方法論記事

ガスクロマトグラフィー-燃焼-同位体比質量分析による生体試料中のビタミンAの 13°C濃縮の分析

491 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/68571

⸱

2025年11月14日

 ,  ,  , 
1Department of Nutritional Sciences, University of Wisconsin-Madison

この記事について

サマリー

この論文では、トレーサー用途のためのレチノールおよびレチニルエステルの 13C濃縮について、血清、母乳、および肝臓サンプルの分析について説明します。高速液体クロマトグラフィーを使用してレチノール濃度を精製および定量し、ガスクロマトグラフィー-燃焼-同位体比質量分析(GC-C-IRMS)を使用して精製された抽出物を分析します。

要約

ビタミンAは健康にとって重要ですが、ビタミンAの状態を評価することは困難です。血液中を循環するビタミンAは恒常性的に制御されており、多くの場合、ビタミンAの欠乏または過剰を反映していません。 13種類のビタミンACを使用すると、全身のビタミンA貯蔵量と薬物動態と代謝に関する追加情報を追跡および定量化できます。このプロトコルは、ガスクロマトグラフィー-燃焼-同位体比質量分析法(GC-C-IRMS)を用いて、血清、母乳、および組織サンプル中のビタミンAの13C-同位体濃縮の抽出、精製、および測定を記述する。GC-C-IRMSを使用した分析は、特に自然存在量レベルに近い 13C濃縮のサンプルに対して、高感度で正確な濃縮値を提供します。これにより、より少ないトレーサー用量と長期の薬物動態サンプリングを使用するための研究デザインの柔軟性が可能になります。簡単に言えば、0.4〜1mLの血清にエタノールを添加してタンパク質を沈殿させ、内部標準としてC-23 β-アポ-カロテノールを添加し、ヘキサンを使用してレチノイドを抽出します。その後、抽出物をメタノールに再懸濁し、HPLCを使用して精製します。次に、レチノール画分をヘキサンに再懸濁し、GC-C-IRMSシステムに注入します。原子%(At%)は、元素分析装置を使用してスクロース標準に対して校正された二酸化炭素を参照して直接計算されます。GC-C-IRMSによって分析された他の組織タイプには、ケン化後の母乳と肝臓が含まれます。固相抽出技術は、これらまたは他の複雑なマトリックスの精製を支援するために使用できます。さらに、IRMSに元素分析装置を取り付けて、食品サンプルの合計 13°C含有量を分析することができます。

概要

ビタミンA(VA)は、視力、免疫機能、細胞分化、代謝調節に必要な必須微量栄養素です。VA ステータスの最適化は、欠乏または過剰が健康転帰を損なう可能性があるため、依然として世界的な健康上の課題です。VA 状態の正確な評価は、適切な介入を導く臨床研究または集団研究にとって重要です。しかし、血清レチノール濃度だけでは、広範囲の全身貯蔵量 (TBS) にわたって恒常性的に調節され、炎症やその他の栄養欠乏の影響を受けるため、バイオマーカーおよび診断ツールとしては不十分です 1,2。

同位体標識トレーサーは、レチノール同位体希釈(RID)テスト3,4,5を使用してTBSの定量的評価を可能にすることにより、VA研究を劇的に変革しました。RIDの場合、13°Cまたは2時間のいずれかに富むVAトレーサーが投与され、体貯蔵と平衡化され、血清(または血漿)レチノールトレーサー対トレーサー比(TTR)がMSを使用して測定されます。同位体希釈方程式を VA 代謝に関連する特定の仮定とともに適用して、TBS 5,6 を計算します。

多数のクロマトグラフィーとMSの組み合わせを使用して、血清レチノールTTR(GC-MS、LC-MS、LC-MS/MSなど)を測定できます。TBSはTTRに反比例するため、正確なRID推定には分析精度が重要です。LC-MS/MSは、高標識トレーサーと比較的高いトレーサー用量を使用する場合のハイスループットアプリケーションに適しています。一般的な LC-MS/MS メソッドでは、アッセイ内で 3-6%、アッセイ間7 で <8% のレチノール相対標準偏差(RSD)が報告されていますが、TTR の精度と精度に関するデータは限られています。対照的に、ガスクロマトグラフィー燃焼同位体比質量分析(GCCIRMS)は、13C-レチノール濃縮の卓越した精度を提供し、典型的な13C/12C同位体存在量RSDは~0.02-0.05 8,9です。これにより、濃縮度が低いサンプル中のトレーサー濃度を正確に測定できます。RIDアプリケーションにIRMSを使用すると、トレーサーの質量とトレーサー中の標識原子を減らして適切な分析シグナルを得ることができ、どちらもトレーサーの投与に関連するコストを節約できます。

この原稿では、GC-C-IRMSを使用した血液、母乳、組織からの 13種類のC-レチノールの分析の概要を説明しています。試験する生体サンプルに応じて、GC-C-IRMSを使用した 13C標識レチノールの分析は、標識レチノールを含む非極性化合物を単離するためのいくつかの潜在的な抽出方法の1つから始まります。血清サンプルの場合、これにはエタノールとヘキサンを添加し、ヘキサン画分を収集することによる液液抽出が含まれます。母乳を検査する場合、サンプルは最初に水酸化カリウムでケン化され、次に血清と同様の液液抽出が行われます。これらの母乳サンプルは、固相抽出カートリッジを使用して精製され、他の脂質の残量も減らされます。組織(肝臓など)から抽出する場合、サンプルを無水硫酸ナトリウムで粉砕して水分を除去し、塩化メチレンで抽出し、容量フラスコまたは丸底フラスコにろ過して回転蒸発させます。アリコートを乾燥させ、エタノールに再懸濁し、ケン化し、母乳と同じ方法で抽出します。各サンプルからのこれらの非極性溶液は窒素下で乾燥され、メタノールで再溶解され、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で精製および定量されます。

IRMSの感度により、長期数学的モデリングアプリケーション用の薬物動態サンプルや、VA代謝を正確に追跡するための肝外組織サンプルなど、サンプル濃縮度の低いサンプルの濃縮を測定できます。理論上の被験者10 における有効性を判断するために介入前後の VA 状態を評価するために、単回投与のペア RID 検査が提案されており、これはヒトで検証されれば有望なアプローチとなる可能性があります。IRMSは、自然濃縮値に近いVAトレーサーを検出できるため、長いフォローアップウィンドウとサンプリングプロトコルの柔軟性が可能になります。

母乳は、VA 状態評価のための侵襲性の低い代替サンプリング アプローチであることが示されています1。母乳レチノールは RID 検査のサンプリング源として使用でき、VA 貯蔵量が低いザンビアの女性において血清由来 RID 値と強い相関関係を示しています11。組織や母乳サンプルの場合、固相抽出技術は、複雑なマトリックス中のこれらのサンプルの精製に役立ちます。IRMS は、VA の食物源を識別し、血清レチノール 9,12,13 の自然な 13C 存在量の変化を使用して相対的な食事寄与を決定するためにも使用されています。元素分析装置をIRMSとともに使用して、食品サンプルの合計13°C含有量を分析し、VA濃縮と比較することもできます。

13C ラベルを使用する場合、天然に存在する 13C (総炭素の ~1.1%) のベースライン 13C レチノール濃縮を理解することが重要です。したがって、個人レベルで最高の精度を得るには、ベースラインの血液サンプルをお勧めします。母集団評価では、ランダムに選択されたサブグループ、または同じ母集団グループ14から個別の個人を使用して、母集団ベースの推定値を生成できます。

プロトコル

1. 生体試料からのレチノールの抽出

注:すべてのサンプルの取り扱いと抽出手順は、劣化を最小限に抑えるために、黄色またはUVフィルターでフィルタリングされた光の下で実行されます。

  1. 血清からの抽出
    1. 1 mLの血清(または利用可能な量)を13 x 100 mm(または同様のサイズ)のガラス試験管にピペットで入れます。使用した血清量を記録します。
      注意: 容積式ピペットの使用をお勧めします。
    2. 200プルーフエタノールの1.5倍の体積を追加します。
    3. C-23 β-アポ-カロテノール(オールトランス レチナールから合成、abs = 0.9)9などの内部標準を25 μL添加します。サンプルにキャップをかぶせ、ボルテックスで15秒間混合します。
    4. 1 mLのヘキサンを加え、ボルテックスで15秒間混合し、室温で2分間(~1,300 × g)遠心分離します。
    5. パスツールピペットを使用して、上部のヘキサン層を新しいガラス試験管(12 x 75 mmまたは13 x 100 mm)に慎重にピペットで入れます。
    6. ステップ1.1.4と1.1.5を2回繰り返し、3つのヘキサン抽出物を2番目のチューブにプールします。プールしたヘキサン抽出物を、乾くまで穏やかな窒素の流れの下に置きます。
    7. 乾燥したサンプルに100 μLのメタノールを加え、すぐにキャップをします。溶液をチューブの側面で上下に回転させ、ボルテックスでサンプルを15秒間混合します。
    8. サンプルを-80°Cの冷凍庫に少なくとも5分間入れます。
      注:サンプルは、このステップで翌日まで-80°Cで保存したままにすることができます。
  2. 母乳サンプルの抽出
    1. 牛乳サンプルを完全に解凍し、サンプルが均一になるように数回穏やかに反転させます。10 mLのガラス製スクリュートップ遠心分離管に、0.5〜1.5 mL(標準1.0 mL)の牛乳のアリコートを測定し、使用量を記録します。
    2. 200プルーフエタノール(0.1%ブチル化ヒドロキシトルエン(w:v)を含む)の1.5倍の体積を加え、ボルテックスで15秒間混合します。
    3. C-23 β-アポ-カロテノール(オールトランス レチナールから合成、abs = 0.9)などの内部標準を25 μL添加します15。サンプルにキャップをかぶせ、ボルテックスで混合します。
    4. 50:50水酸化カリウムの0.8倍のミルクサンプル量を水に加え(w:vとして調製、例えば、50 mLの水に溶解した50 gのKOH)、ボルテックスで15秒間混合します。
      注:KOH:水はプラスチック容器(HDPEなど)で作る必要があります。
    5. サンプルを45°Cの水浴中で1時間ケン化し、15分ごとにボルテックスで短時間混合します。
    6. 開始ミルク量と同じ量で冷たい脱イオン水または逆浸透水を追加します。
    7. 1 mLのヘキサンを加え、ボルテックスで15秒間混合し、室温で2分間(~1,300 × g)遠心分離します。
    8. パスツールピペットを使用して、上部のヘキサン層を新しいガラス試験管(12 x 75 mmまたは13 x 100 mm)に慎重にピペットで移動させます。
    9. 手順1.2.7と1.2.8をさらに2回繰り返し、2番目のチューブにヘキサンをプールします。
    10. 固相抽出(SPE)で各サンプルを採取します。まず、必要な SPE カートリッジ(PE 500 mg/3 mL の -NH2)を真空マニホールドに接続します。
    11. 各カートリッジに 3 x 2 mL のヘキサンを流して各カートリッジをコンディショニングし、溶媒レベルが包装材料の上部を下回らないようにします。ヘキサンを16 x 75 mmのガラス管に集め、適切に廃棄します。
    12. サンプルをカートリッジにロードし、溶媒が充填材のレベルをわずかに上回るまで真空で引き抜きます。ステップ1.2.11と同じ方法で、各カートリッジを3 x 2 mLのヘキサンですすいでください。廃溶媒を廃棄し、ガラス収集チューブをサンプルIDが記載された同じサイズの新しいものと交換します。
    13. レチノールを3 x 2 mLの塩化メチレンで洗浄し、この画分を収集します。
    14. 溶出液を窒素下で乾燥させ、100 μLのメタノール(MSグレード)で再構成します。ボルテックスでサンプルを混合し、チューブのすべての側面で溶媒を渦巻きさせます。遠心分離機で20〜30秒。
    15. サンプルを-80°Cの冷凍庫に少なくとも5分間入れます。
      注:サンプルは、このステップで翌日まで-80°Cで保存したままにすることができます。
  3. 肝臓サンプルの抽出
    1. 直径8cmのガラス漏斗に、15cmのWhatman#1ろ紙を円錐形に折りたたんで置きます。漏斗の下に50 mLのメスフラスコを置きます。
    2. 組織を解凍し、0.5 g、または利用可能な量のサンプルを重くします。使用した組織重量を記録します。
    3. サンプルを乳鉢と乳棒に移し、約5gの硫酸ナトリウムで粉砕します。
    4. C-2315 などの内部標準を 250 μL 添加します。
      注:エステル化型のビタミンA(すなわち、酢酸レチニル、酪酸レチニル)は、サンプルが最終的にケン化され、標準が内因性レチノールと区別できなくなるため、使用しないでください。
    5. ヒュームフードで、10〜15 mLの塩化メチレンを粉砕した肝臓サンプルの入った乳鉢に注ぎ、乳棒を使用して穏やかに混合します。
    6. 塩化メチレンをろ紙を通してメスフラスコに注ぎます。
    7. 手順1.3.5と1.3.6をさらに2回繰り返し、メスフラスコ内の総溶媒がラインより下にとどまるようにします。
    8. パスツールピペットを使用して、モルタルの残りの内容物を塩化メチレンで漏斗にすすぎます。メスフラスコ内の溶媒がラインに達するまで、パスツールピペットで塩化メチレンを漏斗に加え続けます。メスフラスコにキャップをかぶせ、キャップを所定の位置に固定しながら、フラスコを数回反転させます。
    9. 約10 mLの塩化メチレン抽出物を25 mL三角フラスコに注ぎます。5 mLの溶液をスクリュートップキャップ付きの10 mLガラス遠心分離管に移します。窒素ガスの穏やかな流れの下でサンプルを乾燥させます。
    10. サンプルを2 mLのエタノール+ 0.1%ブチル化ヒドロキシトルエンで再構成し、ボルテックスしてサンプルを混合します。
    11. 0.8 mLの50:50(w:v)水酸化カリウムを水に加え、ボルテックスで15秒間混合します。
    12. サンプルを45°Cの水浴中で1時間ケン化し、15分ごとにボルテックスで短時間混合します。
    13. 0.1 mLの冷たい脱イオン水または逆浸透水を加えます。
    14. 1 mLのヘキサンを加え、ボルテックスで15秒間混合し、2分間遠心分離します(~1,300 × g)。
    15. パスツールピペットを使用して、上部のヘキサン層を新しいガラス試験管(12 x 75 mmまたは13 x 100 mm)に慎重にピペットで移動させます。
    16. 手順1.3.14と1.3.15をさらに2回繰り返し、2番目のチューブにヘキサンをプールします。
    17. プールしたヘキサンを窒素下で乾燥させ、100 μLのメタノール(MSグレード)で再構成します。サンプルをボルテックスで混合し、チューブのすべての側面で溶媒を旋回させます。20〜30秒間遠心分離し、サンプルを-80°Cの冷凍庫に少なくとも5分間置きます。
      注:サンプルは、このステップで翌日まで-80°Cで保存したままにすることができます。

2. 高速液体クロマトグラフィーによるサンプルの精製と定量

  1. C18(5 μm、4.6 x 250 mm)カラムと325 nmに設定されたUV-Vis検出器を使用して、HPLCシステム1を調製します。
  2. アセトニトリルと水の体積を別々に測定し、アセトニトリルに水を注いで、92:8アセトニトリル:水の移動相を調製します。混合溶液を真空ろ過して溶存ガスを除去します。
  3. HPLCシステム1の電源を入れ、必要に応じてHPLCで溶媒パージを実行し、流速を1 mL/分に少なくとも15分間設定して、システムを完全に平衡化します。
  4. 標準試料をHPLCシステムに注入します。
    1. レチノール濃度を定量するには、25 μLのC-23内部標準溶液を注入し、結果を3倍記録してサンプルと比較します。
    2. レチノール標準試料を注入して、フラクション収集とレチノール定量のガイドに使用されるシステムの正確な保持時間を決定します。
  5. HPLCシステム2を準備します(コンポーネントはシステム1と同じです)。両方のステップで 1 つの HPLC システムを使用する場合は、サンプルからの化合物のキャリーオーバーの可能性を最小限に抑えるために、一次精製に使用したカラムを 2 番目の同一のカラムに交換してください。
  6. システム 2 では、メタノールを真空フィルターでろ過し、HPLC 移動相をパージし、0.7 mL/分を 20 分間流して平衡化します。
  7. -80°Cの冷凍庫からサンプルを1つずつ取り出し、室温で1,300 × g で30秒間遠心分離します。
  8. 完全なサンプルをHPLCに注入し、ペレット状の材料を避けます。レチノールを定量化する場合は記録を開始します。
  9. 溶媒が検出器を通過するときに、レチノールピークを小さなガラス管(12 x 75 mmまたは13 x 100 mm)に集めます。ピークの中央部分を収集して純度を最大化し、通常は吸光度値が0.1吸光度単位を超える(図1)、サンプルのレチノール濃度に応じて調整できます。C-23 ピークが溶出するのを待って、記録を停止します。
  10. 穏やかな窒素流下でサンプルを乾燥させます。
  11. 乾燥したサンプルに100 μLのメタノール(MSグレード)を加え、すぐにキャップをします。溶液をチューブの側面で上下に回転させ、ボルテックスでサンプルを15秒間混合します。サンプルを-80°Cの冷凍庫に少なくとも5分間入れます。
    注:サンプルは、このステップで翌日まで-80°Cで保存したままにすることができます。
  12. -80°Cの冷凍庫からサンプルを1つずつ取り出します。1,300 × g で 30 秒間遠心分離します。
  13. ペレット状の材料を避けて、完全なサンプルをHPLCシステム2に注入します。
  14. レチノールピークが溶出したら、検出器を通過する溶媒を円錐形の底の小さなガラスバイアル(<1 mL)に回収し、サンプルバイアルを12 x 75 mmの試験管にそっとスライドさせます。
  15. 真空濃縮器の電源を入れ、コンデンサーを20分間冷まします。
  16. サンプルをカルーセルにバランスのとれた形で置き、 熱 設定をなしに、 真空 度を 05.1に設定し、蓋を閉めて 実行を押します。
    注:サンプルは通常、乾燥に10〜20分かかります。ガスクロマトグラフでは、サンプルからすべてのメタノールが除去されていることが重要です。
  17. 乾燥したら、HPLCバイアルをスクリューキャップの蓋付きの4 mLの琥珀色のバイアルに移し、4〜7 μLのヘキサンでサンプルを再構成します。
    注:これは通常7 μLですが、精製中にサンプルが低濃度であると判断されると減少します。肝臓サンプルははるかに濃縮されている可能性があるため、より大きな量で再構成します。75 ng/μLから400 ng/μLの間を目指します。
  18. 約75 ngのレチノールを注入するために必要なサンプルの濃度に基づいて、適切なシグナルを得るために、GC-C-IRMSに1〜5 μLを注入します。

3. GC-C-IRMS によるサンプル分析

  1. カラム(100%ジメチルポリシロキサン、非極性、15 m、0.25 mm ID、0.25 μmフィルム)、ヘリウム流速1.2 mL/minでGCを調製します。
  2. システム・チェックを実行して、漏れがないこと、およびIRMSソースが質量44、45、および46に適切に焦点を合わせていることを確認します。
    最初の注入として毎日 2 μL の 75 ng/μL 13C に富むレチノール標準試料を注入して、保持時間を決定し、システム性能を検証します。
  3. 集録ソフトウェアで、装置メソッドをロードし、サンプル の名前 を入力して、 サンプルの実行を押します。GC-C-IRMS システムは、インジェクション前のシステムセットアップルーチンを実行します。GC前面の緑色の Ready to Inject ライトが点灯したら、所定の量のサンプルをプログラム可能な温度気化PTVインジェクターに注入し、シリンジを取り外して、 スタート ボタンを押します。
  4. PTVインジェクターを PTVスプリットレスモードで操作し、ガードカラムをインジェクターインサートの上部に装着して、シミュレートされたオンカラムインジェクションを行います。インジェクタープログラムを初期温度 50 °C から開始し、1.05 分間保持し、14.5 °C/s の速度で 200 °C に上昇させ、200 °C で 1 分間保持し、14.5 °C/s で 300 °C に移行し、次の注入のために 50 °C に戻る前に、50 mL/min のヘリウム分割流量でインジェクターを 4 分間パージするように保持します。
  5. GCオーブンの温度を初期温度50°Cにプログラムし、1分間保持し、30°C/分から150°Cまで上昇させ、次に15°C/分から265°Cまで上昇させ、次に40°C/分で295°Cまで上昇させ、次に2.50分間保持してから、次の注入のために50°Cに冷却します。
  6. 各クロマトグラムが、スクロース(IAEA-CH-6)に対して校正された CO2 (純度 99.999%) の 3 パルスで開始することを確認します。取得ソフトウェアで結果にアクセスします。
  7. 各注入後、各クロマトグラムを検査して、レチノールピークが存在すること、および統合が適切であることを確認します。ソフトウェアを使用して、レチノールピークを可能な限り自動的に積分し、手動積分による潜在的なバイアスを最小限に抑えます。20 mV/sの標準の開始および終了傾斜検出設定を利用します。
    メモ:200 mV以下のピーク振幅は小さすぎて、 正確な13C比測定を提供できません。
  8. クロマトグラムデータをスプレッドシートプログラムにエクスポートします。サンプル名、ピーク保持時間、質量 45 でのピーク振幅、AT% などの重要なデータカテゴリを含めます。
    注: エクスポートされるデータは、定義されたエクスポート方法を使用して指定できます。δ値は解釈を容易にするために有益ですが、計算には必須ではありません。

4. ビタミンAの全身貯蔵量と肝臓濃度の計算

  1. レチノール同位体希釈方程式
    注:一部の研究者が使用する好ましい同位体バランス方程式と対応する表記法は、国際純粋応用化学連合16からの推奨事項に基づいています。一部の研究グループは、RID方程式で使用される因子の歴史的使用を維持しようとする表記法を使用していることに注意してください。また、因子や裏付けとなる文献は、研究デザイン、実験モデル、分析結果に応じて、TBSまたは肝臓VA濃度の計算に直接適用されるかどうかが異なる可能性があることにも注意する。
    1. 次の式に従って、燃焼後の 13C の CO2 の同位体存在量を使用して、血清レチノール TTR を決定します。
       figure-protocol-1    
      ここで、Fはトレーサー用量(Fa)、ベースラインでの血清レチノール(Fb)、および投与およびボディプールとの混合後の血清レチノール(Fc)の同位体存在量(同位体量画分としても知られる、略称「x」)です。使用される混合期間は、通常、ヒトの場合は約14〜21日ですが、特定の研究デザインに応じて、より短くなったり長くなったりします。
    2. RID式を使用して、次の基本式に従ってVA TBSを計算します。
      figure-protocol-2
      どこ
      figure-protocol-3
      注:吸収および貯蔵に使用される要因には、i)平衡時の 用量貯蔵 (用量吸収)が含まれ、健康な個人では通常75%から90%の間で推定されます。炎症が存在する場合は、推定値を下げることができます。ii) 用量保持;定数:e-kt;k = ln(2)/レチノールの半減期;子供の場合は32〜136日。大人の場合は140日);t = 投与からの日数 (通常は 14-21 日); 血清/肝トレーサーの分配:TTR血清/ TTR肝臓;混合期間中のVA摂取量で0.65〜0.9。0.9-.1 低トレーサー用量、制御された VA 摂取量、および空腹時サンプリングを使用する場合。
      figure-protocol-4
    3. 肝臓の重量と肝臓の VA TBS の割合を追加仮定して、肝臓の VA 濃度を計算します。
      figure-protocol-5
      どこ
      figure-protocol-6
      肝臓と体重の比率は、一般に年齢固有の定数として推定されます:乳児:4〜4.2%;子供:3%;成人:2.4%;肝臓のTBS画分は、ビタミンAの状態によって異なります。以前に使用された推定値は、限界または低い VA ステータスです: 0.5。適切な VA ステータス: 0.8-0.9。

結果

325 nmでモニターされた血清サンプルクロマトグラムの例は、プロトコルセクション2に示されています(図1)。使用する特定のシステムとカラムに応じて、レチノールの典型的な保持時間は 4-6 分、内部標準では 6-8 分です。緑色の網掛け領域は、不純物を最小限に抑えるためのレチノール画分の目標収集範囲を示しています。血清からのレチノールの抽出効率は通常 85% ≥ですが、ケン化母乳および組織サンプルの効率は平均 ~70-80% と低い傾向があります。HPLC精製中のメインオールトランスピークの直前または直後に、少量のレチノールシス異性体が溶出することが観察される場合があります。図1に示したサンプルでは、目立ったシス異性体は観察されませんでしたが、参考文献17の補足図1に見られます。多くの場合、追加の異性体は、2回目のHPLC精製(図示せず)またはGC分離中に分離されます(図2)。

標準試料、血清サンプル、およびブランクの GC-C-IRMS クロマトグラムの例を、プロトコルセクション 3 に示します(図 2)9。各サンプルには、IAEA スクロース標準 (IAEA-CH-6) に合わせて校正された 13C 濃縮の参照 CO2 ピークが含まれています。

1)参照CO2の同位体存在量 13C/全Cの実験的IRMS精度(CV%)は、安定性が0.012、直線性が0.031でした(それぞれn = 10)。2) レチノール標準は、日中安定性が 0.036、日中直線性が 0.022 でした (それぞれ n = 4)。3)実験は、スナネズミのベースラインおよび8つの食事治療グループ全体で0.073±0.061でした(9つのグループでn = 46)9。

以下は、得られた血清 GC-C-IRMS データを使用して、方法 4 の RID 式を使用して用量投与の 14 日後に決定された TBS および肝臓 VA 濃度を計算する方法の例です。

研究参加者の特徴:

年齢：4年間
体重：16.0キロ
Fa(2つの炭素標識と自然の存在量):0.11
Fb:0.010757
FC:0.011057
適用されたトレーサー用量:1.0μmol
投与からの時間:14日間
VA半減期:32日間
吸収：0.8
血清/肝臓中のTTRの比率(食事は管理されていません):0.9
肝臓のTBS画分:0.8

計算：

TTR = (Fc-F b)/(Fa-F c)
TTR = (0.0110568 - 0.010757) / (0.11 - 0.0110568) = 0.0030300213
1 / TTR = 1 / 0.0030300213 = 330.03

用量保持 = 半減期 32 日、サンプリング時間 14 日の e-kt
k = ln(2)/36 = 0.693147181 / 36 = 0.021660849
t = 14
e-kt = e-0.02166 x 14 = 0.738413073

figure-results-1

TBS = 1 × 330.03 x 0.8 x 0.738413073 × 0.9 = 175 μmol

肝臓のVA濃度の計算の場合:
肝臓重量(g)=1,000×体重(kg)×3%(小児推定値)
肝臓重量 = 1,000 x 16.0 x 0.03 = 480 g
figure-results-2
肝臓VA濃度=(175 / 480)x 0.8 = 0.29μmol / g

figure-results-3
図1:ヒト血清サンプルのHPLCクロマトグラム。 アイソクラティック移動相90:10 MeOH:H2O、325 nmで検出したHPLCシステム1レチノールピークは、~0.1を超える吸光度値(緑色の網掛け領域)について収集されます。内部標準 C-23 β-apo カロテノールは、このステップ中に血清レチノール濃度 (必要な場合) を定量するために使用されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-4
図 2:レチノール 13 C/12 C の測定を示す GC-C-IRMS クロマトグラム。 (A)レチノール標準、(B)血清から精製したレチノール、および(C)Gannonら9から適応したブランク注入のGC-C-IRMSクロマトグラム。3つのトレースは、質量44(12C16O2に相当)、45(13C16O2または12C16O17Oに相当)、および46(主に12C16O18Oに相当し、17Oの寄与の質量45を補正するために使用されます)です。200 秒前の 3 つの広いピークは、ショ糖 13C 標準物質に校正された CO2 参照ピークです。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

GC-C-IRMSを使用してレチノールの 13°C濃縮を測定するために説明されている方法は、食事介入、18 ビタミンA動態のモデリング、19、20、21 の臨床研究、またはVAステータスの推定を改善するためのRIDを組み込んだ集団研究を評価するための貴重なデータを提供できます22。

この試験では、生体試料から精製されたレチノールを、研究グレードのヘリウム(純度99.99999%>)によって温度勾配でGCカラムに運ばれ、試料中の残留不純物から分離します。レチノールを燃焼させてCO2 と水を形成し、水分を除去します。CO2 は IRMS に運ばれ、そこで質量 44、45、および 46 が測定され、δ と AT% は、スクロース標準 (IAEA-CH-6) に対してさらに校正された CO2 ガス基準と比較して測定されます。

注射用レチノールの調製では、再現性のある同位体比を達成し、徹底的な洗浄の間の分析プラットフォームの寿命を最大化するために、抽出されたレチノールは最高の純度でなければなりません。抽出に使用される溶媒は、入手可能な最高純度グレード (通常は MS グレード) である必要があります。抽出チューブ、パスツールピペット、HPLC注入バイアルなどのガラス器具はすべて、MS分析のために適切に洗浄するのが難しいため、新品にする必要があります。GCおよび燃焼カラムに蓄積する抽出物中の可塑剤を最小限に抑えるために、プラスチックではなくガラス管とピペットを使用することが重要です。

このサンプル分析ワークフローの変更は、特定の研究デザインとサンプリングソースに応じて行うことができます。たとえば、1つのHPLCシステムはレチノール精製に最適化できる可能性があります。私たちの経験では、これには移動相に水が必要であり、移動相勾配が必要になるか、GC-C-IRMS に注入する前にサンプル乾燥時間が長くなります。短いアイソクラティックメソッドを備えた2つのHPLCシステムを使用すると、GC-C-IRMSで明確なシグナルを取得しながら、分析要件のバランスが取れることがわかりました(図2)。LC-MS/MS を使用すると、RID サンプルの分析ワークフローがより合理化される可能性があります7。ただし、GC-C-IRMSの感度には、低用量と同位体標識量を使用できること、より長い時点でトレーサーを定量できること、サンプル濃縮度の低いサンプルを分析できるという明確な利点があります。

この方法の制限には、複数の機器が必要であること、熟練した技術的な取り扱い、サンプル前処理時間が長いことによるサンプルスループットの制約が含まれます。HPLC精製ステップではアイソクラティック法が利用されるため、自動フラクション収集機能を備えたHPLCを実装することで、各サンプルの調製に必要な工数を改善でき、分析種の保持時間が一定になります。この方法は、1つのHPLC精製のみを使用するように最適化できます。2つのシステムを並行して使用することで、スループットを向上させ、ヘキサンで再構成してGC-C-IRMSに注入する前にサンプルの乾燥を容易にします。

GC-C-IRMSは同位体比の決定に非常に感度が高いですが、適切なレチノールシグナルを得るには、より多くのサンプルレチノール質量が必要です。サンプル要件は、サンプル量とサンプルVA濃度の両方によって異なります。通常、75 ngのレチノールは強いピークをターゲットにしており、GCの移動と燃焼効率にばらつきがあります。実際には、最適な動作条件下で、サンプルで十分なシグナルが得られ、GC-C-IRMS注入は25ngと低くなっています。これは、少量(~0.4 mL)、レチノール濃度が低(~0.5 μmol/L)、抽出および精製手順でわずかな損失を伴う血清サンプルに相当します。RID法の分析開発において、大きな改善点はPTVインジェクターへの切り替えでした。開始温度が低いため、サンプルを運ぶヘキサンが急速に膨張するのを防ぎ、サンプルのオンカラム注入をシミュレートできます。カラムに直接注入すると、レチノールのシグナルが最大化されますが、ピーク形状がやや悪化し、メンテナンスが常時行われるという欠点があります。

RID 検査では、血清サンプルの代替品として母乳が提案されています。これは、VA11 の貯蔵量がほとんど少なかったザンビアの授乳中の女性で検証されています。高所得国や、食事摂取、食品強化、サプリメントなど、複数の VA 源を摂取する集団など、事前に形成された VA の摂取量が多い女性ではまだ検証されていません。

母乳 VA 評価には、VA ステータスの他の生化学的指標に比べていくつかの利点があります。瀉血専門医は必要なく、母乳の採取は通常、被験者にとって侵襲性が低いと考えられているため、母乳の採取は血液よりも簡単であることが多く、23。カジュアルな母乳サンプルの使用は便利で、必要なミルクは5 mLだけです。さらに、サンプルをすぐに処理する必要がないため、特に現場でのサンプル処理時間が短縮されます。ただし、脂肪とレチノールの濃度は前乳よりも後乳の方が高く、乳脂肪とレチノールの濃度は時間帯や最後の給餌からの間隔によって変化する傾向があるため、完全な母乳サンプルのサンプル収集の標準化は重要です1,24。カジュアルなサンプルの場合、レチノール濃度は乳脂肪 g あたりで最もよく表されます。乳脂肪は、理想的にはクリマトクリット法25を使用して収集直後に測定する必要があります。サンプルは光から保護する必要があります。HPLC分析用のアリコート(通常1〜5 mL)は、冷凍および解凍後の牛乳が均一ではないため、収集時に準備する必要があります。

肝臓における VA の 13C 濃縮を測定することが可能であり、興味深い 2 つの主要な状況があります。最も一般的な状況は、肝臓を採取する動物実験で 13C 標識レチノールを使用する場合です。計算された VA の TBS は、HPLC/UPLC によって決定された肝臓内の VA 濃度と比較されますが、肝臓貯蔵庫の 13C 濃縮は、トレーサーが長期貯蔵と比較して循環中にどのように分布しているかを決定するのにも役立ちます。さらに、いくつかの特殊な状況では、同意を与え、ラベル表示用量のビタミンA26,27を摂取したヒトから肝生検サンプルを取得することが可能です。これらのサンプルは、13C-レチノール混合の検証とテストにも役立ちます。肝臓サンプルの処理は、測定されたサンプルを無水硫酸ナトリウムで粉砕して水を捕捉し、組織を分解することから始まります。次に、濾紙を通して50mLの塩化メチレンで抽出します。画分を窒素下で乾燥させ、防腐剤として0.1%ブチル化ヒドロキシトルエンを添加したエタノールで再溶解します。サンプルはケン化され、母乳に使用されるのと同じ手順で抽出されます。

開示事項

著者には宣言すべき利益相反はありません。

謝辞

この研究は、NIH-R01 DC019357と IAEA 調整研究プロジェクト E43035 によって資金提供されました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
VPDB-LSVECスケール(スクロース)に遡る13C基準物質国際原子力機関IAEA-CH-6 国立標準技術研究所名称:RM 8542
アセトニトリル(HPLCグレード)フィッシャー・サイエンティフィック国連1648
エタノール(純粋な200プルーフ、無水、および99.5%)シグマ459836
ガラス製パスツールピペット任意
ガラス試験管任意
ヘリウム(研究の恩恵、(>99.9995%の純度)任意
ヘキサンシグマ178918
メタノール(MSグレード)VWRMSPP-A-456
モルタルとペステル、陶器任意
容積ピペット3-25およびマイクロ;LギルソンFD10002
容積式ピペット10-100およびマイクロ;LギルソンFD10004
容積ピペット50-250 µLギルソンFD10005
プラスディストレイプピペット100-1000およびマイクロ;LギルソンFD10006
水酸化カリウムフィッシャー・サイエンティフィック国連1813年
定性フィルターペーパー #1 150 mmワットマン1001-150
分離型煙突任意
硫酸ナトリウム、無水フィッシャー・サイエンティフィックS415-212
ボリュームフラスコ(50 mL)任意

参考文献

  1. Tanumihardjo, S. A., et al. Biomarkers of nutrition for development (BOND)-vitamin A review. J Nutr. 146 (9), 1816S-1848S (2016).
  2. Gannon, B. M., et al. Selected laboratory-based biomarkers for assessing vitamin A deficiency in at-risk individuals. Cochrane Database Syst Rev. 5 (5), CD013742(2025).
  3. Furr, H. C., et al. Stable isotope dilution techniques for assessing vitamin A status and bioefficacy of provitamin A carotenoids in humans. Public Health Nutr. 8 (6), 596-607 (2005).
  4. Lietz, G., et al. Current capabilities and limitations of stable isotope techniques and applied mathematical equations in determining whole-body vitamin A status. Food Nutr Bull. 37 (2 Suppl), S87-S103 (2016).
  5. Gannon, B. M., Tanumihardjo, S. A. Comparisons among equations used for retinol isotope dilution in the assessment of total body stores and total liver reserves. J Nutr. 145 (5), 847-854 (2015).
  6. Bausch, J., Rietz, P. Method for the assessment of vitamin A liver stores. Acta Vitaminol Enzymol. 31 (1-5), 99-112 (1977).
  7. Oxley, A., et al. An LC/MS/MS method for stable isotope dilution studies of β-carotene bioavailability, bioconversion, and vitamin A status in humans. J Lipid Res. 55 (2), 319-328 (2014).
  8. Preston, T. Existing and emerging technologies for measuring stable isotope labelled retinol in biological samples: isotope dilution analysis of body retinol stores. Int J Vitam Nutr Res. 84 (Suppl 1), 30-39 (2014).
  9. Gannon, B. M., et al. 13C natural abundance of serum retinol is a novel biomarker for evaluating provitamin A carotenoid-biofortified maize consumption in male Mongolian gerbils. J Nutr. 146 (7), 1290-1297 (2016).
  10. Green, M. H., Green, J. B. Use of the paired retinol isotope dilution test, but with a single isotope dose, to assess the impact of a vitamin A intervention on vitamin A stores in theoretical children with low stores. J Nutr. 154 (10), 3151-3156 (2024).
  11. Kaliwile, C., et al. Breast milk-derived retinol is a potential surrogate for serum in the 13C-retinol isotope dilution test in Zambian lactating women with vitamin A deficient and adequate status. J Nutr. 151 (1), 255-263 (2021).
  12. Howe, J. A., Valentine, A. R., Hull, A. K., Tanumihardjo, S. A. 13C natural abundance in serum retinol acts as a biomarker for increases in dietary provitamin A. Exp Biol Med (Maywood). 234 (2), 140-147 (2009).
  13. Sheftel, J., Gannon, B. M., Davis, C. R., Tanumihardjo, S. A. Provitamin A-biofortified maize consumption increases serum xanthophylls and 13C-natural abundance of retinol in Zambian children. Exp Biol Med (Maywood). 242 (15), 1508-1514 (2017).
  14. Gannon, B. M., et al. Comparison of total body vitamin A stores using individual versus population 13C-natural abundance of serum retinol in preschool children and women residing in six diverse African countries. J Nutr. 153 (4), 949-957 (2023).
  15. Tanumihardjo, S. A., Howe, J. A. Twice the amount of α-carotene isolated from carrots is as effective as β-carotene in maintaining the vitamin A status of Mongolian gerbils. J Nutr. 135 (11), 2622-2626 (2005).
  16. Coplen, T. B. Guidelines and recommended terms for expression of stable-isotope-ratio and gas-ratio measurement results. Rapid Commun Mass Spectrom. 25 (17), 2538-2560 (2011).
  17. Tanumihardjo, S. A., et al. Synthesis of 13C2-retinyl acetate and dose preparation for retinol isotope dilution tests. J Vis Exp. (222), e68535(2025).
  18. Gannon, B., et al. Biofortified orange maize is as efficacious as a vitamin A supplement in Zambian children even in the presence of high liver reserves of vitamin A: a community-based, randomized placebo-controlled trial. Am J Clin Nutr. 100 (6), 1541-1550 (2014).
  19. Gannon, B. M., Valentine, A. R., Davis, C. R., Howe, J. A., Tanumihardjo, S. A. Duration of retinol isotope dilution studies with compartmental modeling affects model complexity, kinetic parameters, and calculated vitamin A stores in US women. J Nutr. 148 (8), 1387-1396 (2018).
  20. Lopez-Teros, V., et al. The "super-child" approach is applied to estimate retinol kinetics and vitamin A total body stores in Mexican preschoolers. J Nutr. 150 (6), 1644-1651 (2020).
  21. Green, M. H., et al. Use of population-based compartmental modeling and retinol isotope dilution to study vitamin A kinetics and total body stores among Ghanaian women of reproductive age. Curr Dev Nutr. 8 (11), 104484(2024).
  22. Engle-Stone, R., et al. Filipino children with high usual vitamin A intakes and exposure to multiple sources of vitamin A have elevated total body stores of vitamin A but do not show clear evidence of vitamin A toxicity. Curr Dev Nutr. 6 (8), nzac115(2022).
  23. Stoltzfus, R. J., Underwood, B. A. Breast-milk vitamin A as an indicator of the vitamin A status of women and infants. Bull World Health Organ. 73 (5), 703-711 (1995).
  24. Ruel, M. T., Dewey, K. G., Martinez, C., Flores, R., Brown, K. H. Validation of single daytime samples of human milk to estimate the 24-hour concentration of lipids in urban Guatemalan mothers. Am J Clin Nutr. 65 (2), 439-444 (1997).
  25. Lucas, A., Gibbs, J. A., Lyster, R. L., Baum, J. D. Creamatocrit: simple clinical technique for estimating fat concentration and energy value of human milk. Br Med J. 1 (6119), 1018-1020 (1978).
  26. Furr, H. C., Clifford, A. J., Bergen, H. R. 3rd, Jones, A. D., Anderson, D. P., Olson, J. A. Vitamin A concentrations in liver determined by isotope dilution assay with tetradeuterated vitamin A and by biopsy in generally healthy adult humans. Am J Clin Nutr. 49 (4), 713-716 (1989).
  27. Haskell, M. J., et al. Assessment of vitamin A status by the deuterated-retinol-dilution technique and comparison with hepatic vitamin A concentration in Bangladeshi surgical patients. Am J Clin Nutr. 66 (1), 67-74 (1997).

再版と許可

タグ

A 13C A HPLC

この記事は公開されました

動画は近日公開

お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。