸ガラスキャピラリー(外径1.5mm、内径約0.9mm、長さ90mm)を3Dプリントホルダーの予め形成された穴に挿入します。
   3. スポンジをホルダーのプラットフォームに取り付け、耐水性のあるUV硬化性樹脂を使用します。UV光下で30秒間硬化させ、固化を確保します。
   4. 組み立てたホルダーをスポンジでNMRチューブに挿入します。

2. 細胞調製(測定の2週間前から開始)

1. 凍結した細胞ストック(SCCVIIまたはHeLa)を37°Cの水浴で急速に解凍します。約10×10⁶細胞を、10%(v / v)ウシ胎児血清と1%(v / v)ペニシリン-ストレプトマイシンを添加した10 mL RPMI-1640培地に移します。.
2. 細胞を5%_CO2で37°Cで培養し、70%〜80%のコンフルエントに達したら2〜3日ごとに継代します。約 2 週間培養を続けると、10 cm 皿 5 枚から約 90% のコンフルエントまで成長したと推定される ~4 x 10⁷ 個の細胞が得られます (各細胞は ~8 x 10⁶ 個の細胞が得られます)。

3.アルギン酸ゲル製剤

1. アルギン酸溶液の調製
   1. 生物学的研究グレードのアルギン酸ナトリウム粉末を脱イオン水に溶解して、2%(w / v)溶液を調製します。溶液を25°C以上で一晩インキュベートし、穏やかに攪拌します。約10〜20rpmにセットされたチューブローテーターを使用して、気泡を防ぎ、均一に溶解するようにします。
2. アルギン酸ゲルへの細胞のカプセル化
   1. 10cmの皿に0.25%(v / v)トリプシン-EDTAの2mLを追加します。.皿を傾けて表面全体を覆い、余分なトリプシン-EDTAを吸引します。
   2. ディッシュを37°Cで2分間インキュベートします。
   3. 皿に10mLの培地を加えます。ピペットでゆっくりと上下に動かして、細胞を取り外してください。細胞懸濁液全体を15 mLの円錐チューブに集めます。
   4. 懸濁液を約10μL取り、セルカウンターを使用して細胞数をカウントします。通常、その後の手順には約1×10⁷個のセルが必要ですが、実際の数は測定によって確認する必要があります。
   5. 残りの細胞懸濁液を120 × g で5分間遠心分離します。上清を取り除き、細胞ペレットを4 mLの2%(w / v)アルギン酸溶液に再懸濁します。気泡の発生を最小限に抑えるためにゆっくりとピペットで動かします。
3. カルシウム架橋によるゲル形成(図3)
   1. 50 mLの遠心チューブに10 mLの50 mM CaCl₂溶液を加えます(図3A)。
   2. 300 μLの細胞-アルギン酸混合物を、30 G、10 mm針を取り付けた0.5 mLシリンジに入れ、遠心チューブのキャップに固定します(図3B)。
   3. シリンジを固定した状態で遠心チューブのキャップをしっかりと閉め、アセンブリ全体を200 × gで5分間穏やかに遠心分離します。遠心分離後に上清溶液を除去し、細胞負荷ゲルを培地に再懸濁します(図3C-D)。
4. ゲルをNMRチューブに装填する
   1. 細胞内包ゲルをパスツールピペットを使用してNMRチューブに移します。スポンジ固定具を挿入し、しっかりと密閉します。
   2. ステップ1.3.2で調製した培地リザーバー(5%(v/v)_D2Oを含む)をウォーターバスで37°Cに予熱し、約500μL/hの速度で循環させて条件を安定させます。
   3. NMRチューブを磁石に挿入する前に、漏れがないことを確認してください。PEEKチューブをまっすぐにしたまま、NMRチューブを磁石に挿入します。ゲルサイズ、ビーズ数、ピペッティング速度は、細胞の種類や実験要件に応じて調整してください。

4. DNP偏光子を用いた過分極プローブの作製(図4)

1. サンプルバイアルの調製
   1. 25 mM OX063をドープした[^1-13C]ピルビン酸(14.2 M)18 μLをサンプルバイアルに加えます。バイアルをDNP偏光子システムの流体経路に接続します。
2. サンプルの分極
   1. バイアルをDNP偏光子のボアユニット(6.7 T、1.25 K、1.2 mbar)に挿入します。約188GHz(22mW)のマイクロ波を60〜80分間照射します。
3. 偏光時の信号監視
   1. DNPシステムに組み込まれている固体NMR分光計を使用して、 ¹³°Cの信号強度を監視します。NMRソフトウェア(SPINit)を使用して5分ごとに信号データを記録します。
4. 過分極溶液を溶解して調製します
   1. 分極したサンプルを3.2 mLの予熱溶解バッファー(40 mM Tris、50 mM NaCl、80 mM NaOH、100 mg/L EDTA)に迅速に溶解します。NMR測定に移す前に、溶液が生体温度(308-313 K、pH ~7)に達することを確認してください。
      注意: 高圧部品の取り扱いには注意してください。溶出バッファーを~461 Kに予熱して、効率的な移送とサンプルの完全性を確保します。

5. NMRのセットアップ

1. NMR分光計の作製
   1. サンプルをNMRチューブにロードし、分光計に挿入します。
   2. サンプルを挿入した自動手順を使用して、NMRコンソールでロック、チューニング、マッチング、シミングを行い、スペクトル分解能とシグナルの安定性を最適化します。
2. 取得パラメータの設定
   1. プロトンデカップリングを有効にした ^13Cパルス集録シーケンス(zg2dなど)をロードします(例:13-CPD)。
   2. 1μsのパルス(P1)を使用して、フリップ角度を90°に設定します。集録時間を 1.376 秒、スペクトル幅を 23,663 Hz、集録ポイント数 (TD) を 65,536 に設定します。緩和遅延(D1)を0秒に設定します。
   3. 時間増分数(TD1)を150に設定すると、擬似2Dモードで150個の連続スペクトルを取得できます。レシーバーのゲインを低い値(~1など)に調整して、過分極サンプルからの信号の飽和を回避します。
      注:過分極NMRは信号強度が高いため、レシーバーのゲインを低い値(例:~1)に設定してください。これは通常、利用可能な最大ゲインの1%未満に相当します。レシーバー・ゲインは、信号の増幅を制御するユニットレスの内部パラメータです。値が大きすぎると、信号が飽和する可能性があります。

6. NMR測定

1. 測定の準備
   1. インレットチューブからNMRチューブまでのインレットチューブ経路全体に溶解バッファーを充填し、空気の巻き込みを防ぎます(図2B)。インレットチューブは、中灌流と過分極プローブの両方の注入に使用されます。
   2. インレットチューブ内やNMRチューブ内部に気泡が存在しないことを慎重に確認してください。この領域の気泡は、NMR測定中のシグナル取得を妨げる可能性があります。
2. 過分極溶液の注射用調製
   1. 蠕動ポンプを停止して、インレットチューブから過分極溶液を注入する前に、媒体の循環を一時的に停止します。
   2. 超分極した基質を溶解する約10秒前にスペクトル取得を開始し、注入後にNMR検出部位に到着した直後にシグナルが捕捉されるようにします。
   3. 溶液がDNP偏光子から出たら、シリンジで1mLの溶液を引き出します。
3. 過分極液の注入とシグナルの確認
   1. バイオリアクター入口の三方弁をポジションBに切り替えて、過分極溶液をNMRチューブに注入します。
   2. 注入後にバルブを位置Aに戻し、媒体の循環を再開し、逆流を防ぎます。
   3. 取り込みソフトウェアで自由誘導減衰(FID)シグナルの増加を観察することにより、注入と基板の到着が成功したことを確認します。

7. データ処理と分析

1. スペクトルデータの処理
   1. 時間分解NMRスペクトルをデータ処理ソフトウェアに読み込みます。データが ser ファイル形式で保存されている場合は、適切なファイルを見つけてロードします。
2. スペクトルの解析
   1. フーリエ変換 (FT) を実行して、生の FID を周波数領域に変換します。位相補正を手動または自動で適用します。ベースライン補正を実施して、歪みを除去します。
3. 代謝物変換の可視化
   1. ピルビン酸 C1 (~171 ppm) と乳酸 C1 (~183 ppm) の時間経過信号をプロットします。
4. 代謝変換の定量化
   1. ピルビン酸と乳酸のピークの曲線下面積(AUC)を計算します。
   2. 乳酸のAUCをピルビン酸のAUCで割ることにより、[乳酸]/[ピルビン酸]の比率を決定します。
      注:ピークハイトの代わりにAUCを使用して、大きな過分極[1-¹³C]ピルビン酸シグナルによって引き起こされるリンギングアーチファクトの影響を最小限に抑えます。AUC値は、各ピークの定義された積分範囲内の信号強度の単純な合計によって得られます。

結果

本研究では、作製したシステムを過分極 ^13CNMR分光法と組み合わせて、生細胞のピルビン酸代謝をリアルタイムで測定しました。1D ¹³C NMRスペクトルで検出された主なシグナルは、ピルビン酸(約171 ppm)と乳酸(約183 ppm)²¹に対応しており、生理学的条件下でのピルビン酸から乳酸への代謝変換を評価することができました(図4)。

スペクトル品質と信号ダイナミクス
SCCVII細胞(過分極MRI研究で頻繁に使用されるマウス扁平上皮がん系統)を使用して同じサンプルで繰り返し測定した代表的な結果を 図5に示します。最初の測定では、乳酸シグナルの明らかな増加が示され、活発な代謝変換が示されました。しかし、その後の1.5時間間隔での測定では、代謝活性が徐々に低下することが示されました。この時間依存的な減少は、最初のピルビン酸注射によって誘発された生物学的ストレスまたは適応を反映している可能性があります。.特に、過分極MRIおよびEPRIを用いて in vivo で同様の一過性代謝調節が報告されており、ピルビン酸投与後に腫瘍の酸素化が一時的に減少した²²。これらの結果は、これらの測定の再現性により、動的な代謝変化の非破壊的な追跡が可能になることを示しています。これは、破壊的な方法では達成するのが難しい利点です²³。

このプロトコルの他の細胞タイプへの適用性を評価するために、広く使用されているヒトがん細胞株であるHeLa細胞を使用して追加の測定を行いました。 図6に示すように、HeLa細胞はピルビン酸から乳酸への変換も明確に示しました。T₁の緩和により信号強度は徐々に減少しましたが、信号対雑音比は60秒の捕捉期間を通じて十分なままでした。これらの知見は、現在のプロトコルが広く適用可能であり、さまざまな細胞タイプでリアルタイムの代謝プロファイリングを行うための汎用性の高いツールとして役立つことを示唆しています。

DNPベースのNMRには、急速な信号減衰が固有の制限となりますが、当社の in situ 混合システムは、溶解から測定までの遅延を最小限に抑え、検出感度を向上させます。ゲルマトリックス組成の最適化など、さらなる改良により、この方法の適用範囲が広範囲の生物学的システムに拡大する可能性があります。

図1:細胞培養から過分極NMR測定までの全体ワークフローの概略図。 このプロセスは、細胞培養(~2週間)から始まり、その後、アルギン酸ゲルの調製(~60分)を行い、細胞をカプセル化して安定して測定します。次に、DNP偏光子を用いて過分極を行い(~60分)、400MHzのNMR分光器を用いてNMR測定を行います(~5分)。右の写真は、このワークフローで使用される対応する機器を示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:過分極NMR測定のためのバイオリアクターのセットアップ。 (A)バイオリアクターのセットアップの概略図。培地はインレットAからNMRチューブに導入され、その後廃棄物に送られます。生細胞を含むアルギン酸ビーズをNMRチューブ内に入れます。過分極NMR測定中、過分極プローブは、過分極プローブインレットとラベル付けされたインレットBを介して注入されます。(B)バイオリアクターのセットアップ全体の写真で、入口と出口のチューブに明確なラベルが貼られています。(C)インレットチューブスイッチのクローズアップビュー、インレットA(中灌流)とインレットB(過分極プローブ注入)を示しています。(D)CAD設計、(E)NMRチューブ内に配置した3Dプリントスポンジ固定部品の代表写真。このコンポーネントには、過分極基板溶液を供給するガラスキャピラリーをガイドするための穴と、スポンジを保持するためのプラットフォームが含まれています。成分自体がNMRチューブの内壁にしっかりとフィットしていません。(F)代わりに、その隙間を埋めるためにスポンジを周囲に挿入します。この構造により、コンポーネントが安定し、廃材がスポンジを通って上向きに流れるため、追加の出口穴が不要になります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:アルギン酸ゲルの調製。 (A)アルギン酸ゲルボール形成装置の概略図と(B)写真。左の画像は、変更された蓋にシリンジが固定された遠心分離管を含むセットアップ全体を示しています。右上の画像はシリンジの先端に小さな穴が開いた蓋、右下の画像はシリンジを安定して位置決めするための四角い開口部のある蓋を示しています。遠心分離チューブには10 mLの塩化カルシウム溶液があらかじめ充填されており、シリンジチップから出るアルギン酸溶液がゲル化され、アルギン酸ゲルボールが形成されます。(C)アルギン酸ゲルボールの形態を示す代表的な顕微鏡画像。(D)HeLa細胞を含むアルギン酸ゲルボールの形態を示す代表的な顕微鏡画像。スケールバー = 200 μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:NMR測定と超分極の準備ステップの概略図。 ~60分間のDNP蓄積プロセスでは、遅延を最小限に抑えるためにNMRのセットアップが並行して行われます。調製には、アルギン酸ビーズをNMRチューブにロードし、 ^{その後、1}Hロック調整、シミング、およびプローブチューニングを行い、システムがすぐに測定できる状態であることを確認します。溶解後、 in situ 混合後、時間分解 ¹³C NMR分光法により、明確なピルビン酸と乳酸のピークが明らかになります。約171ppm、179ppm、183ppmで観測されたピークは、それぞれピルビン酸、ピルビン酸水和物、乳酸に対応しています。NMR測定には、アルギン酸ゲルにカプセル化された約4×10個の^7HeLa細胞を使用しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:繰り返し測定におけるピルビン酸および乳酸シグナルの時間分解検出。 同じSCCVII細胞内包サンプルの過分極 ¹³C NMRスペクトルを1.5時間間隔で取得し、非破壊測定の繰り返しの実現可能性を評価しました。ピルビン酸(白丸)と乳酸(塗りつぶされた円、1000×でスケーリング)のピーク強度は、各取り込みについて経時的にプロットされます。(A)最初の測定。(B)1.5時間後の2回目の測定では、乳酸産生の著しい減少が明らかになりました。(C)さらに1.5時間後の3回目の測定では、持続的な低代謝活性が確認されました。曲線下面積(AUC)に基づく定量解析では、[乳酸]/[ピルビン酸]比が0.00134(1回目測定)から0.00019(2回目)、0.00027(3回目)に減少しました。アルギン酸ゲル中の最終細胞濃度は、約1.0 × 10⁷細胞/mL(4 mL中4 × 10⁷細胞)でした。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6: HeLa細胞におけるピルビン酸から乳酸への変換。 ピルビン酸と乳酸の時間分解過分極 ^13CNMRシグナルを生HeLa細胞で測定しました。ピルビン酸信号強度は、時間ゼロで最大値に正規化されます。乳酸シグナル強度は、視認性のために 10:³ の係数でスケーリングされます。曲線下面積(AUC)に基づく定量分析では、[乳酸]/[ピルビン酸]比は0.00121でした。アルギン酸ゲル中の最終細胞濃度は、約7.5 × 10⁶細胞/mL(4 mL中3×10⁷ 細胞)でした。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足図1.バイオリアクターシステムで使用されるバイアルセプタムの代表的な画像。 (A)使用前にシリコーン/ PTFEセプタム(直径9mm)。(B)実際の使用と同じセプタムで、穴の開いた穴からPEEKチューブが挿入されています。セプタム材料の弾力性により、チューブの周囲を再シールし、過分極基板注入時に気密状態を維持することができます。 この図をダウンロードするには、ここをクリックしてください

補足図2:外部混合後に取得した時間分解過分極 ¹³C NMRスペクトル。 過分極したピルビン酸とNMRチューブ外の細胞との外部混合後にベンチトップNMRシステムを使用して測定した[^1-13C]ピルビン酸代謝の代表的な時間分解スペクトル。 この図をダウンロードするには、ここをクリックしてください

補足ファイル1:円筒形ホルダーのCAD設計。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください

ディスカッション

プロトコルの重要なステップ
このプロトコルの成功は、いくつかの重要なステップにかかっています。まず、過分極した ¹³Cピルビン酸の適切な溶解と移動を確保して、高い信号対雑音比を維持することが重要です。ピルビン酸から乳酸への早期代謝変換を捕捉するには、過分極プローブの注入タイミングとNMR取得のタイミングを同期させる必要があります。さらに、実験全体を通じて細胞の生存率を維持することも重要です。これらのパラメータからの逸脱は、代謝活性の低下とシグナルの喪失につながる可能性があります。

メソッドの変更とトラブルシューティング
このプロトコルは、リアルタイムの代謝モニタリングのための堅牢なアプローチを提供しますが、特定の変更によりその適用性が向上する可能性があります。例えば、NMR取得の反転角度を調整することで、信号強度と分極減衰のバランスを取り、データ収集を最適化することができます。また、ある程度の大きさのアルギン酸ゲルを安定して調製する方法も導入されましたが、作製するゲルのサイズはシリンジや針を選択することで簡単に調整できます。これは、細胞がNMRチューブから逃げるのを防ぐだけでなく、低酸素環境²⁴ の再現にも貢献し得る。さらに、アルギン酸ゲルはNMRチューブ内、特にNMR測定領域で緻密で粘性になります。PEEKチューブから培地や過分極プローブを注入する際に空気が入り込むと、NMR測定部位に空気が残りやすく、スペクトルの品質低下につながります。

方法の制限
過分極測定には、NMR信号の感度が高いという利点がありますが、固有の制限があります。過分極した^13Cピルビン酸の_T1弛緩により、代謝測定の持続時間は約1分に制限され、長期的な代謝シフトの観察が制限されます。また、細胞サンプルを一度測定してから数時間後に測定することは困難であり、これは1回の測定で大量のピルビン酸が滴下されることに関連している可能性があります。これは、関連するグループが1日後にスペクトルを測定したという事実と同じです¹⁸、そして測定間隔はそれだけ長くする必要があります。

既存の技術と比較した方法の重要性
従来の代謝アッセイと比較して、私たちの方法は、質量分析や生化学アッセイなどのエンドポイント測定よりも、細胞代謝に関するリアルタイムの洞察を提供するという利点があります。バイオリアクターを使用せずに同様の超分極NMRスペクトルを取得できますが、緩和の速さを考えると、 in situ 混合ですぐに測定を開始できることは有益です。さらに、細胞を注入前に安定した環境にあらかじめセットすることができるため、代謝解析の再現性と速度論的精度が向上します。この利点は、外部混合後にベンチトップNMRシステムを使用して時間分解スペクトルを取得した補足実験(補足図2)によって裏付けられています。このセットアップでは、ミキシングとシグナル取得の間の約 30 秒の遅延により、大きな分極損失が発生し、特に乳酸の検出に影響を及ぼしました。このことから、 in situ 混合により、急速な_T1 崩壊を伴う条件下での速度論的測定の忠実度が向上することが確認されています。しかし、この in situ セットアップでのシグナル強度が低かったのは、おそらく中程度の灌流による希釈によるものと考えられており、これはまだ最適化されていない問題であることは注目に値します。

重要性と潜在的な応用
この方法は、多様な生命体の代謝特性を理解するための応用への道を開く可能性があります。代謝フラックスのリアルタイム測定により、研究者は代謝阻害剤の影響を動的に評価することができます。このアプローチを他の測定技術と統合することで、細胞内代謝解析の精度がさらに向上する可能性があります。

私たちは、破壊的でハイスループットなメタボロミクスを使用して候補経路を同定し、その後、過分極 ¹³C NMRを使用して生細胞の酵素機能とフラックスダイナミクスを評価するという実用的な実験ワークフローを想定しています。このアプローチにより、生理学的条件下での一過性代謝反応を直接検出することができますが、これは、通常、静的代謝物レベルを測定するか、外因性プローブを必要とするイムノアッセイや蛍光センサーを使用して達成するのが難しいことです。蛍光イメージングとイムノアッセイは、それぞれ空間的ローカリゼーションとハイスループットスクリーニングに不可欠ですが、過分極NMRは、反応速度を非破壊的に捉える補完的な機能的読み出しを提供します。この戦略は、細胞レベルでのメカニズムの洞察を促進するだけでなく、組織または生物スケールでの診断アプリケーションへの架け橋としても機能します。特に、機能的な代謝シフトをリアルタイムで捉える能力は、複雑な生体システムにおける代謝障害や治療応答の早期発見をサポートする可能性があります。

また、多様な代謝経路を標的とする代謝プローブや、特定の酵素用に設計された合成基質の開発も進んでおり、代謝研究の可能性が広がっている^25,26。さらに、超分極された基質を偏光子から直接NMRに磁気トンネル²⁷を介して送達するなどの超分極技術の進歩は、信号保持を改善し、生物医学研究におけるこの方法の潜在的な応用を拡大する可能性がある。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
[1-13C] ピルビン酸	ケンブリッジ・イソット・オペ・ラボラトリーズ社	CLM-8077
3Dプリンター	エレグー	サターン2
塩化カルシウム	ナカライテスク株式会社	06729-55
D2O	シグマ・アルドリッチ	151882
ポンプ用外部循環キット	一つとして	1-4141-02
ウシ胎児血清	ギブコ	10270106
フランジレスフィッティングセット	GLサイエンス株式会社	6010-46390
コア付きガラスキャピラリー	成重	GDC-1.5	内径~0.9mm、長さ90mm
磁気循環ポンプ	一つとして	1-4141-01
メストレノバ	メストレラボ研究		NMRスペクトル処理および分析ソフトウェア
マイショットシリンジ	ニプロ株式会社	8277	0.5 mL/100U、30G x 10 mm、140個
オックス063	オックスフォード・インストゥルメンツ株式会社 およびPolarize IVS Co.Ltd.	-
PEEKチューブ	一つとして	3-780-05
ペニシリン-ストレプトマイシン	ナカライテスク株式会社	26252-94
蠕動バイオミニポンプ	アト	1221200	高精度・広流量タイプで安定した媒体流量を実現
樹脂	シラヤテック	スモーキーブラック
RPMI-1640 ミディアム	ナカライテスク株式会社	30264-85
シリコン/PTFEバイアルセプタム	GLサイエンス株式会社	1030-50009
アルギン酸ナトリウム 80-120	富士フイルム和光ピュアケミカル株式会社	194-13321
SPINitソフトウェア	RS2D		DNP偏光子のNMRソフトウェア
スポンジ	-	-	市販のスポンジは、ゲル安定化のためにサイズにカットされています。
三方活栓	一つとして	3-6247-04
トップスピン	ブルカー		NMRデータ取得および処理ソフトウェア
トリプシン-EDTA(0.25%)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	07086-74
UV硬化型樹脂	ボンディック	BD-SKCJ
ウォーターバス	一つとして	1-5832-41	サーマルロボット TRシリーズ TR-1α37度を維持するため。C温度
ウィルマドスクリューキャップNMR管	シグマ	Z271977	周波数400MHz、直径10mm、長さ178mm。