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方法論記事

大腸菌からの有毒ヌクレアーゼの過剰発現と精製

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DOI:

10.3791/68577

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2025年8月29日

 , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, College of Charleston

この記事について

サマリー

この記事では、C41(DE3)発現系で毒性ヌクレアーゼである組換えNsp15を過剰発現し、その後、アフィニティーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを使用してタグ付きタンパク質を精製する方法論について説明します。これらのプロトコルは、他の困難な有毒タンパク質にも適応できます。

要約

大腸菌は、組換えタンパク質を産生するための発現系として広く利用されています。しかし、ヌクレアーゼなどの一部の種類の組換えタンパク質は、細胞のDNAまたはRNAに対する酵素活性により、大腸菌で組換え的に過剰発現するのが難しい場合があります。このような毒性作用は、成長の遅さやタンパク質の収量の低下につながる可能性があります。そのような例の1つは、コロナウイルス由来のエンドリボヌクレアーゼNsp15であり、野生型(WT)ガンマコロナウイルスNsp15の収量は、触媒的に不活性なNsp15よりもはるかに低くなります。この問題に対処するために、C41(DE3)細胞と同日シングルコロニースターター培養を使用して毒性を低減しました。N末端6xHisタグを含む組換えNsp15を過剰発現させ、コバルトベースのアフィニティークロマトグラフィーとそれに続くサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を使用して精製しました。得られた精製タンパク質の収率は、生化学的アッセイおよびクライオ電子顕微鏡構造研究に十分です。このアプローチは、毒性作用を軽減し、さらなる研究分析のために満足のいくタンパク質収量を達成するのに効果的であることが証明されています。

概要

大腸菌 (E. coli) は、組換えタンパク質の生成に広く使用されている細菌です。BL21(DE3)およびその誘導体を含む多数の変異株が、標的タンパク質を発現するために開発されています1。このプロセスは通常、コードされたバクテリオファージT7 RNAポリメラーゼによって駆動され、lacレプレッサー1,2,3を放出することによってlacオペロンを活性化するラクトースの類似体であるイソプロピルβ-D1-チオパラクトピラノシド(IPTG)によって誘導されます。非加水分解性であるため、mRNAの発現が連続し、タンパク質産生が増加します3。

このタイプのシステムは多くのタンパク質にとって便利で一貫していますが、一部の種類の組換えタンパク質は大腸菌に毒性を誘発し、タンパク質収量の低下につながります。細菌に悪影響を与える組換えタンパク質の存在による毒性は、誘導前の漏出発現または誘導時の細菌へのストレスによる可能性があります3,4。その結果、細菌の増殖速度と生存率が低下します5。リーキー発現の抑制は、有毒なタンパク質の発現に成功する上で重要な役割を果たすことができます。pLysSプラスミド(すなわち、BL21(DE3)pLysS、C41(DE3)pLysSなど)を持つ大腸菌の発現株は、誘導前にT7ポリメラーゼを阻害するT7リゾチームを発現することにより、リーキー発現を抑制します6,7。C41(DE3)およびC43(DE3)株などの他の株には、mRNAレベルを低下させることによってT7ポリメラーゼの活性を低下させ、lonおよびompTプロテアーゼ1,4,8,9,10を除去する変異が含まれています。リーキー発現を抑制するか、組換えタンパク質産生の速度を低下させる(T7ポリメラーゼ調節または温度低下を介して)は、有毒タンパク質の収量を増やすのに役立ちます1,9。

ヌクレアーゼは、細胞DNAまたはRNAに対する酵素活性により、大腸菌発現系を使用する場合、毒性があり、発現が困難なタンパク質であることがよくあります1。たとえば、コロナウイルスや他のニドウイルスに含まれるエンドリボヌクレアーゼNsp15は細菌に対して毒性があり、その結果、成長速度が遅くなり、収量が低くなります11,12,13,14,15,16,17。Nsp15は、ウイルスRNAのウリジンの3'を切断する触媒作用により、組換え発現時にそれ自体と細胞のmRNAの両方に作用すると考えられており、その結果、代謝と組換えタンパク質発現の調節不全が生じます11,14。Nsp15の場合、酵素活性にはオリゴマー化が必要です。ベータコロナウイルス(SARSやSARS-CoV-2など)の以前の研究では、Nsp15は、酵素が主に溶液中でホモヘキサマーにオリゴマー化し、モノマー型は不活性であることが実証されました16,18,19,20。モノマーのみを形成するように変異すると、収量の有意な増加が見られました14。さらに、触媒トライアド内の触媒残基の1つをアラニンに変異させると、WTと同じ条件下で発現が改善することが観察され、大腸菌に対するNsp15の毒性がヌクレアーゼ活性によって引き起こされることをさらに裏付ける13,16,17。このプロトコルでは、WTガンマコロナウイルス(感染性気管支炎ウイルス)Nsp15と、触媒ヒスチジン残基(H223A)の1つを変異させることによって達成された触媒死バージョンとの間の収量の違いを示します。

ここでは、C41(DE3)発現系で組換えNsp15を過剰発現し、その後、アフィニティークロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーによるタンパク質精製を行うための段階的な方法論について説明します。コバルトベースの固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)を備えたN末端6x Hisタグを使用して、タンパク質を単離します。さらに精製をSECを介して実行し、オリゴマー状態によってNsp15を分離し、活性ヘキサマー種を単離します。このアプローチは、生化学的および構造的研究のために有毒なヌクレアーゼを過剰発現および精製する方法を提供します。

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プロトコル

1. 緩衝液と試薬の準備

  1. 過剰発現試薬
    1. 16 gのトリプトン、10 gの酵母抽出物、5 gの塩化ナトリウム(NaCl)、および900 mLの脱イオン水を2 Lのバッフルフラスコに入れて、1 Lの2xTY培地を調製します。フラスコを液体サイクルで少なくとも30分間オートクレーブします。
      注:精製ごとに少なくとも2Lの2xTY培地が必要です。
    2. プラスミドに適切な抗生物質ストックを調製します。Nsp15-pET-14bの場合、15 mLの円錐形チューブに1.5 gのアンピシリンを脱イオン水で溶解して、15 mLの100 mg / mLアンピシリンを作製します。抗生物質ストックは、必要になるまで-20°Cで保存します。
    3. 2.5 gのトリプトン、1.25 gの酵母抽出物、2.5 gのNaCl、3.75 gのアガロース、および250 mLの脱イオン水を500 mLのガラス瓶に混ぜ合わせて、250 mLの溶原性ブロス(LB)寒天培地を調製します。液体サイクルで少なくとも30分間オートクレーブ滅菌して溶液を滅菌し、触ると温かくなるまで冷却します。
    4. 25 mLの温かいLB寒天培地を滅菌した250 mL三角フラスコ(プレートあたり25 mL)に移すことにより、アンピシリンを添加したLB寒天プレートを調製します。培地25 mLごとに25 μLの100 mg/mLアンピシリンを加え、旋回して内容物を結合します。血清学的ピペットを使用して、25 mLの培地混合物を滅菌プラスチックシャーレに加えます。気泡の導入を避けてください。
      1. 実験台を20%エタノールで拭き、ブンゼンバーナーに火をつけてプレートを注ぐ間、無菌性を維持することで汚染を防ぎます。
      2. プレートを冷ましてから、さらに使用するまで4°Cで保管してください。
    5. 15 mLのコニカルチューブに3.574 gのIPTGを脱イオン水で溶解して、15 mLの1 M IPTGを調製します。必要になるまで-20°Cで保管してください。5 mLのアリコートを3回分注することで、凍結/解凍サイクルを繰り返すことを避けます。
  2. 精製試薬
    注:すべての試薬は、精製の少なくとも1日前に調製する必要があります
    1. 250 mLの溶解バッファー(50 mM Tris pH 8.0、150 mM NaCl、5%グリセロール、5 mMイミダゾール)を調製し、4°Cで保存します。
    2. 15 mLの溶出バッファー(50 mM Tris pH 8.0、150 mM NaCl、5%グリセロール、250 mMイミダゾール)を調製し、必要になるまで4°Cで保存します。
    3. 250 mLの切断バッファー(50 mM HEPES pH 7.5、150 mM NaCl、5%グリセロール)を調製し、必要になるまで4°Cで保存します。
    4. 1 LのSECバッファー(20 mM HEPES pH 7.5、150 mM NaCl、5 mM MnCl2)を調製し、真空ろ過を使用して0.22 μm PESフィルターでろ過します。FPLCで4°Cで保存します。
    5. 15 mLのコニカルチューブに3.595 gのAEBSFを脱イオン水で溶解して、15 mLの4-(2-アミノエチル)ベンゼンスルホニルフッ化塩酸塩(AEBSF)を調製します。1.5 mLの微量遠心チューブに1 mLのアリコートを作り、必要になるまで-20°Cで保存します。
    6. オプション:200 μL のストック溶液(250 mM Tris pH 6.8、8% SDS、0.1% ブロモフェノールブルー、40% グリセロール、100 mM DTT)を 400 μL の脱イオン水中で希釈して、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ゲルローディングバッファーマスターミックスを調製します。
    7. 精製を追跡するためにゲルサンプルチューブを準備します。30 μLの1xローディングバッファーを各チューブに移します。
    8. 30 gのTris塩基、144 gのグリシン、および20 gのSDSを1000 mLの脱イオン水に溶解して、1 Lの10x Tris-Glycineランニングバッファーを調製します。1x溶液の場合、10x溶液の100 mLを1 Lボトルに入れた900 mLの脱イオン水で希釈します。さらに使用するまで、両方の試薬を室温で保管してください。

2. Nsp15の過剰発現

注:汚染のリスクを防ぐために、すべての試薬と材料はできるだけ無菌に保つ必要があります。

  1. 変換
    1. C41(DE3)大 腸菌 細胞を-80°Cから取り出し、氷上で10分間解凍します。1 μLのプラスミドDNAをC41細胞を含むチューブにピペットで入れます。氷の上に30分間座ってインキュベートさせます。
      注:プラスミドの濃度は異なる場合がありますが、ここで説明するデータでは、形質転換ごとに10〜20 ngのDNAが添加されました。C41(DE3)細胞の市販プロトコルでは、形質転換ごとに10〜50ngのDNAを推奨しています。このプロトコルは、T7プロモーターシステムを使用するあらゆるプラスミドに適用できます。しかし、ここでは、N末端6xHisタグおよびトロンビン切断部位に続くTEV部位を持つ、コドン最適化Nsp15をコードする以前に公開されたpET14bプラスミドは、SARS-CoV-2 Nsp15をIBV Nsp15配列に置き換えることによって修飾されました(GENBANK:WIL95322.1、5989-6324)19。
    2. チューブを42°Cのヒートブロックに45秒間置き、細胞に熱ショックを与えてプラスミドを取り込みます。チューブを氷上で2分間インキュベートします。
    3. 200 μLの回収培地(SOCまたは他のリッチ培地)をC41(DE3)細胞とプラスミドを含むチューブにピペットで入れます。37°Cで210rpmで1時間振とうします。
    4. アンピシリンを添加したLB寒天プレートを4°Cから取り出し、37°Cに設定した非振とうインキュベーターに入れます。
    5. 寒天プレート上の細菌をピペット処理します。滅菌スプレッダーを使用して、細胞を寒天プレートに広げます。プレートを37°Cに設定した非振とうインキュベーターに入れ、14〜16時間成長させます。

3. 成長

  1. シングルコロニーピッキング
    注:対数成長期の細胞に接種するために、一晩のスターター培養ではなく、同日シングルコロニースターターを使用しました。一晩培養の場合、細胞は通常、特に有毒なタンパク質で静止期または死期にあります。さらに、培養時間が長くなると、汚染物質や変異体が有毒なヌクレアーゼを凌駕する可能性があります。
    1. 培養物1Lごとに50 mL滅菌三角フラスコを1つ使用し、さらにスターターを2〜3個追加します。フラスコの1つに、光学濃度(OD)チェック用の星のラベルを付けます。このフラスコから収集されたODは、フラスコ間に視覚的な違いがない限り、成長全体を表します。
      注:三角フラスコは、15 mLスターターチューブよりも優れた通気性を提供することがわかりました。
    2. 10 mL x N 個のスターターの容量を使用して、2xTY と適切な抗生物質のマスターミックスを作成します。4 Lの成長のために、6つのスターターカルチャーを作ります。マスターミックスは、60 μLのアンピシリンストック(-20°Cから解凍)と60 mLの2xTY(1:1000希釈)です。旋回して混合し、各三角模様に10 mLを分注します。
    3. 変換されたプレートをインキュベーターから取り出します。滅菌つまようじまたはピペットチップを使用して、プレートから単一の単離されたコロニーを摘み取ります。コロニーの入ったつまようじを培地の入ったフラスコに移します。各フラスコにつまようじが入るまで繰り返します。
    4. 接種したスターターフラスコを210 rpm、37°Cの振とうインキュベーターに入れます。スターターフラスコを~5〜7時間成長させます。
  2. 培養接種
    1. 5時間後、マイクロキュベットと分光計を使用して、星でマークされたフラスコの600 nm(OD600)のODを確認します。培養物1 mLを取り出し、フラスコからマイクロキュベットに移します。OD600 が0.8-1.0に達するまで、定期的に測定を繰り返します。
    2. 接種の30分から1時間前(OD600 が0.4に達した場合)に、2 L 2xTYフラスコを37°Cで温めます。温め培地は、スターター培養を接種した後のラグタイムを短縮します。
    3. 100 mg/mLのアンピシリンストックを-20°Cから解凍します。目標OD600 に達したら、1 mLの100 mg/mLのアンピシリン(1:1000希釈)を加えて、1 Lの2xTY培地を含む4つの2 Lフラスコを調製します。
    4. 接種するには、1つのスターターフラスコの内容物を1つの2 Lフラスコに注ぎます。各2Lフラスコが接種されるまで繰り返します。細胞の採取を容易にするために、つまようじをフラスコに注ぐことは避けてください。
    5. 接種した2 Lフラスコを振とうインキュベーターに210 rpm、37°Cで3時間入れてから、最初のOD600をチェックします。
  3. IPTGによる誘導
    1. 血清ピペットでフラスコから1 mLの培地を取り出して、OD600 を確認します。OD600 が0.8-1.0に達するまで繰り返します。
    2. 目標OD600 に達したら、1 mLの1 M IPTGを添加して最終濃度1 mM(-20°Cから解凍)にして過剰発現を誘導します。
    3. 2 Lフラスコを210 rpm、16°Cの振とうインキュベーターに移し、一晩誘導します(14〜16時間)。
      注:温度が低いと、大 腸菌 細胞の増殖が遅くなり、タンパク質産生とヌクレアーゼ活性が低下することで毒性が軽減されます。
  4. 収穫
    1. 誘導フラスコを振とうインキュベーターから取り出し、内容物を別々の1 L遠心分離機ボトルに注ぎます。脱イオン水を使用してボトルのバランスを取ります。細胞を4500 x g で4°Cで10分間スピンダウンします。
    2. 上清を取り出し、へらを使用してペレットを50 mLのコニカルチューブに移します。ペレットを1つの円錐形のチューブに結合します。さらに使用するまで-80°Cで保管してください。

4. Nsp15精製

注:すべてのバッファーとチューブは氷の上に保管する必要があります。すべての遠心分離ステップは4°Cで実行する必要があります。次のプロトコルは、Hisタグ付きタンパク質を想定しています。

オプション:各ステップの後、ゲルサンプルを採取して精製の進行状況を追跡できます。

  1. 細胞溶解と溶解物の清澄化
    1. ペレット1.2gごとに2mLの溶解バッファーを加えることにより、細菌ペレットを再懸濁します。プロテアーゼ阻害剤として、溶解バッファー10 mLごとに100 μLの1 M AEBSFを加えます。4 Lの複合ペレットを使用する場合は、100 μLのDNase Iを添加して、最終濃度を200 Uにします。
      注:Lあたり1つのEDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤をプロテアーゼ阻害剤として置き換えることができます。
    2. チューブの内容物を30秒間短時間渦巻きさせ、ペレットとバッファーを混合させます。渦状ペレットをDounceティッシュグラインダーに移します。緩い乳棒で、内容物を均質化します(~10ストローク)。
    3. 均質化されたサンプルを超音波処理のために金属ビーカーに移します。
      1. 最大のサンプルが得られるようにするには、元のペレットを含むチューブを5 mLの溶解バッファーですすぎ、チューブを短時間ボルテックスします。内容物をDounceホモジナイザーに注ぎ、~5ストロークを適用してから、超音波処理ビーカーに移します。
    4. 金属ビーカーに75 μLのTriton X-100を加えて、膜の溶解と可溶化を助けます。金属ビーカーを氷浴に入れて、超音波処理中にサンプルが冷たく保たれるようにします。
    5. 超音波処理プローブを金属ビーカーに入れ、サンプルを2秒ごとにパルスで6分30秒間超音波処理し、70%で増幅します。
      注意: 超音波処理器プローブが同封されていない場合は、聴覚保護具を使用してください。
    6. 血清学的ピペットを使用して、ライセートを遠心分離管に移します。同じチューブに、新鮮なプロテアーゼ阻害剤として1:100の希釈で1M AEBSFを加えます。26,915 x g で50分間遠心分離してライセートを清澄化します。
  2. 重力ろ過によるアフィニティークロマトグラフィー
    注:コバルト樹脂は、ニッケル樹脂と比較して非特異的金属バインダーを大幅に減少させます21。
    1. 超音波処理中に、2 mLのコバルト樹脂スラリーを取得し、新しい円錐形のチューブに25 mLの溶解バッファーで再懸濁します。再懸濁した樹脂を500 x gで5分間遠心分離します。遠心分離後、樹脂を失わないように注意しながら上清を注ぎます。
    2. 2回の別々の25 mL溶解バッファー洗浄を繰り返し、続いて遠心分離します。バッチ結合の準備ができるまで、最後の洗浄の上清を注がないでください。準備ができたら、最後のレジン洗浄から溶解バッファーを注ぎ、10 mLの新鮮な溶解バッファー(1 mLのレジンあたり10 mLのバッファー)でレジンを再懸濁します。
    3. 可溶性画分をチューブに加え、6x Hisタグ付きタンパク質をロッカー上の樹脂に4°Cで45分間バッチ結合させます。
      注:バッチ結合量が50 mLを超える場合は、4°Cで非常に遅い速度で攪拌バーを備えた250 mLビーカーでこのステップを実行します。溶解バッファーを使用してこのステップを実行するときは、すべての樹脂をビーカーに移します。
    4. バッチ結合後、内容物を重力ろ過カラムに注ぎ、125 mL三角フラスコに流れを回収します。フラスコ内の内容物は、樹脂に結合しなかったタンパク質でなければなりません。Hisタグ付きNsp15が樹脂に結合します。別のフラスコを使用して、血清学的ピペットを使用して、8 x 25 mLのバッファーで樹脂を少なくとも200 mL(元の容量の~5倍)で洗浄します。
      注:バッファーは、レジンベッドを乱すのを防ぐために、カラムの中央ではなく、カラムの側面にゆっくりと追加し、洗浄が非効率になったり不均一になったりするのを防ぎます。
  3. タンパク質溶出
    1. Hisタグ付きNsp15を溶出バッファーで3回の溶出で溶出します。溶出1および2は2 mLの溶出であり、溶出3は1 mLの溶出です。
    2. ブラッドフォード試薬を水中で1:1に希釈することにより、「迅速で汚れた」ブラッドフォードアッセイを実行します。各溶出液10 μLをチューブに移し、反転させて混合します。溶液はタンパク質の存在下で青色に変わるはずです。色の変化を評価して、溶出液の組み合わせ方法を決定します。
      注:溶出1と2が強く、溶出3が弱い場合は、溶出1と2を組み合わせて続行します。すべてが弱い場合は、3つのチューブをすべて組み合わせます。
  4. タンパク質濃度とタグ切断
    1. 結合した溶出サンプルを30 kD MWCO濃縮器(または目的のタンパク質に適したサイズ)に移します。タンパク質を3,000 x g で10分間遠心分離して≤2 mLに濃縮します。濃縮したサンプルを2mL微量遠心チューブに移します。必要に応じて、切断バッファーを使用して最終サンプル量を2 mLに上げます。
    2. メーカーの指示に従って、使い捨ての脱塩カラム(PD-10カラムなど)を準備します。2 mLのサンプルをカラムに加えます。カラムを清潔な50 mLコニカルチューブに入れ、1,000 x g で2分間遠心分離して溶出します。
      注:このステップは、MWCO濃縮器を使用してバッファー交換を行う際に、トロンビン切断を妨げるイミダゾールを迅速に除去します。
    3. 溶出液に、β-MeとCaCl2を加え、それぞれ2 mMの最終濃度にします。50 μLの1 U/μLトロンビンストックを加えます。すべての成分を添加した後、チューブを加振器の上に直立させ、穏やかに振とうしながら室温で4時間インキュベートさせます。
      注:4°Cでの一晩の切断は、一部のタンパク質で機能する場合があります。Nsp15の収率の改善は、一晩の4°C切断と比較して、RTで4時間の切断で観察されました。
    4. 重力ろ過カラムを切断バッファーで再平衡化します(25 mLの切断バッファーで3回洗浄します)。ストップコックが閉じていることを確認し、樹脂が乾燥しないように5 mLの切断バッファーを追加します。切断期間中はカラムを4°Cで保存します。
  5. 切断されたHisタグタンパク質と切断されていないタンパク質から切断されたタンパク質を分離する
    1. 血清学的ピペットを使用して、切断反応を樹脂に直接慎重にピペットで留め、溶出液を15 mLのコニカルチューブに集めます。
    2. 樹脂を2 mLの切断バッファーで洗浄し、同じ15 mLチューブに集めます。合計2回の洗浄を繰り返します。終了したら、AEBSFをチューブに加えてトロンビンをクエンチし、最終濃度10 mMを得る。
    3. リパスサンプルを新しい30 kD MWCO濃縮器に移します。タンパク質を3,000 x g で10分間遠心分離することにより、タンパク質を≤500 μLまで濃縮します。濃縮サンプルを0.5 mL微量遠心チューブに移します。
  6. サイズ排除クロマトグラフィー
    1. メーカーの仕様に従って、S200 増量分析カラム(または目的のタンパク質に適したその他のサイジングカラム)を実行します。SECバッファーで平衡化し、FPLC画分サイズを500 μLに設定します。
    2. 選択したフラクションチューブをピークから新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに移し、各フラクションに2.5 μLの1 M DTT(最終濃度5 mM)を加えて、精製されたNsp15を還元したままにします。
    3. ナノ分光光度計を使用して、各画分の A280 値を測定します。測定値を収集する前に、SECバッファーで装置をブランクします。精製したNsp15サンプルは、さらに使用するまで4°Cで保存します。
  7. オプション:精製チェック
    1. ゲルサンプルチューブを95°Cのヒートブロックで10分間加熱します。加熱後、チューブを短時間遠心分離して、結露を回転させます。サンプルを4〜20%染色のないMini-Protean TGXゲル/秒にロードし、300 Vで17分間実行します。ゲルを画像化して純度を確認します。

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結果

ヌクレアーゼとしてのNsp15の毒性により、スターター培養物が0.8〜1.0のOD600 に達するには、通常、合計~7時間が必要でした。接種後、誘導のための0.8〜1.0の同じ最適OD600 には、通常、合計3~5時間が必要でした。この場合、倍加時間は~1時間であるように見えました。Nsp15の触媒死変異体が発現したとき、大 腸菌 細胞の倍増は正常に見え(~20分)、ヌクレアーゼ活性が毒性の原因であるというさらなる証拠(図1A)。

一晩の誘導後、通常、2 L WT増殖あたり6〜9 gの湿式重量細胞ペレットを回収しました。さまざまなNsp15変異体による多くの異なる成長にわたって、ペレットが小さいほどヌクレアーゼ活性が高いと相関することが観察されました。触媒死Nsp15の場合、2L増殖あたり~18〜30gのはるかに大きなペレットが得られました。一緒に、これはヌクレアーゼ活性が発現中に毒性につながることをさらに裏付けていますが、資源の制限のためにウェスタンブロットの...

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ディスカッション

我々は、有毒なヌクレアーゼの大腸菌での過剰発現に成功し、アフィニティーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを使用した精製をもたらす詳細なプロトコルを提示しました。オーバーナイトスターター培養の代わりに、同日10 mLシングルコロニースターター培養を実施することで、増殖時間と増殖全体でのタンパク質収量の一貫性が向上しました。組換えタンパク質の毒性を管理するために、T7ポリメラーゼ活性を低下させる変異を含むC41(DE3)細胞を使用することを選択しました1,4,8,9,10。このプロトコルを最適化または適応させる場合、Rosetta2、C43(DE3)、またはpLysS株における目的のタンパク質の発現をテストする価値がある場合があります...

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開示事項

著者らは利益相反は報告していない。

謝辞

この研究は、チャールストン大学自然環境科学部のスタートアップ資金、チャールストン大学の学部研究および創造的活動の夏期学部研究と教員の助成金、およびP20GM103499のSC INBRE DRPサブアワードによって資金提供されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.22 & マイクロ;m PES, 滅菌剤, 低タンパク質結合, フィルターシステム, 1 Lコーニング431098
AEBSFセリンプロテアーゼ阻害剤ゴールドビオ30827-99-7
寒天、細菌学アムレスコJ637
ÄKTA go 浄化システムサイトバ29383015
Amicon Ultra 15 mL、30 kDa MWCO 濃縮器ミリポールUFC903024
アンピシリンナトリウムゴールドビオA-301-25
・・バッフルシェイクフラスコナルジーン F0527
卓上遠心分離機エッペンドルフ 5920R型
バイオフォトメータープラスエッペンドルフE-BP6132
ウシトロンビンバイオファーム91-030
ブラッドフォード色素試薬ボストンバイオプロダクツBPA-200
ブロモフェノールブルーシグマ・アルドリッチ114931
塩化カルシウムシグマ・アルドリッチC4901
デジタルドライバスバイオラッド1660562
使い捨てスプレッダー、L字型MedSupplyパートナー62-1014-1
ジチオスレイトールゴールドビオ27565-41-9
ウシ膵臓由来のDNaseIシグマ・アルドリッチD4527
Douceティッシュグラインダー、40 mLウィートン357546
エコノカラムクロマグトグラフィーカラムバイオラッド737-1532
エンデューロミニミックス章動ミキサーラボネットS0600
エタノールシグマ・アルドリッチ459844
Excella E25R Inc/Ref シェーカーエッペンドルフNB-E25R型
ファストペットV2ラボネットP2000
Fiberlite F10-4x1000 LEX固定角ローターサーモフィッシャーサイエンティフィック096-041075
Fiberlite F21-8x50y 固定角ローターサーモフィッシャーサイエンティフィック096-084275
ゲルドックEZイメージャーバイオラッド1708270
グリセロールシグマ・アルリッヒG5516
グリシンバイオラッド161-0718
ヘペスシグマ・アルドリッチH3375
ホットプレートスターラーVWRの12365-346
塩酸VWRのBDH3028
イミダゾールゴールドビオI-902-25
イソプロピル-ß-D-チオガラクチオシド(IPTG)ゴールドビオ12481C25
Lemo21(DE3)コンピテント大腸菌細胞ニューイングランドバイオラボC2528J
塩化マンガン(II)四水和物シグマ・アルドリッチM3634
マイクロ遠心チューブ、0.5 mLVWRの87003-290
マイクロ遠心チューブ、1.7 mLMedSupplyパートナー15-1151
マイクロ遠心チューブ、2 mLアクシーゲンMCT-200-C
Mini-PROTEANテトラ縦型電気泳動セルバイオラッド10025025
ミニプロテアントリスグリシンゲル、4-20%バイオラッド4568094
MyFugeミニ遠心分離機MedSupplyパートナーC1008-B
Nalgene 1 L 超高速遠心分離機ボトルサーモフィッシャーサイエンティフィック3141-1006
Nalgeneオークリッジ遠心分離管サーモフィッシャーサイエンティフィック31139-0050
ナノ光度計インプレン3769
揺れないインキュベーターラボネットI 5110 
C41(DE3)化学的コンピテント細胞を過剰発現バイオサーチ技術60442-1
C41(DE3)化学的コンピテント細胞を過剰発現シグマ・アルドリッチCMC0017中止;Biosearch C41(DE3) 細胞または NEB Lemo21 細胞が代替品です
ペトリ皿MedSupplyパートナー62-1077-3
プラスミド(pET-14bバックボーン)ジェンスクリプトカスタムオーダー
プラスチックマイクロキュベットフィッシャーサイエンティフィック14955127
PowerPacユニバーサル電源バイオラッド1645070
精密グライドニードルベクトン・ディクソン305198
Precision plus タンパク質未染色標準試料バイオラッド1610363
発現用回収培地 シグマ・アルドリッチCMR0001K
S-4x1000スイングバケットローターエッペンドルフEP-S4X1
血清ピペット、10 mLファクロン357551
血清ピペット、25 mLファクロン35725
血清ピペット、5 mLファクロン35743
血清ピペット、50 mLPr1maPR-セロ-50
塩化ナトリウムシグマ・アルドリッチS9888
ドデシル硫酸ナトリウムシグマ・アルドリッチL3771
水酸化ナトリウムシグマ・アルドリッチ567530
ソニックディスメンブレーターフィッシャーサイエンティフィックFB505
Sorvall Lynx 4000遠心分離機サーモフィッシャーサイエンティフィック75006580
Spephadex G-25 M PD-10 カラムサイトバ17085101
ß-メルカプトエタノールミリポール444203
ステンレススチール製グリフィンビーカーポーラーウェア13977-010-EA
滅菌ファルコンチューブ、15 mL隼352097
滅菌ファルコンチューブ、50 mL隼352098
Superdex 200 10/300 GL カラムサイトバ28990944
シリンジ、1 mLエアタイト 答え1
シリンジ、3 mLベクトン・ディクソン309657
TALONメタルアフィニティ樹脂タカラ635503
つまようじクリエイティビティ・ストリートPAC3690-01
トリスベースゴールドビオT-400-1
トリトンX-100MPバイオメディカルズ807423
トリプトンResearch Products International(リサーチプロダクツインターナT60065
ヴォルネードベンチマークBV101-G
酵母エキスResearch Products International(リサーチプロダクツインターナ20025年度

参考文献

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