元の腫瘍特性を保持した患者由来神経膠腫細胞の単離および長期培養のための最適化されたワークフロー

サマリー

この研究は、患者由来神経膠腫細胞株 (PDGC) を確立するための標準化されたプロトコルを提示し、その遺伝的および表現型の忠実度を確保します。基底膜マトリックス抽出物支援接着培養システムは、細胞増殖と均質性を向上させ、これらのモデルを薬物スクリーニングやGBM研究に役立てます。

要約

膠芽腫(GBM)は、最も侵攻性の高い原発性脳腫瘍であり、高い不均一性と標準治療に対する耐性を特徴としています。従来の神経膠腫細胞株は、患者特有の遺伝的および表現型の特徴を保持できないことが多く、翻訳的関連性が制限されています。これに対処するために、無血清神経幹細胞培養システムを使用して、50の患者由来神経膠腫細胞株(PDGC)を確立しました。このプロトコルは、GBM患者から得られた腫瘍サンプルの収集、処理、および長期培養を概説し、主要な分子的特徴の保存を保証します。当社の方法論には、酵素組織解離、赤血球溶解、および細胞生存率を向上させ、ハイスループットの薬物スクリーニングを容易にする基底膜マトリックス抽出物支援接着培養が含まれます。全ゲノムおよびトランスクリプトームシーケンシングおよび免疫蛍光染色によるPDGCの特性評価により、一般的なGBM遺伝子変異、神経幹細胞および前駆細胞マーカーの保持が確認されています。さらに、これらの細胞は異種移植モデルで腫瘍形成の可能性を示します。培養条件を最適化することにより、このプロトコルは、治療的発見とメカニズム研究をサポートするための生物学的に関連性のあるGBMモデルを生成するための標準化されたフレームワークを提供します。

概要

神経膠腫は、最も一般的な原発性頭蓋内腫瘍であり、遺伝子変異を受けた神経幹細胞または前駆細胞に由来します¹。世界保健機関(WHO)は、神経膠腫を低悪性度から高悪性度²までの病理学的および分子的特性に基づいてグレード1〜4に分類しています。グレード4の神経膠腫である膠芽腫(GBM)は、全神経膠腫の約57%、中枢神経系原発性悪性腫瘍の約48%を占めています³。GBM患者は予後不良に直面しており、生存期間の中央値は2年未満、5年生存率はわずか5.4%です⁴。標準治療には、最大限の安全な切除とそれに続く放射線療法とテモゾロミド化学療法^{が含まれます5}。これらの介入にもかかわらず、GBMはその浸潤性の性質と治療に対する固有の耐性のために不治のままであり、新しい治療アプローチが緊急に必要とされています。

研究者は一般的に、がんの発生と治療メカニズムを研究するためのモデルとしてヒト由来の腫瘍細胞株を使用します。しかし、血清含有培地で維持され、in vitroで広範囲に継代された古典的な神経膠腫細胞株は、患者の腫瘍と比較して表現型の特徴と遺伝的プロファイルに有意な変化を示します^6,7,8。そのため、これらの細胞株に基づく前臨床スクリーニングモデルでは、臨床環境に効果的に移行できる治療標的や分子を特定できないことがよくあります。GBM治療の成功は、腫瘍の不均一性と可塑性によってさらに複雑になります⁹。この不均一性は、トランスクリプトームサブタイプ(例えば、前神経、間葉系)だけでなく、構成細胞の多様な発生状態にも現れる¹⁰。GBMは神経発達メカニズムを採用し、腫瘍増殖を促進し、放射線療法および化学療法に対する耐性を高める神経膠芽腫幹細胞(GSC)亜集団を含んでいます^11,12。患者由来神経膠腫細胞を無血清神経幹細胞培地で培養すると、元の腫瘍の突然変異スペクトルと遺伝子発現パターンを効果的に保存しながら、部分的なGSC特性を維持します⁸。

ニューロスフェア培養モデルと比較して、基底膜マトリックス抽出物支援接着培養は、より安定で迅速な細胞増殖を促進し、化学的および遺伝的スクリーニングにより適している¹³。このアプローチを用いて、50の患者由来GBM細胞株を樹立し、全ゲノムシーケンシング、トランスクリプトームシーケンシング、およびFDA医薬品ライブラリースクリーニングを通じてそれらを特徴付け、潜在的な治療戦略を探求しました。このリソースは神経膠腫の研究を前進させ、詳細な結果は以前の研究で発表されています¹⁴。ここでは、患者由来神経膠腫細胞株(PDGC)の開発に用いた方法論について説明します。

プロトコル

このプロトコルは、病院のコラボレーションを通じて得られた患者由来の神経膠腫組織と血液サンプルを利用します。すべてのサンプリング手順と実験プロトコルは、首都医科大学北京天壇病院の倫理委員会から承認を受けています(KY 2020-093-02およびKY 2014-021-02)。患者は手術前に署名入りのインフォームドコンセントを提供し、サンプルが検査室に転送される前にすべての身元情報が匿名化されます。研究者は、このプロトコルを実施する前に、施設の倫理委員会から承認を確保し、患者の同意を得る必要があります。

1. サンプル処理前の準備

1. はさみ、ピンセット、その他の器具をオートクレーブ滅菌します。
2. 47.5 mLのDMEM/F12、500 μLのN2、1 mLのB27、500 μLの100xペニシリン/ストレプトマイシン、250 μLの100倍グルタミン代替品、100 μLの2.5 M HEPES、100 μLの30%グルコース、50 μLの50 mM β-メルカプトエタノール、1.5 mLの1 μg/mL上皮成長因子(EGF)を組み合わせてPDGC培地を調製します。 1.5 mLの1 μg/mL塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)。
3. 8.29 gの塩化アンモニウム、1 gの重炭酸カリウム、および37 mgのEDTAを水に溶解し、1 Lに希釈して、1x赤血球溶解バッファー(ACK)を調製します。
4. 滅菌した器具、PBSバッファー、廃液容器、遠心チューブ、およびその他の消耗品をバイオセーフティキャビネットに入れ、UV消毒を30分間行います。
5. 液体窒素を断熱容器に入れます。

2.患者サンプルの収集

注:すべての組織採取手順は、その後の細胞培養物の細菌汚染を防ぐために、厳格な滅菌条件下で実施してください。ワークフロー全体を通じて無菌技術を維持します。

1. 術前に血液サンプルを採取し、患者の脳から腫瘍組織を切除します。腫瘍を周囲の正常組織と区別することが困難な、大きくて浸潤性の高い腫瘍の場合、重要な機能的な脳領域を維持しながら、腫瘍周囲組織切除を最大化します。腫瘍コア組織の約500〜2,000 mm³ を分離し、10 mLの低体温保存培地を含む15 mLの遠心チューブに入れます。
2. サンプルチューブを密封し、アイスボックスに入れ、迅速にラボに輸送して処理します。
   注:サンプルの収集と処理の間隔が4°Cで6時間を超えないようにしてください。 サンプル採取中は、焼けた組織や腫瘍壊死の領域を慎重に除外してください。組織切開部の表面は、手術中に使用される電動ナイフによって焦げることが多く、培養中の細胞生存率が損なわれる可能性があります。

3.血液サンプル処理

1. 血液サンプルチューブを1,000 × g で10分間遠心分離し、上部の血漿層を廃棄します。
2. 残りの白血球と赤血球層を50mLの遠心チューブに移します。1x ACKを10 mL加え、室温で5分間インキュベートして赤血球を溶解します。
3. PBS40 mLを加えて溶解を終結させ、穏やかに混合し、1,000 × g で10分間遠心分離します。
4. 上清を捨て、1x ACK 3 mLを加え、室温で5分間インキュベートして、2回目の赤血球溶解ステップを行います。
5. 12 mLのPBSを加えて溶解を終了させ、穏やかに混合し、1,000 × g で10分間遠心分離します。
6. 上清を捨て、末梢血単核細胞(PBMC)ペレットをPBS1 mLに再懸濁し、1.5 mLの遠心チューブに移し、510 × g で10分間遠心分離します。
7. 上清を捨て、PBMCペレットを液体窒素で凍結し、-80°Cで保存します。

4. 腫瘍組織処理

1. サンプルチューブから組織保存液を取り出し、PBSで組織を洗浄して、目に見える血栓と壊死組織を取り除きます。残りの組織に2回目のPBS洗浄を行います。
2. 最も損傷の少ない組織部分を切り取り、4°Cの4%パラホルムアルデヒド(PFA)で一晩固定します。
   注:固定組織のサイズは約10mmです。サンプルが小さい場合は、この手順をスキップします。
3. 2〜4個の小さなティッシュピースをカットし、1.5 mLの遠心チューブに移し、液体窒素で凍結し、-80°Cで保存します。
   注:小さな組織片のサイズは、シーケンシングに必要なDNAとRNAの量に応じて、通常5〜10 mmの範囲です。
4. 残りの腫瘍組織を1.5mLの遠心チューブに入れ、氷の上に置いたままハサミで細かく刻み、細かいペーストにします。
5. 1〜3mLの細胞剥離液を加え、ミンチ組織を消化チューブに移します。組織解離器を使用して、37°Cで16分間組織を消化します。
6. 3倍量のPBSを添加して消化を停止し、細胞懸濁液を70 μmの細胞ストレーナーを備えた遠心分離チューブに移します。小さなロッドでストレーナーを通して組織を優しく粉砕し、細胞の収集を最大化します。510 × g で10分間遠心分離し、上清を取り除きます。
7. 1x ACKを1〜3 mL加え、室温で5分間インキュベートして赤血球を溶解します。4倍容量のPBSを加えて溶解を止め、穏やかに混合し、510 × g で10分間遠心分離して上清を除去します。
8. 細胞をPDGC培地に再懸濁し、細胞懸濁液の一部を培養プレートに播種します。プレートを37°Cの低酸素インキュベーターに入れます。残りの細胞を10%DMSOを含む培地で凍結します。
   注:通常、約10〜20 mmの組織サンプルの場合、細胞懸濁液の約1/3〜1/10を3 mLの培養培地を含む6 cmの皿に播種し、残りの細胞は細胞収量に応じて2〜4バイアルで凍結保存されます。
9. 氷冷PBSに基底膜マトリックス抽出物を1:100の比率で添加してプレートをコーティングし、プレートを室温で振とうインキュベーターで2時間インキュベートします。PDGC培地を追加する前にPBSを廃棄してください。
   注:その後のすべての細胞継代および培養は、基底膜マトリックス抽出物コーティングプレートを使用して行ってください。
10. 2日後、培養細胞を基底膜マトリックス抽出物コーティングプレートに移し、細胞の接着と増殖を可能にします。

5. 細胞培養と継代

1. 細胞が培養プレートに付着したら、非接着性細胞を除去し、2〜3日ごとに培地を交換または補充します。
   注:接着能力は細胞によって異なります。基底膜マトリックス抽出物の存在下でも、BNI7-11のように、細胞のごく一部が非接着性のままであり、これは継続的な懸濁培養を必要とします。さらに、一部の細胞は、BNI20などの半接着性増殖パターンを示します。そのため、細胞の状態を注意深く観察することが不可欠です。非接着性細胞の場合、懸濁細胞の増加が認められます。細胞凝集体が暗い綿のような構造として現れ、時間の経過とともに大きな変化を示さない場合、通常、細胞凝集体は長期的な拡大ができません。
2. 細胞がコンフルエントに達したら、細胞解離液を添加して細胞を剥離します。3x PBSで解離を終了させ、250 × g で3分間遠心分離します。細胞を1:2から1:4の比率で継代します。残りの細胞を10%DMSOを含む培地で凍結します。
3. 少なくとも10〜20世代にわたって継代を続け、安定した細胞株を確立します。
   1. 各継代中の画像で細胞の形態を文書化し、継代番号を記録します。最初の細胞凍結には、詳細な情報(継代番号など)を明確にラベル付けします。
   2. 細胞株が安定したら、細胞ペレットを2〜3本(300,000〜1,000,000細胞/チューブ)集め、-80°Cで保存します。

6. その後の実験運用

1. PFA固定サンプルの場合、一晩固定した後、60%エタノール、70%エタノール、80%エタノール、90%エタノール、95%エタノールに連続浸漬し、100%エタノールを2回交換して、それぞれ40分間、選別された一連のエタノール溶液でサンプルを脱水します。続いて、キシレンの2つの交換でサンプルをそれぞれ40分間透明化し、次にパラフィン溶液を2回交換してそれぞれ40分間浸潤します。最後に、脱水および浸潤したサンプルをパラフィンブロックに埋め込み、その後の切片化および染色¹⁵を行う。
2. -80°Cで保存されたPBMCペレット、腫瘍組織、または腫瘍細胞サンプルの場合、必要に応じて全ゲノムシーケンシング、エクソームシーケンシング、バルクRNAシーケンシング、シングルセルRNAシーケンシングなど、さまざまなオミクス研究のためにDNAとRNAを抽出します。
3. 安定なPDGC細胞株は、マウス異種移植片モデルの確立、ハイスループット薬物スクリーニング、メカニズム研究、およびその他の関連実験に使用します。
   1. PDGCの頭蓋内同所性異種移植モデルを確立するには、細胞を解離してカウントし、次に基底膜マトリックス抽出物と氷冷PBSの1:1混合物に再懸濁して、最終濃度100,000細胞/μLまでします。マイクロシリンジと標準的な定位固定器具を使用して、6〜8週齢の免疫不全マウスの左線条体に5μLの細胞懸濁液を定位的に注入します。ブレグマに対する注射座標を次のように設定します: +0.5 mm 前後 (AP)、-1.9 mm 内側外側 (ML)、および -3.6 mm 背腹 (DV)。
   2. ルシフェラーゼ発現PDGCを作製し、腫瘍増殖の生物発光イメージングのための頭蓋内異種移植片を確立する。
      1. ルシフェラーゼ-tdTomatoレポーター遺伝子をレンチウイルス粒子にパッケージ化し、パッケージ化されたレンチウイルスにPDGCを感染させることで、安定した発現を確立する¹⁶。
      2. 感染後、tdTomato陽性細胞をフローサイトメトリーで選別し、ルシフェラーゼを発現する安定した細胞集団を得る。
      3. イメージングの前に、15 mg / mL D-ルシフェリン溶液を使用して、体重10 μL / gの用量でD-ルシフェリンを腹腔内に注入します。.イソフルランでマウスを麻酔し、D-ルシフェリン注射後10分間待ちます。マウスを生物発光イメージングシステムに入れます。イメージング中の露光時間を自動モードに設定する¹⁷。

結果

図1は、プロトコルの包括的なワークフローの概要を示しています。患者のサンプルには、末梢血と腫瘍のコア組織が含まれます。血液サンプルは遠心分離を受けて血漿を除去し、続いて2回のACK溶解ラウンドを行い、シーケンシング分析のコントロールとして機能するPBMCを取得します。腫瘍サンプルはPBS洗浄され、血栓や壊死領域が除去されてから、小さな断片に処理されます。複数の組織断片は、将来のDNA/RNA抽出およびシーケンシングのために凍結保存され、無傷の断片は組織学的解析のためにPFA固定およびパラフィン包埋されます。残りの腫瘍組織は、均質になるまで氷上で完全にミンチされ、その後、酵素的および機械的に解離して単一細胞懸濁液になります。赤血球を除去するACK処理後、細胞をEGFおよびbFGFを含む無血清PDGC培地で培養します。異なるPDGCは、トランスクリプトームサブタイプとは無関係に異なる形態を示します(図2)。長期継代PDGCは、シーケンシングベースの比較解析、異種移植モデルの開発、薬物スクリーニング、および機構研究をサポート...

ディスカッション

GBMの不均一性は、治療に重大な課題をもたらします。従来のGBM細胞株は、血清含有培地での長期培養後に均質な遺伝的背景を発現し、患者の腫瘍特性を失うことが多く、その翻訳価値が制限されます。GBMの培養条件を最適化し、患者サンプル処理ワークフローを標準化することは、研究における限られた臨床リソースを最大限に活用するために不可欠です。包括的なGBM細胞モデルシステムは、GBMの不均一性についての理解を深め、治療戦略を改善します。

このプロトコルでは、GBM 患者サンプルの処理ワークフローと PDGC 培養方法について詳しく説明します。腫瘍サンプルの品質は、初代細胞培養の成功に大きく影響します。外科的サンプリングや実験室での取り扱いにおける厳格な無菌技術が不可欠であり、細胞の生存率を維持するための迅速な術後処理も不可欠です。予備研究では、86 GBM サンプルから 28 の PDGC ラインを確立しました (成功率は約 30%)。高悪性度のGBMサンプルは、同じプロトコルを使用しているにもかかわらず成功率が有意に低い低悪...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
70 & ムー;m細胞ストレーナー	Falcon	352350
Accutase細胞剥離溶液	BioLegend	423201
塩化アンモニウム	アラジン	60-92-4
抗 Sox2 抗体	Merckmillipore	AB5603
DAPI を含む退色防止封入培地	Beyotime	P0131
抗ネスチン抗体	NOVUS	NB100-1604
ビタミンサプレメットなしの B27	Gibco	12587010
BD FACSAria Fusion フローサイトメーター	BD Biosciences	/
細胞培養皿	NEST	705001
D-ルシフェリン、カリウム塩	Invitrogen	L2916
DMEM/F12	Gibco	C11330500BT
DMSO	Sinopharm	30072418
EDTA	BBI Life Sciences	A600107-0500
グルコース	Sangon Biotech	A50991-0500
GlutaMAX	Gibco	35050-061	グルタミン代替物
ヘマトキシリン-エオシン染色キット	Solarbio	G1120
HEPES	Beyotime	ST090
ヒト bFGF	Origene	TP750002
ヒト EGF	ノボプロテイン	C029-500μg
HypoThermosol FRS	Biolife Solutions	101104	低体温保存培地
Isoflurane	RWD Life Science	R510-22-10
IVIS Lumina XR III	PerkinElmer	/	生物発光イメージングシステム
Matrigel	Corning	356231	基底膜マトリックス抽出物
マイクロシリンジ	Hamilton	80300
N2 サプリメント	Gibco	17502048
Nunclon Sphera 6 ウェルプレート	Thermo Scientific	174932	超低付着プレート
パラホルムアルデヒド	Sangon Biotech	A500684-0500
PBS バッファー	Solarbio	P1010-100*2L
ペニシリン/ストレプトマイシン	Solarbio	P8420/S8290
炭酸カリウム	Sangon Biotech	A501195-0500
RWD 組織解離器	RWD ライフサイエンス	DSC-410
標準定位装置	RWDライフサイエンス	68801
組織サンプル処理チューブ	RWD ライフサイエンス	SCT-100
β-メルカプトエタノール	シグマ	M3148-100mL