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方法論記事

その場でMTTベースの凍結切片イメージングを使用した肝細胞癌組織における代謝活性細胞の検出

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DOI:

10.3791/68575

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2025年10月31日

 ,  ,  ,  , 
1Gastroenterology Department, First Hospital of Quanzhou Affiliated to Fujian Medical University, 2Medical School, Huaqiao University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、MTTベースの凍結切片イメージングを使用して、肝細胞癌組織内の代謝活性細胞を検出するための簡単なプロトコルを提示します。この方法は、他の組織や臓器の活性細胞 をその場で 検出するためにも使用できます。

要約

先行研究を含む新たな証拠は、優れた代謝活性とストレス耐性を示す肝細胞癌 (HCC) 組織内の細胞の亜集団を浮き彫りにしています。これらの細胞は、腫瘍の進行と治療抵抗性の重要な推進力です。しかし、 in situ 生存細胞検出の既存の方法は、多くの場合、組織の完全性を損なったり、細胞生存率を変化させたり、技術的に要求が厳しい。この研究は、3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム臭化物(MTT)の不溶性ホルマザン結晶へのミトコンドリア依存性還元を通じて、HCC組織の代謝活性細胞を その場 で検出するための、新規で簡単な非破壊アプローチを提示します。組織断片サイズ(1 × 1 × 0.2 cm3)、培養条件(20%FBS、1 mg/mL MTT、断続的なスワーリングによる3時間のインキュベーション)、および凍結切片パラメータ(厚さ20 μm、4%PFA固定、およびDAPI対比染色)を最適化することにより、生存HCC細胞の空間マッピングが5時間以内に達成されました。この費用対効果の高いプロトコルは、特殊な機器を必要とせず、組織構造を維持するため、表面領域の生存率が高くストレス耐性のある細胞クラスターの空間的同定が可能になります。制限には、6 時間を超える進行性の生存率の低下と切片化中の結晶変位が含まれますが、これは FBS の補給と制御された凍結によって軽減できます。この方法は、治療抵抗性亜集団の単一細胞単離のための実用的なプラットフォームを提供し、HCC 微小環境研究を前進させます。

概要

肝細胞がん (HCC) は、がん関連死の世界の第 3 位の原因であり、高い不均一性と再発率を特徴としています1。この空間的および時間的不均一性により、腫瘍組織内の特定の細胞集団は、代謝、増殖、進行、ストレス耐性、および薬剤耐性において他の細胞集団よりも活発になります。HCC 組織内の生細胞の in situ 検出は、これらの細胞には増殖するサブクローン、治療抵抗性集団、および転移開始細胞が含まれているため、臨床的および生物学的に非常に重要です。このような生存細胞は、腫瘍の再発、免疫回避、および治療の失敗の重要な推進力として機能する可能性があります2。

しかし、現在の空間プロファイリング技術(空間トランスクリプトミクスなど)は特殊な機器を必要とし、高コストを伴いますが、従来のバルク分析では、生細胞の空間的不均一性と間質成分との動的相互作用が見落とされがちです3。たとえば、切除後の残留生存可能なHCC細胞は、解離した細胞系では忠実に再現できない明確な代謝プロファイルを示します4。したがって、空間分解検出技術の進歩は、生存腫瘍細胞とその微小環境の間の機能的クロストークを解明し、最終的には精密な治療戦略に情報を提供するために不可欠です。フローサイトメトリーや免疫組織化学(IHC)などの従来の方法は、HCCの生細胞を検出するために私たちのグループによって使用されてきましたが、それらは組織の解離または固定を必要とするため、空間的コンテキストが失われ、細胞間相互作用の分析が妨げられます5,6。したがって、生細胞の in situ 検出のための非破壊で高解像度の技術を開発することは、HCC 耐性メカニズムを解明し、精密治療を導くために重要です。

破壊的な処理を行わずにHCC組織の生細胞をその 場で 迅速に検出して表示するために、単純な3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム臭化物(MTT)ベースの組織培養法が開発されました。簡単に言えば、新鮮な薄い肝細胞癌組織(約1 × 1 × 0.2 cm3)を最初に、20%ウシ胎児血清(FBS)およびMTT(1 mg / mL)を含むDMEM培地で3時間培養しました。次に、4%パラホルムアルデヒド(PFA)固定とDAPI含有埋込後、OCT包埋凍結組織スライド(厚さ20μm)を明るい光または紫外線下で顕微鏡観察した。生細胞は紫、紫赤、または紫黒色を示します。このプロトコルを使用して、HCC組織内の生細胞を5時間以内に検出することに成功しました。一方、この方法は3Dマイクロアーキテクチャを維持し、ダウンストリームのマルチオミクス解析と互換性があり、シンプルで時間とコストに優しいです。ただし、この方法には一定の制限があります。洗浄、切片化、培養の多段階プロセスは、組織、特にこの研究のHCC組織などの高代謝サンプルにおいて、構造変形とアポトーシスを誘発する可能性があります。さらに、凍結切片スライスの厚さが増すと、顕微鏡観察の鮮明さと平坦性が損なわれます。

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プロトコル

すべての実験はヘルシンキ宣言に従って実施され、泉州第一付属病院の倫理委員会によって承認されました (No.FJMU IACUC2021257)。HCC組織は外科的に切除され、患者のインフォームドコンセントを得て福建医科大学付属の泉州第一病院で採取された。この実験では、白衣、使い捨てマスク、手袋の着用など、標準的な保護措置が必要です。

1.組織の準備

  1. 滅菌9cmのペトリ皿を氷の上に置きます。30 mLの氷冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を加えます。
  2. 外科的に切除したヒトHCC組織を直ちにPBSに移します。
  3. 皿を5秒間そっと回して、血液汚染物質を取り除きます。滅菌ピペットを使用してPBSを吸引します。
    メモ:3回繰り返します。
  4. ティッシュをペトリ皿の蓋に移します。
    注:ティッシュは、その後の取り扱いを改善するために、濡れていないペトリ皿の蓋に容易に付着します。
  5. 滅菌手術用ブレード(No.11)を使用して、組織を約1×1×0.2 cm3 の断片にトリミングします。
    注:フラグメントの長さと幅は変更できますが、深さは0.2cm未満にする必要があります。
  6. 断片を30 mLの氷冷PBSで満たされた新鮮な9 cm皿に戻します。
  7. 皿を5秒間そっと回して、血液汚染物質を取り除きます。滅菌ピペットを使用してPBSを吸引します。
    メモ:手順1.7を3回繰り返します。PBS(95°C、10分)で煮沸した1つの組織フラグメントをネガティブコントロールとして設定しました。すべての手順を無菌条件下で実行します。

2.組織培養

  1. グルコース(最終濃度= 4.5 g / L)およびL-グルタミン(最終濃度= 2 mM)を含む1.8 mLの完全培地DMEM(37°Cに予熱)を6ウェルプレートの各ウェルに加えます。次に、0.6 mL FBS(最終濃度 = 20% v/v)および0.6 mL MTTストック(最終濃度= 1 mg/mL)を6ウェルプレートの各ウェルに加えます。
  2. 滅菌鉗子を使用して組織断片をウェルに移します。
  3. 6ウェルプレートをインキュベーターに入れます。37°Cで5%CO2で3時間インキュベートします。
    注:30分ごとにプレートを3秒間静かに回転させます。組織断片の表面が紫色または紫黒に変わったら、インキュベーションを終了できます。

3. 終了と固定

  1. MTT培地を吸引します。組織片を氷冷の生理食塩水で洗浄します。
    注:5回繰り返します。
  2. 2 mLの4%中性緩衝ホルマリン(NBF)を6ウェルプレートの各ウェルに加えます。
  3. プレートを4°Cの冷蔵庫に1時間入れます。

4. 凍結切片

  1. 清潔な吸収紙で破片をやさしく吸い取ります。
  2. OCT化合物で満たされたクライオモールドに組織を入れます。
    注:組織がOCT化合物で完全に覆われていることを確認してください。
  3. 組織を-80°Cの低温冷蔵庫で20分間凍結します。
  4. 凍結ブロックを-20°Cのクライオスタットチャックに取り付けます。
  5. 組織表面が露出するまで、-20°Cで100μmの切片を切断します。
    注:組織表面は紫色のような色を示します。
  6. 接着剤でコーティングされたスライドを使用して20 μmのスライスを収集します。
    注:組織スライスは、紫、紫赤、または紫黒の色合いで存在する必要があります。
  7. スライスを室温で4%パラホルムアルデヒド(PFA)で2分間固定します。
  8. スライドをPBSで1分間優しくすすぎます。
    メモ:3回繰り返します。

5. 取り付け

  1. DAPI含有(最終濃度:1μg/mL)の封入剤を1滴塗布します。
  2. カバーガラスで覆います。
  3. マニキュアで端をシールします。
    注:エッジが密閉されたスライドは、顕微鏡検査をすぐに行わない場合、暗所で4°Cで保存できます。

6. 顕微鏡検査

  1. 明視野顕微鏡を使用して、紫、紫赤、または紫暗いホルマザン沈着物(生細胞)を明視野下で20×倍率で視覚化します。
  2. 蛍光顕微鏡を使用してUV照明下で青色DAPI(核)を検出します。
  3. 明視野チャネルと蛍光チャネルをマージして空間相関を行います。
    メモ: ここで使用するソフトウェアは NIS Element F (バージョン 4.00.06) です。

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結果

この研究は、組織構造を破壊することなく、HCC 組織内の代謝活性細胞を検出することに成功しました。まず、明視野画像(図1A)は、組織表面が密な細胞被覆とスライド全体に細胞の多層積みを示したことを示し、培養および処理を通じてHCC組織の構造的完全性が維持されていることを確認しました。特に、表層領域内の細胞クラスターは、生存細胞集団におけるミトコンドリア活性を示す、明確な赤紫がかったホルマザン沈着物を示しました。第二に、DAPI核対比染色は、蛍光画像内の細胞の位置と輪郭を簡単に特定できます(図1B)。これらの画像は、セクション全体で均一に無傷の核も示し、私たちのプロトコルによって達成された細胞構造の保存を確認しました。第三に、明視野画像(図1A)とそれに対応する蛍光画像(図1B)をマージした後、ホルマザン陽性細胞(紫-赤)とDAPI陽性核(青)の正確な共局在化により、生細胞をより簡単かつ正確に識別および区...

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ディスカッション

in situ生細胞検出の現在の方法論は、依然として多面的な制限に直面しています。増殖マーカーまたはアポトーシス関連タンパク質の同定に広く使用されているIHCおよび免疫蛍光法(IF)は、ホルムアルデヒド固定によって誘発される膜の完全性の破壊に苦しんでいます7。さらに、厚い組織切片への抗体の浸透は最適とは言えません8。カルセイン-AMなどの蛍光生存率プローブは、エステラーゼ活性生細胞をex vivoで標識するのに効果的ですが、酵素活性の変化と壊死領域への非特異的拡散により、低酸素HCC領域では特異性の低下を示します9。レーザーキャプチャマイクロダイセクション(LCM)は、生存可能な細胞クラスターの正確な分離を可能にしますが、低スループットで動作し、空間的コンテキストを犠牲にするため、細胞間コミュニケーションダイナミクスの研究における有用性が制限されます10

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開示事項

著者には開示すべき利益相反はありません。

謝辞

この研究は、厦門市科学技術局(No.3502Z20227197)、福建医科大学の科学研究のためのスタートアップ基金(2021QH1240)から資金提供を受けました。Xianying Zhang氏、Jingjing Zhou氏、Shaocong Weng氏(華僑大学)の技術支援に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
-80 & deg;C冷凍庫(アップライト)サーモフィッシャー・サイエンティフィックTSX60086V
クリーンベンチ(垂直層流)エアテックSW-CJ-1FD
CO2インキュベーター(165L)サーモフィッシャー・サイエンティフィックヘラセル VIOS 160i(例:51030400 / 51033559)
カバースリップ(24回;50mm、#1.5)CITOGLAS(シトテスト)0341-3610
培養用ペトリ皿(90mm)巣752001(例)
DAPI含有のマウントメディアビヨタイムP0131(5 mL/25 mL)
DMEM(高グルコース、ピルビン酸配合)インビトロジェン(Gibco)11995-065
FBS(資格取得、アメリカ出身)インビトロジェン(Gibco)A3160501
蛍光顕微鏡ニコンECLIPSE Ti2シリーズ
凍結マイクロトーム(クライオスタット)ライカCM1950
顕微鏡スライド(プレーン、25倍、75mm)CITOGLAS(シトテスト)0317-0001
MTT試薬(粉末)ビヨタイムST316
ネイルポリッシュ(透明)ビヨタイム—
NBF(中性緩衝ホルマリン)ビヨタイム—
OCTコンパウンドサクラ(サクラ・ファネテック)4583
光学顕微鏡(直立型)ニコンECLIPSE Ci系列(例:Ci-L)
PBS(500mL)ビヨタイムC0221A
PFA、PBS(固定剤)4%ビヨタイムP0099
ピペットチップ(1 mL、低結合)キルゲンKG1313-L
ピペットチップ(200 & micro;L)アクシゲン(コーニング)T-200-Y(バルク)/ T-200-Y-R-S(ラック式、滅菌)
ピペッター(単一チャネル)サーモフィッシャー・サイエンティフィックフィンピペットF2(レンジ専用の猫#)
メスヒスティックモデルは様々です(例:サプライヤーの参照100022208326)
ピンセットヒスティックモデルは様々です

参考文献

  1. Forner, A., Reig, M., Bruix, J. Hepatocellular carcinoma. Lancet. 391 (10127), 1301-1314 (2018).
  2. Sun, Y. F., et al. Dissecting spatial heterogeneity and the immune-evasion mechanism of CTCs by single-cell RNA-seq in hepatocellular carcinoma. Nat Commun. 12 (1), 4091(2021).
  3. Calderaro, J., Couchy, G., Imbeaud, S. Histological subtypes of hepatocellular carcinoma are related to gene mutations and molecular tumour classification. J Hepatol. 67 (4), 727-738 (2017).
  4. Finn, R. S., Qin, S., Ikeda, M. Atezolizumab plus Bevacizumab in unresectable hepatocellular carcinoma. N Engl J Med. 384 (20), 1894-1905 (2020).
  5. Lin, C. C., Zhou, J. P., Liu, Y. P. The silencing of Pokemon attenuates the proliferation of hepatocellular carcinoma cells in vitro and in vivo by inhibiting the PI3K/Akt pathway. PLoS One. 7 (12), e51916(2012).
  6. He, J. The lactate receptor HCAR1 drives the recruitment of immunosuppressive PMN-MDSCs in colorectal cancer. Nat Immunol. 26 (3), 391-403 (2025).
  7. Zhou, H. G., Guo, M. Y., Li, J. Y. Hypoxia-triggered self-assembly of ultrasmall iron oxide nanoparticles to amplify the imaging signal of a tumor. J Am Chem Soc. 143 (4), 1846-1853 (2021).
  8. Baker, A. M., Huang, W. N., Wang, X. M. Robust RNA-based in situ mutation detection delineates colorectal cancer subclonal evolution. Nat Commun. 8 (1), 1998(2017).
  9. Morrison, J. K. Single-cell transcriptomics reveals conserved cell identities and fibrogenic phenotypes in zebrafish and human liver. Hepatol Commun. 6 (7), 1711-1724 (2022).
  10. Qi, L., Liang, J. Y., Li, Z. W. Deep learning-derived spatial organization features on histology images predicts prognosis in colorectal liver metastasis patients after hepatectomy. iScience. 26 (10), 107702(2023).
  11. Aizarani, N., Saviano, A. A human liver cell atlas reveals heterogeneity and epithelial progenitors. Nature. 572 (7768), 199-204 (2019).
  12. Tasdogan, A., Faubert, B., Ramesh, V. Metabolic heterogeneity confers differences in melanoma metastatic potential. Nature. 577 (7788), 115-120 (2020).
  13. Guo, D. Z. Single-cell tumor heterogeneity landscape of hepatocellular carcinoma: Unraveling the pro-metastatic subtype and its interaction loop with fibroblasts. Mol Cancer. 23 (1), 157(2024).

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