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方法論記事

無関心症関連角膜疾患の研究のための患者特異的iPSC由来角膜オルガノイド

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DOI:

10.3791/68556

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2026年7月28日

 ,  ,  ,  , 
1Izmir Biomedicine and Genome Center, 2Izmir International Biomedicine and Genome Institute, Dokuz Eylül University, 3Department of Medical Biology and Genetics, Faculty of Medicine, Dokuz Eylül University

この記事について

サマリー

我々は、アニリジウム患者由来のiPSCから角膜オルガノイドを生成するプロトコルを記述し、角膜疾患を研究するための患者特有モデルを構築します。これらのオルガノイドは主要な構造的および機能的特徴を模倣し、病気のメカニズムの調査、治療法の検証、前方眼疾患に対する個別化再生アプローチの進展に信頼性のある in vitro プラットフォームを提供します。

要約

アニリジアは虹彩が部分的または完全に欠如する稀な先天性眼疾患であり、角膜の不透明化や辺縁幹細胞の欠損と関連していることが多いです。主にPAX6遺伝子に影響を与える基礎的な遺伝子変異は、角膜の発達と機能の両方を妨げます。虹彩欠損以外で最も一般的な眼の特徴は、眼振、中心蓋低形成、白内障、緑内障、無虹膜関連角球症(AAK)です。 in vivo モデルは無関心症の病理学に関する貴重な洞察を提供しますが、患者由来の in vitro モデルは疾患のメカニズムの調査や治療法の評価に不可欠です。本研究では、患者由来誘導多能性幹細胞(iPSC)を用いた in vitro AAKモデルを提示します。私たちのプロトコルは、自己組織化された三次元オルガノイド内でiPScsが角膜上皮細胞様細胞へ段階的に分化し、ネイティブの角膜微小環境を模倣することを含みます。分化培養条件の最適化により、異なる角膜細胞群を保持する角膜オルガノイドを成功裏に生成し、人間の角膜の主要な構造的および機能的特徴を再現しました。

概要

角膜は無血管で透明な組織で、目の最外層を形成しており、主に3層から成ります。上皮の外層、角膜細胞で満たされたコラーゲン豊富な細胞外マトリックスを含む間質層、そして内皮細胞層1です。角膜は内部の眼構造を保護し、光を屈折させることで視覚に不可欠な役割を果たします。

アニリジウムは、主に眼の発達を制御する主的因子である 対対ボックス遺伝子6 (PAX6)のヘテロ接合変異によって引き起こされるまれな先天性のパノキュア障害であり、虹彩2が部分的または完全に欠如することが特徴です。虹彩低形成や欠如に加え、ほとんどの患者は進行性の角膜異常を発症し、これを総称して無膜関連角膜症(AAK)と呼びます。これには上皮欠損、辺縁部幹細胞機能障害、間質変異、進行性角膜不透明化が含まれ、最終的には視覚障害に至ります。AAKはアニリッジ患者の約78%〜90%に影響を及ぼし、時間とともに重症度が増加します。我々は、患者由来の誘導多能性幹細胞(iPSCs)から角膜オルガノイドを生成し、病変関連の角膜変異を vitroでモデル化する詳細かつ再現可能なプロトコルを確立することを目指しました。動物モデルや 生外 研究はアニリジウムの病因に貴重な知見を提供していますが、種特異的な違いや患者組織へのアクセスの制限が、その翻訳的関連性を制限しています。

ヒトiPSC由来のオルガノイドは、ヒトの発達や疾患のモデル化において強力なin vitroシステムとして登場しています4,5。特に角膜オルガノイドは、空間的組織、生理的細胞-細胞間相互作用、微小環境の複雑さを欠く従来の二次元単層培養に比べて、自然な角膜構造により近い三次元組織様構造の生成を可能にします(層別上皮組織、間質-上皮相互作用、細胞外マトリックス堆積など)4,5.SEAMベースや眼前駆細胞駆動型など、いくつかの分化戦略がiPSCsから角膜様組織を生成することが報告されています。これらのアプローチは通常、眼系導入の初期段階を経て、その後、組織の進行的特化と異質な眼球前駆体集団からの選択を含みます。角膜オルガノイドの作製は、角膜組織に存在するさまざまな細胞タイプを研究する機会を提供します7,8。さらに、アニリジア患者のiPSC由来角膜オルガノイドは、疾患の遺伝的背景の研究を可能にし、アニリジアを研究するユニークな機会を提供します。

本プロトコルでは、野生型および無脂肪由来のiPSC系統の両方に、分化(DM)、網膜分化(RDM)、角膜分化培地(CDM)への連続曝露を含む、同一の多段階分化戦略が長期にわたる培養期間にわたり適用されます。重要な実験的ステップとして、接着培養から懸濁状態への移行があり、この過程で選択された角膜様領域を維持して上皮の自己組織化を促進します。

このアプローチは比較疾患モデルに適した角膜様上皮構造の再現性生成を支援しますが、神経支配や完全な辺縁ニッチ組織のような複雑な 生体内 特徴を完全に再現することはできません。これらはこの手法の適用可能性を評価する際に考慮すべきです。

この文脈で、無糖症に関連する PAX6 変異を持つ患者由来iPSCから角膜オルガノイドを生成する標準化されたプロトコルを記述します。重要なのは、分化戦略自体が野生型と無菌由来系統間で変更されていないことです。むしろ、疾患特異的な表現型は、均一な実験枠組みの中で患者特有の遺伝的背景から現れます。

全体として、この方法は角膜の発生および無虹膜に関連する疾患メカニズムの研究において堅牢かつ再現性の高いプラットフォームを提供し、将来の機構的およびトランスレーショナル研究の基盤となる可能性があります。

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プロトコル

すべての手続きは倫理委員会の指針に従って実施されました。この研究はヒト多能性幹細胞登録データベース(hPSCreg)に登録されており、倫理的承認はフランス高等・研究・イノベーション省(MESRI)の下で文書化されています。IE-2018-967)9。iPSCは、AAKIPSi001-A(AAK1)、AAKIPSi002-A(AAK2)、AAKIPSi003-A(AAK3)、およびWT(健康ドナーから)のコードで指定されています。さらに、ハゼッテペ大学の倫理委員会は、参照番号16969557-1213に示されるように、この研究の使用を承認しています。本研究で使用されたヒト細胞株は、取得時に国の規制当局の承認を必要としていました。承認は、著者の一人が関与したコンソーシアムの枠組みの下で与えられました。本稿はそのコンソーシアムプロジェクトに直接関係しているわけではありませんが、使用された生物学的材料はその倫理的枠組みのもとで取得・承認されています。したがって、この大学の承認は完全な規制透明性を確保するために適切に引用されました。このプロトコルで使用される材料、試薬、機器に関するすべての詳細は 材料表に記載されています。すべての実験手順は、無菌環境を維持するために層流キャビネット(BSL-2)内で実施されました。この仕組みにより、研究で使用されるすべての材料や機器が適切に滅菌され、汚染リスクを最小限に抑え、実験結果の完全性が保証されます。

1. ヒト誘導多能性幹細胞(hiPSC)由来の角膜オルガノイドの生成

  1. 無添加剤調整培地下での無糖症由来ヒト多能性幹細胞(AAK1、AAK2、AAK3)10の維持および初期培養
    1. 事前に以下の準備をしてください:6ウェルプレートの1ウェルに、0.1 mg/mL濃度の氷のように冷たい細胞外マトリックス(ECM)溶液1 mLをコーティングします。このコーティング手順はECMを固めるためではなく氷上で扱う必要があり、37°Cで最低30分間培養し、メーカーの指示に従って適切な基材準備を行わなければなりません。
    2. 1 x 106 hiPSC(WT、AAK1、AAK2、AAK3)の凍結保存アリコートを解凍します。凍結細胞を完全に解凍しないでください。代わりに、冷凍セルの懸濁液を解凍し、体積の約半分が凍結したままにします。
    3. 部分的に解凍された懸濁液を、室温(RT)で10μMのロー関連タンパク質キナーゼ(ROCK)阻害剤を含む1 mLの完全維持培地に直ちに移し、15 mLチューブ内に事前に分割しました。移送中はピペットを一切使わないでください。
    4. 300 x g で遠心分離機で5分間処理し、上清液を捨てます。
    5. その後、細胞を10μMのROCK阻害剤を含む1mLの完全維持培地に再懸浮させます。
    6. トリパンブルー排除で細胞密度を決定します。トリパンブルーによる生存性染色後、ヘモサイトメーターで細胞数を数えます。簡単に言えば、細胞懸濁液20μLを1:1と0.4%トリパンブルー20μLを混ぜ、さらにPBSを60μL加えることで、最終的に元の細胞懸濁液を1:5で希釈します。この混合物から10μLをヘモサイトメーターチャンバーに注入します。4つの大きな正方形で生存可能な(トリパンブルー陰性)細胞を数えます。1平方あたりの平均細胞数を計算し、5(細胞懸濁希釈係数)と10,000を掛けて最終的な細胞濃度(細胞/mL)を算出します。
      細胞数/mL = (平均細胞数/平方数)× 5 × 104
    7. セルを6ウェルプレートのあらかじめコーティングされたECMウェルにシーディングし、1ウェルあたり2 x 104 セル/cm² のセル密度を確保します。
    8. 10倍倍の位相差顕微鏡で細胞の形態と付着を観察してください。その後、6ウェルプレートを37°Cで5%のCO₂で培養し、最適な成長条件を確保します。
      注意:ROCK阻害剤は細胞の通過または解凍中に夜間のみ使用してください。毎日の培地交換の際には、井戸の壁に沿って優しく培地を加えます。完全なメンテナンス媒体を水浴で加熱するのは避けてください。代わりに、使用前に15分間室温で培地を平衡に保ちます。
  2. 自発分化期(0日目〜2日目)
    1. 分化媒体(DM)は以下の混合物で調製します:8%ノックアウト血清置換(KSR)、1x非必須アミノ酸(NEAA)、1xグルタマックス、1xペニシリン-ストレプトマイシン、そしてDulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12ハム(DMEM/F-12)。
    2. hiPSC培養が約70%–80%の合流に達し、自然分化を誘導するために培地8を優しく吸引し、完全に廃棄し、その後1日目まで1日目に1mLの新鮮DMを1日目まで交換し、実験スケジュールに従って網膜分化フェーズを開始します。
  3. 網膜分化期(3日目 – 47日目)
    注:網膜分化培地は、異質な眼の前駆細胞集団の形成を可能にするために長期間使用されます。
    1. 網膜分化培地(RDM)は以下のものを混合して準備します:8% KSR、1x NEAA、1x グルタマックス、2% B27、1x ペニシリン-ストレプトマイシン、1% ペニシリン-ストレプトマイシン、およびDMEM/F-12。
    2. 2日間の自然分化後、毎日培養培地を補充し、DM培地を慎重に吸引し、ウェルごとに1mLの新鮮RDM培地に置き換えます。これを合計30日間続けてください。
      注:この30日間で細胞密度が大幅に増加すると予想されます。各井戸の異なる領域で細胞密度を顕微鏡的に観察することが不可欠です。細胞の浮き上げを防ぐためには洗浄を避け、培地交換時には注意が必要です。メディアは井戸の壁を通して加えます。使用前に15分間、RTで培地を平衡させます。
    3. 32日目までに細胞は見かけの合流状態に達し、多層の2.5次元集合体を形成します。この段階で、1000μLのピペットチップを使ってウェル全体を優しくこすり取り、懸濁培養への移行を開始します。この過程で細胞層を小さなクラスターに分割します。
      注:すべての細胞は培養表面から放出されますが、多層の2.5D集合体は優先的に回収され懸濁培養に移されます(補足図1)。これは、単一細胞や単層断片に比べて自己組織化が速く、より大きなオルガノイドの形成を促進するためです。
    4. スクレーピング直後、得られた細胞クラスターを収集し、RDMを含む低付着型6ウェル培養プレートに移し、懸濁培養条件を確立します。
    5. 細胞はさらに15日間懸濁培養中に置き続け、1ウェルごとに2mLの新鮮RDMを毎日交換します。懸濁培養の最初の2日間は、小細胞クラスターの喪失を防ぐために培地交換を避けてください。懸濁培養中、細胞は徐々に自己組織化し、3Dの透明な角膜状構造を形成し、4倍および10倍の位相差顕微鏡で定期的に監視されます。
  4. 角膜分化期(48日目から90日目)
    1. 角膜分化培地(CDM)は、以下の混合物を混合して準備します:8% KOSR、1x NEAA、1x グルタマックス、1x N2-MAX、1x インスリン-トランスフェリン-セレン、5 ng/mL FGF2、10 ng/mL EGF、および DMEM/F-12。
    2. 低付着プレート(37°C、5% CO₂)での懸濁培養の最初の15日間(32日目から47日目)を経て、RDMをCDMに置き換え、47日目に集合体を懸濁条件下で維持します。1ウェルごとに2mLでCDMを更新し、オルガノイドが常に培養培地に完全に浸透していることを確認してください。この期間中、透明で泡状の角膜原初構造(CP)が徐々に現れます。
    3. CDMで90日目まで懸濁培養を続け、透明なCP領域とより不透明な組織区画の空間的分離をさらに成熟させます。
    4. 90日目には、CP特異的な下流解析を目的として滅菌された鉗子とピンセットを用いて、透明なCP領域をより不透明な組織区画から機械的に分離します。
      注:CP領域の機械的分離は、特にCP濃縮構造が解析を必要とする場合に行われます。他の組織区画やオルガノイド全体の構造に関心がある場合は、構造的異質性を保つためにオルガノイドをそのまま維持することもあります。
    5. 実験目的に応じて、CDMで単離されたCP構造または完全なオルガノイドに対して懸濁培養を続けます。

2. 角膜オルガノイドの特徴付け

  1. オルガノイドの形態的および構造的評価
    1. 角膜オルガノイドは、4倍および10倍の明視野顕微鏡で定期的にモニタリングしてください。定められた時間点でサイズ、透明度、全体的な形態を評価し、画像取得によって構造変化を記録します。
  2. 免疫蛍光に基づく特性評価
    1. 角膜オルガノイド固定
      1. 固定前に4%のPFAと30%のスクロース溶液を準備してください。培養液から角膜オルガノイドをオートクレーブスクーパーで採取します。オルガノイドを4%PFAに1.5mLチューブで移し、室温で20分間培養します。
      2. 培養後、角膜オルガノイドを傷つけないよう慎重にPFAをチューブから除去してください。30%ショ糖溶液を1mLチューブに加え、4°Cに置きます。 24時間後に5mLチューブと液体窒素を準備し、OCT固定のためにラベル付けします。
      3. スクロース溶液は慎重にチューブから捨ててください。オルガノイドを滅菌スクーパーに移します。20μLピペットで、オルガノイドから余分なショ糖溶液を慎重に除去してください。
      4. OCTを5mLチューブキャップに注ぎ、オルガノイドをOCTに入れます。別の滅菌スクーパーを使ってオルガノイドをOCT入りキャップに移します。
      5. 角膜オルガノイドの表面を覆うためにOCTを加えます。針で風船をOCTに割って、オルガロイドのクリアな部分を得ます。
      6. 5mLチューブのキャップを閉じ、ピンセットで液体窒素に浸します。サンプルは-20°Cで保存し、切片を行ってください。
      7. クライオスタットで厚さ5μmで切片し、-20°Cで染色するまで保存します。断片の厚さと組織の向きを一定に保ち、再現性のある染色を確保しましょう。
    2. IF染色
      1. IF染色用の角膜オルガノイド断片を準備するには、PBS-T(0.3% Triton X-100)で3日、RTで10分間洗い流します。
      2. スライドをティッシュペーパーで拭き、PAPペンで縁取りを作ってください。適切な量のブロッキング溶液を組織切片全体を覆い(通常は1枚あたり100〜200μL、PAPペンの境界によります)、RTで1時間培養します。
      3. 遮断液を吸引し、PAPペンで縁取りをします。150μlの一次抗体(PAX6、p63、OCT3/4、NANOG、Na+/K+-ATPase、AQP1、CK3、CK5、CK14、CK19、N-cad、KERA、COLIV、希釈率は 材料表に記載)溶液をスライドに加え、RTで1時間培養します。
      4. PBS-T(0.3%トライトンX-100)でRTで2回洗い、10分間洗います。PAPペンで境界線をもう一度作り直してください。
      5. 150μlの二次抗抗溶液(Anti Rabbit-488、Anti Mouse-594、希釈率は 材料表に記載)をスライドに加え、RTで暗条件下で2時間培養します。PBS-T(0.3%トリトンX)でRTで2回10分間洗います。スライドとマウントをDAPI溶液で清掃してください。
      6. 未分化iPSCの場合は、固定後にブロッキングと透過化を行い、同じプロトコルで染色を進めます。蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を用いて4倍および10倍の拡大で染色されたサンプルを可視化します。

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結果

ヒト誘導多能性幹細胞(hiPSCs)の幹性

実験で使用されたヒトiPSCの幹性を評価するために、明視野イメージング、免疫染色、qRT-PCR解析を実施しました。我々は、 OCT3/4、SOX2、NANOGなど、ヒト多能性幹細胞における多能性および自己更新の維持に必要なコア転写因子の発現を評価しました11。

ブライトフィールドイメージングでは、明確な境界を持つコンパクトなコロニーが特徴的な典型的な多能性幹細胞形態が明らかになりました(図2A)。免疫蛍光染色により、対照および患者由来iPSCの両方においてOCT3/4およびNANOGの強い核定在が示され(図2B)、未分化多能性状態と一致しました。qRT-PCR解析...

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ディスカッション

対照オルガノイドとアニリジウム患者由来のオルガノイドの比較解析では、上皮層の異常、細胞外マトリックスの異常沈着、PAX6遺伝子の発現異常が明らかになりました。

異なるアニリジア患者サンプル、特にAAK1、AAK2、AAK3系統から派生したiPSCの増殖速度はばらつきがあり、これは主にPAX6遺伝子の変異によって引き起こされる遺伝的多様性を反映している可能性があります。これにより、各患者の独自の細胞特性において細胞再プログラミング効率や幹細胞挙動に違いが生じる可能性があります17.これらの成長率の違いは、アニリジアの疾患メカニズムに関する貴重な洞察を提供し、個別化治療戦略の開発を導く可能性があります。

このiPSC由来の角膜オルガノイドシステムは、無関心症に関連する病態生理を調査するた...

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開示事項

著者たちは公表していません。

謝辞

本研究はTÜBİTAK 121N276および欧州希少疾患合同プログラムの資金提供を受け、欧州連合(Horizon 2020 ERAチェアプログラム、RareBoostプロジェクト助成番号:952346)から部分的に支援を受けています。A.C.K.はYÖK 100/2000博士課程奨学金とTÜBİTAK-BİDEB 2211Aフェローシップの支援を受けています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
10 mL 血清学的ピペットZA BioteknoLabselect SP-003-10
15 mL コニカルチューブ Labselect CT-002-15A
2 mL 血清学的ピペットLabselect Labselect SP-003-2
5 mL 血清学的ピペットCleanteksBiofil GSP010005
50 mL コニカルチューブGolden Gate CT-002-50
50 mL 血清学的ピペットBIOFILLGSP020050
Anti Mouse 594Jackson Immuno715-585-150希釈範囲：1:100 - 1:800
Anti Rabbit 488 Jackson Immuno711-545-152希釈範囲：1:100 - 1:800
オートクレーブ VAPOUR-Line liteVWR chemicalsVAPOUR-Lineeco 25
B27 サプリメントGIBCO12587010ビタミン A 添加
ベンチトップ遠心機Eppendorf5702
ベンチトップ顕微鏡 DMI1OlympusCKX41
クラス II 生物安全キャビネットThermoSafe 2020
ウシ血清アルブミン (BSA)Sigma-AldrichA8806
CellBanker 1Worthington IndustriesLABS-20K
カバースリップ 24 mm x 50 mmISOLAB280
Cryomatrix, OCTFisher Healthcare30226281
クリオバイアルBioSigmaN403522
DAPINEOFROXX 1322
DAPINEOFROXX 15390.5 ug/mL
DMEM/F12 培地GIBCO 31330-038
Dulbecco's リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS)Gibco141901441X
EGFGIBCOPHG0311
エタノール 100%Sigma64-17-5
エタノール 70%Sigma64-17-5エタノール希釈
細胞外マトリックス (ECM)Corning354277LDEV-free
FGF2GIBCOPHG0024
GlutaMaxGIBCO35050061
GoTaq Master MixPromegaM7123
インキュベーターMemmert INCO 153 med44043
インスリン-セレン-トランスフェリンGIBCO41400045
KnockOut セラム (KOSR)GIBCO10828028
マイクロトーム RM2235LeicaRM2235
マウンティングメディアabcamab104135
mTSER 培地STEMCELL85850
多孔プレート (6ウェル)CORNING   3516
N2 サプリメントR&DAR003
非必須アミノ酸 (NEAA)LONZABE13-114E
P20, P200 および P1000 ピペットGilsonF167350
パラフィンVWR chemicals10048502
パラホルムアルデヒド Sigma-AldrichF8775
プライマー抗体 Aquaporin mAbabcamab9566希釈範囲：1:50-1:200
プライマー抗体 CK14Santa Cruz Biotechnology sc-53253希釈範囲：1:50-1:500
プライマー抗体 CK19ProteinTech14965-1-AP希釈範囲：1:150-1:600
プライマー抗体 CK3NOVUSNBP2-91997 0.1 ML希釈範囲：1:50-1:200
プライマー抗体 CK5Thermo MA517057希釈範囲：1:200-1:1000
プライマー抗体 Collagen Type IVabcamab6586希釈範囲：1:100-1:500
プライマー抗体 KeratocanBiossbs-11054R希釈範囲：1:50-1:200
プライマー抗体 Na/K - ATPaseSanta Cruz Biotechnologysc-21712希釈範囲：1:50-1:500
プライマー抗体 N-Cadherinabcamab76011希釈範囲：1:50-1:500
プライマー抗体 p63SANTACRUZ   sc-25268希釈範囲：1:50-1:500
プライマー抗体 Pax6NovusNBP2-44576希釈範囲：1:50-1:200
RNA 分離キットMacherey–Nagel 740984.50
Rock 阻害剤 (Y-27632)TOCRIS1254
スライドStarFrostMBB-0302-55A接着剤、研磨
ステンレス製鉗子 no:5Sigma F6521-1EA
ステンレス製メス 無菌 N 21Swann-Morton1033060
The OneScript Plus cDNA 合成キット Applied Biological MaterialsG236
Triton-X100NEOFROXX 8500
TRIzol 試薬Thermo15596026
トリパンブルーGIBCO15250061
超低接着性 (ULA) 6ウェル  プレート

参考文献

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