方法論記事

質量分析によるエピジェネティックプロファイリングのための臨床標本からヒストン抽出

DOI：

10.3791/68584

⸱

2025年11月21日

 ,  , 
1Department of Experimental Oncology, IEO, European Institute of Oncology IRCCS, 2Department of Oncology and Hematology-Oncology (DIPO), University of Milan

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルにより、さまざまな臨床サンプルから効率的なヒストン抽出が可能となり、その後の翻訳修飾解析(LC-MS/MS)が可能となります。主要なヒストン修飾の堅牢な検出を促進することで、大規模な臨床コホートにおける包括的なエピジェネティックプロファイリングの貴重なツールとなります。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

広範な実験的証拠は、エピジェネティック機構ががんの発症、進行、再発に果たす役割を支持しています。これらの中でも、ヒストン変異体とその翻訳後修飾(PTM)はクロマチンの組織構造や動態、ゲノムアクセスを調節し、転写、複製、DNA損傷修復などの主要なDNAベースのプロセスにヒストンコードを通じて影響を与えます。ヒストンのPTMパターンの調節異常はがんでよく観察されており、診断および予後バイオマーカーとして機能することが示されたマーカーもあります。したがって、臨床サンプルにおける偏りのない包括的なヒストンPTMプロファイリングを可能にする新しい手法は、腫瘍のエピジェネティックな地形の特徴付けに非常に価値があります。ここでは、臨床サンプルからヒストンを効率的に抽出するためのプロトコルを紹介します。これには、スナップ凍結、最適切断温度(OCT)凍結、ホルマリン固定パラフィン埋め込み生検(FFPE)などが含まれます。このアプローチにより、高性能液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析(LC-MS/MS)によるボトムアップ分析に十分な量と品質のヒストンタンパク質が得られます。このワークフローにより、主要ヒストン修飾、特にリシンアセチル化やメチル化を一次腫瘍サンプル全体で堅牢な検出と定量化が可能となり、がん特性評価のための追加の分子層を提供します。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

真核細胞の核では、ヒストンがDNAと組み合わさってクロマチンの基本的な構造単位であるヌクレオソームを形成します。各ヌクレオソームは約146塩基のDNAが、コアヒストンのH2AとH2Bの2コピー、さらにヒストンのH3およびH4の2ダイマーからなるオクタマーの周りに巻きついています。さらに、リンカーヒストンH1も存在し、ヌクレオソームとリンカーDNAの伸縮を結合させることでクロマチンの高次組織化を促進します。ヒストンは主にN末端の尾部に存在する多様な翻訳後修飾(PTM)によって装飾されています。これらの修飾にはメチル化、さまざまなアチル化(アセチル化、プロピオニル化、ブチル化など)、リン酸化、SUMOイレーション、ユビキティレーション、ADPリボシル化、クロトニー化が含まれ、その中でもリシンおよびアルギニンメチル化およびリシンアセチル化が最も特徴的です。特定のヒストン修飾の種類、位置、組み合わせがヒストンコードとして知られるものを作り出します。このコードは、ヒストンのN末端尾部に付加・除去される様々な翻訳後修飾(PTM)で構成されており、特定のヒストン修飾酵素によって追加・除去されます。これらの修飾はエフェクタータンパク質によって認識され、圧縮や解縮などのクロマチン構造の変化を引き起こし、最終的にはDNA損傷修復、複製、特に遺伝子転写など複数の生物学的プロセスに影響を与えます3,4。

DNAメチル化とヒストンPTMは、がんにおける最も研究されているエピジェネティックな特徴の一つです。最近の実験的証拠では、いくつかのがんタイプにおけるさまざまなヒストンPTMのレベルに変化があることが示されています。特に、H4K20me3およびH4K16acの喪失はがんの特徴として報告されており、これらのレベルは正常組織と比較してほぼすべての腫瘍で低下していることが示されています。私たちのグループは、質量分析(MS)を用いたアプローチを用いて、いくつかのがんにおけるH3K14acの減少を正常がんと比較して定量化し、がんの潜在的な特徴として特定しました。さらに、多くの研究がヒストンPTMの予後価値を強調しており、主に患者生検における免疫組織化学で評価される全体的なレベルの変化が、がんの進行、組織学的グレード、治療反応と相関していることが示されています。したがって、がんサンプルにおけるヒストンPTM解析は、新規の診断および予後バイオマーカーの特定や、いわゆるエピドラッグ8の潜在的な標的を特定する上で重要です。

細胞株および臨床サンプルにおけるヒストンPTMの非常に一般的な分析方法は、免疫ブロッティング、免疫組織化学、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)9などの抗体ベースの技術に依存しています。しかし、抗体ベースの方法は交差反応性や逆にエピトープマスキングなど様々な制限を抱えています。交差反応性は、抗体が類似したエピトープを持つ意図しない標的に結合し、偽陽性の可能性を生じさせることであり、一方エピトープマスキングは、隣接する残基に他の修飾が存在するために特定のエピトープ(ヒストンPTMまたは変異体)を検出できなくなる現象を指します。さらに、抗体を用いたヒストン修飾解析に必要な組織量はしばしば多く、同時に検出できるPTMの数が限られているため、多重解析のために複数の組織スライスを処理する必要があります。質量分析法(MS)は、抗体ベースのアプローチの限界を克服し、ヒストンPTMおよび変異体のプロファイリングに選ばれる方法として台頭しています5,8。MSは、理論的質量と実験的に測定されたペプチドやタンパク質の質量(Δm)の質量差(Δm)の検出に依存しています。これは偏りなく包括的かつ定量的であり、PTMや変異体の特定と定量化を事前に知る必要がない点で特徴的です。このため、MSはヒストンPTMの変化を敏感かつ正確に解析する上で特に価値があります8。

ここでは、臨床サンプルからのヒストン抽出のための最適化プロトコルと、MSベースのヒストンPTMプロファイリング(以降はエピプロテオミクスワークフローと呼ばれる)を組み合わせたものについて説明します。患者の生検は主に新鮮凍結(FF)サンプル、最適切断温度(OCT)凍結サンプル、ホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)サンプルとして保管されます。新鮮生検は保存培地13を加えずに液体窒素または予冷却されたイソペンタンで速凍結されますが、OCT凍結生検は主にポリビニルアルコールとポリエチレングリコールからなる水溶性の低温保護埋め込み培地を含み、組織スライシングを促進します。一方、フォルマリンに固定されパラフィンに埋め込まれたFFPEサンプルは、臨床検体にとって最も一般的な保管方法であり、低温や超低温での高コストなメンテナンスを避けられます。保存添加物がないため、急速凍結生検は直接ヒストン抽出のために処理できますが、OCT凍結およびFFPE生検は埋め込み培地や固定剤の除去の初期段階が必要です。FFPEサンプルはまた、広範なタンパク質の脱架橋および抗原回収も必要です。

本プロトコルは、新鮮凍結、OCT埋め込み、FFPE臨床サンプルからヒストンを抽出する詳細な方法を示し、各サンプル保存に伴う特有の課題(ステップ1)を考慮して、下流のMS分析に必要な十分な量と品質を確保しています。臨床サンプルから精製されたヒストンは、変性条件下でのタンパク質ゲル電気泳動(SDS-PAGE)で分離され、その後誘導化工程を経て酵素分解され、適切な長さ(4〜15アミノ酸)のペプチドを生成します。これはボトムアップ質量分析分析16(ステップ2)用です。より具体的には、ヒストンはArgC様の戦略で消化されます。通常は未修飾リジン(K)とアルギニン(R)のC末端を切断するトリプシンが、未修飾かつモノメチル化リジンがプロピオン無水物(PRO)で化学的にアチル化したため、アルギニンのC末端のみを切断する誘導があります。次に、Arg-C様消化ヒストンペプチドは、N末端の尾部でフェニルイソシアン酸塩(PIC)を加えてアシル化されます。このさらなる誘導化によりペプチド疎水性が高まり、逆相高性能液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)による短いヒストンペプチドの分離がより良くなり、等圧ペプチドフォーム17,18の同定と定量が向上します(ステップ3)。ここで述べた手法は、がんエピジェネティクス研究におけるMSベースのヒストンプロファイリングの力を強調しています。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

フレッシュ凍結およびOCT凍結組織生検は、ミラノの欧州腫瘍研究所で手術を受ける患者からインフォームドコンセントのもと取得され、FFPE生検はカルロ・ベスタ神経学研究所(ミラノ)で手術を受けた患者から取得されました。本研究は欧州腫瘍学会の倫理委員会(研究UID 2550)およびカルロ・ベスタ神経学研究所(研究CET 39/24)によって承認されました。

1. 患者由来組織からのヒストン抽出(図1A)

注:代表的な腫瘍細胞集団からのヒストンを解析し、サンプル間ばらつきを減らすためには、腫瘍細胞濃度が少なくとも50%で、壊死部位や広範な免疫浸潤がない臨床生検を使用することが推奨されます。

  1. 新鮮凍結組織からのヒストン強化(推定期間:60分)
    注意:すべてのステップは氷の上で行わなければなりません。
    1. 組織を氷で解凍し、約20〜30mgの組織を切り取ります。通常は約2 mm3 の組織に相当します。
    2. サンプルを1.5mLのチューブに移し、はさみで組織を小さく細かく刻みます(材料表参照)。
    3. 材料表に記載されたプロテアーゼ阻害剤を新たに補足した核分離バッファー1mL(表1)を追加します。後でよく混ぜてください。
    4. 試料をDounceホモジナイザー(材料表)に移します。
      注意:大きな組織の破片がある場合は、p1000の先端(はさみで先端を切った場合)を使ってサンプルをよりよく採取してください。
    5. まずLOOSEの乳棒、次にTIGHTの乳棒(材料表)を使って、肉眼で組織の断片が見えなくなるまで均質化します。
    6. 均質化されたサンプルを100μmのセルストレーナー(材料表)でろ過し、組織の残骸を除去します。
    7. p200でピペットを激しく上下に動かして細胞膜を溶解し、サンプルを新しい1.5 mLチューブに移します。
    8. 2,300 x g の温度で4°Cのベンチトップ遠心分離機を用いて15分間細胞核をペレット化します(材料表参照)。
    9. 上清液を廃棄し、核ペレットを50〜100μLの核分離バッファーに再懸濁し、0.1%のSDSを補足して核膜を溶解させます(材料表参照)。
    10. 250 Uのベンゾナーゼヌクレアーゼを加えて核酸を分解し、よく混ぜて37°Cで2分間培養します(材料表参照)。
      注意:サンプルがまだ粘性がある場合は、水浴(設定:10分30秒オン/30秒オフ;出力:高、温度:4°C)で超音波検査を行うことも可能です。この工程の後、サンプルは-20°Cで保存できます。
  2. OCTサンプルからのヒストン濃縮(推定時間:90分)
    注:このプロトコルは、20〜60 mgの組織に相当する4〜5本の厚さ10μmのOCT切片に最適化されています。ただし、組織切片の数は臨床生検の種類や総組織面積によって異なります。臨床標本の希少性を考慮すると、初期組織から少量の抽出を行うことも可能ですが、これによりヒストン修飾の検出が低下する可能性があります。
    1. 厚さ10μmの組織切片を4〜5個、約20〜60mgの組織を1.5mLのチューブに入れます。
    2. 切片を1mLの氷で冷たくした70%EtOH(表1参照)で回転ホイール(材料表)で4°Cで2分間洗い流します。
    3. ベンチトップ遠心分離機で16,000 x g 、4°Cで2分間遠心分離機を使います。
    4. ステップ1.2.2と1.2.3を合計3回繰り返します。
    5. 試料を2 °Cの2°Cで回転させて2分間、二重蒸留水1 mL(ddH2O)で再水和します(材料表参照)。
    6. ベンチトップ遠心機で16,000 x g 、4°Cで2分間遠心分離機(材料表)。
    7. ステップ1.2.5と1.2.6を1×PBS(材料表)で2回繰り返します。
    8. 新鮮な冷凍サンプルから濃縮プロトコルのステップ1.1.2に進みます。
  3. FFPEサンプルからのヒストン抽出(推定時間:8時間)
    注:本プロトコルは、約20〜60 mgの組織に相当する4つの厚さ10μmのFFPE切片用に開発されました。ほとんどのMSヒストン修飾解析では、この量は過剰であり、物質が制限されていない場合の安全な出発点となります。しかし、より少ない起始物質を使用することも可能であり、これは臨床検体解析時に利用可能な組織量がしばしば少ないことを考慮すると重要です。起始物質の使用が少なくなることは実現可能ではありますが、低量ヒストン修飾(例:H3K27acや多重メチル化H3K27/K36ペプチド)に対する定量の堅牢性が低下し、この効果は組織の種類やサンプルによって異なる場合があります。それにもかかわらず、我々の研究室はこれまでに、MSベースのヒストンPTMプロファイリングが、1,000細胞に相当する乳がんFFPEサンプルのレーザー微細解剖組織領域から成功裏に実施できることを示しました18.
    1. 厚さ10μmのFFPE切片を4本、約20〜60mgの組織を1.5mLのチューブに入れます。
    2. 試料にパラフィン溶解剤1 mLを加え、最大速度で30秒間ボルテックス(材料表)を繰り返し、パラフィンが完全に溶解するまで続けます。
      注意:パラフィン溶解試薬は変異原性があり発がん性があり、可燃性があるため、化学フードの下で使用する必要があります。
      注:パラフィン溶解は、パラフィンの断片が肉眼で見えなくなり、パラフィン溶解剤が白っぽく均一な色を呈する場合に起こります。
    3. 16,000 x g をベンチトップ遠心分離機で3分間RTし、上清液を捨てます。上清液除去時の望ましくないサンプル吸引を避けるため、真空ポンプ/ピペットはより小さなチップ(例:p200、p10チップ)でキャップを取り付けることができます。
    4. ステップ1.3.2と1.3.3をさらに3回(合計4回)繰り返し、完全にパラフィン除去を確実にします。あるいは、完全に脱炭されたサンプルを計量して、処理された組織量を示す指標を得る方法もあります。
    5. 95%EtOH溶液1 mLを加え(表1)、最大速度で30秒渦を巻いて完全な組織再懸濁を保証します。
    6. 16,000 x g をベンチトップ遠心分離機で3分間RTし、上清液を捨てます。あるいは、乾燥したサンプルを重さで測定し、処理された乾燥組織の量を示す指標として利用してください。
    7. ステップ1.3.5および1.3.6を70%、50%、20%のEtOH(表1)とddH2Oで繰り返し、サンプルを再水和させます。
    8. 抽出バッファー200μLを追加します(表1)。
      注意:大きなティッシュの破片がある場合は、ハサミで小さく切り分けてください。組織の量に応じて、抽出バッファーの量を小さくまたは増やして適切なサンプル溶解を確実にすることができます。特に小さなペレットを100μL未満の抽出バッファーに再懸濁した場合、超音波処理装置(材料表)(30秒オン/30秒オフ出力:高、10サイクル)を用いて行うことができます。
    9. 抽出バッファーで、デジタルソニファイア(材料表)を用いて超音波測定を行い、3mmマイクロチップ(>15サイクル、5秒オン/2分オフ、出力:15-30%)で均質化します。
      注:溶液中に組織粒子が見えず、抽出バッファーが均一で濁っていない色を示す場合、サンプルは適切に均質化されたとみなされます。超音波検査サイクル中はサンプルをRTで保管してください。氷は抽出バッファー内でSDSの沈殿を引き起こし、組織均質化を妨げる可能性があります。適切な超音波検査は、完全な組織溶解とタンパク質抽出を達成するために不可欠です。マイクロチップをサンプルチューブ内の適切な高さに配置してください(チューブの底部に触れてプラスチック粒子を放出してはいけず、空気抽出バッファーの界面にあって泡や泡が出てはいけません)。
    10. 均質化後、サンプルを95°Cで45分間サーモミキサーで培養します。15分ごとにチューブの蓋を開けてホルムアルデヒドを蒸発させます。
    11. 65°Cでサーモミキサーで4時間培養します。20〜60分ごとに蓋を開けてホルムアルデヒドを蒸発させます。
    12. 16,000 x g をベンチトップ遠心分離機でRTで1分間加熱し、上清液を新しいチューブに移します。
      注:この時点でサンプルは-20°Cで保存可能です。

表1:バッファー組成。この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

2. SDS-PAGEおよびゲル内消化によるヒストン分解

  1. SDS-PAGE(図1B;推定時間:2時間)
    1. ヒストンの純度を評価し、その量を推定するために、ヒストン抽出物の1/10を17%ポリアクリルアミドゲル(SDS-PAGE)に投与します。 表1)図 1Bに示されるように、既知の組換えヒストン数とともに。
      注:ヒストン抽出物の1/10をロードする代わりに、ビシンコニン酸(BCA)タンパク質アッセイ19のような高洗剤濃度に耐えるアッセイで測定されるタンパク質15 〜50μgをロードできます。ただし、生冷凍、OCT冷凍、FFPEサンプル間でヒストンの総タンパク質濃度は大きく異なり、ヒストン量の定量はSDS-PAGEのみに基づいていることにご注意ください。1、0.5、0.25 μgの組換えヒストンH3.1(材料表)を基準として搭載し、ヒストン量をより正確に定量化できます。
    2. 試料をリチウムドデシル硫酸塩(LDS)ローディングバッファ、またはSDS-PAGE用の同等ローディングバッファ(例:Laemmliバッファ)と混合し、ジチオスレイトール(DTT)を加えます。 材料表)最終濃度は10 mM。
    3. 変性サンプルを95°Cで5分間、サーモミキサーで行います。
    4. SDS-PAGE上でタンパク質分離後、クーマッシー染色法(材料表)でゲルを染色します。
    5. 臨床サンプル中のヒストンバンドの20 の視覚的またはソフトウェア支援による定量化を用いて、既知量で充填された組換えヒストンH3と比較してヒストン収量を推定します。
  2. ヒストンゲル中の消化(図2;推定期間:2日間)
    注:ArgC様消化は、標準的なトリプシン消化がリジンおよびアルギニンのアミノ酸の頻度が高いため、ペプチドの生成が非常に短いため、MSのペプチド検出やPTM同定を妨げるため、MS解析に用いられます。化学的にリジンを修飾することで、これらの部位でのトリプティック切断が防げ、アルギニンのC末端のみでの切断が起こり、配列内に修飾リジンを含むより長いペプチド(4〜15アミノ酸)が生成されます。全体として、このプロトコルはMSによる修飾ヒストンペプチドの検出と測定を促進し、多数の論文で詳細に説明されています8,17,21.
    オプション:内部標準(例:重標識スパイクイン、合成標識ペプチド22)はヒストンサンプルと1:1の比率で混合することで、MS内でより正確なペプチド定量を得ることができます(図2B).
    1. Step 2.1.5(図2B)で行われた推定ヒストン定量に基づき、17%ポリアクリルアミドゲルに3〜5μgのヒストンサンプルを投与します。
    2. SDS-PAGEの後、ゲルにクーマッシー染色法を施してタンパク質を可視化します。
      注意:LC-MS/MS分析に干渉する可能性のある汚染を防ぐためには、ケラチンが強いMS汚染物質であるため、専用のフードなどケラチンフリー環境で以下の手順を行うことが推奨されます。
    3. コアヒストンタンパク質の分子量に対応するゲルバンド(10 kDaから18 kDaのゲルバンド、各コアヒストンの分子量を考慮します:H3は約17 kDa、H2A-H2Bは約14 kDa、H4は約11 kDa)をメス(材料表)で使用し、約1 mm3 の単位に分割します。
    4. メスを使って、ゲルの断片を1.5mLのチューブに移します。
      注意:ゲル断片を完全に覆うには、以下の体積を増やしつつ試薬の化学量論を維持します。
    5. ゲル片を脱染するために、50%アセトニトリル(ACN)溶液をddH2Oに加えて除去します(表1参照)。サーモミキサーを1,400rpmで設定し、10分間RTし、その後上澄液を捨てます。
    6. ステップ2.2.5を繰り返し、ジェルの断片が完全に脱色するまで繰り返します。
    7. ジェルの断片は100%ACNを加えて脱水します(材料表参照)。1,400rpmで10分間RTで混合し、その後上澄液を捨てます。
    8. ステップ2.2.7を繰り返し、ジェル片が白く硬くなり、完全に脱水状態になるまで続けます。
    9. ゲル片を真空遠心分離機でRTで5分間乾燥させます(材料表参照)。
      注:システイン中のヒストンは少なく(ヒストンH3の位置96および110に2つのシステインのみ(UniprotKB ID P68431)、ヒストンH2Bの位置154にシステインが1つ(UniprotKB ID B4DR52)のみ)。さらに、これらのシステインはボトムアップ型MSでArgC様消化では検出されないペプチド内に存在するため、チオール基23 の化学的付加体はMSヒストンの解析でアーティファクトではなく、記載されたプロトコルではシステイン還元やアルキル化のステップは行われません。
    10. 各チューブに7.7 Mのプロピオン無水(PRO)溶液15 μL(材料表)と1 Mの炭酸水素アンモニウム(AmBic)(材料表)26 μLを加え、350 rpmのサーモミキサーで37°Cで10分間培養します。
      注意:反応性バッファーに溶けた無水物は蒸発しやすいため、PROとAmBicのマスターミックスを準備せず、各サンプルに個別に加えて各チューブ内の適切なPRO濃度を一定に保ってください。
    11. ゲル片を1MのAmBic(推奨容量:80 μL)を加えて完全に覆い、37°Cで1,400 rpmで4時間混合してサーモミキサーで培養します。その後、液体をすべて取り除いてください。
      注:1MのAmVicは、未修飾およびモノメチル化リジンのプロピオニル化触媒として理想的である塩基pHを維持するために添加されます。
    12. ddH2Oで3回洗浄し、その間にサンプルをRTで10分間孵育し、1,400rpmのサーモミキサーで混合します。洗車後は液体を捨てます。
    13. 50%ACNを加え、1,400rpmのサーモミキサーで15分間RTで培養します。その後、液体は捨ててください。
    14. ジェル断片を完全に脱水させ、100%ACNを加えて1,400rpmで15分間RTでサーモミキサーで培養します。その後、液体は捨ててください。
    15. ステップ2.2.14を繰り返し、ジェル片が白く乾くまで繰り返します。
    16. 真空遠心分離機でRTで5分間乾燥ゲルを塗ります。
    17. 各サンプルにトリプシン溶液4μL(表1)と消化バッファー20μL(表1)を加え、氷で10分間培養してトリプシンをゲル状に吸収させます。
      注:このインキュベーションは、濃縮トリプシン溶液と消化バッファー(50 mM AmIc in ddH2O)を用いて行われ、トリプシン切断に適した基本的なpHを作り出します。これにより、酵素が活性化される前にゲル片に吸収され、37°Cでの活性化が可能となります。
    18. 濃縮トリプシンが完全に吸収されたら、ゲル片を追加の消化バッファー(表示容量:80 μL)で十分に覆い、37°Cで一晩サーモミキサーで培養します。
    19. ゲル片から消化ペプチドを抽出するには、100% ACNを100μL加え、サーモミキサーでRTで1,400rpmで20分間培養します。
    20. 上澄液を採取し、新しい1.5mLチューブに移します。
    21. ゲル片に100% ACNを80μL加え、1,400rpmで10分間サーモミキサーで培養します。
    22. 上澄液を収集し、ステップ2.2.20で採取したものとプールし、その後、真空遠心分離機で1〜5μLの容量までペプチドを濃縮します。
      注:真空遠心分離機を使用することで有機溶媒(ACN)の蒸発が可能になります。ただし、この段階で試料を完全に乾燥させることは推奨されません。これは次の誘導化ステップに悪影響を及ぼす可能性があるためです。サンプルが乾燥したら、ddH2Oの水に再懸浮させ、水浴で5分間超音波処理を行います。
    23. 各試料にddH2Oを加え、最終体積15 μLにし、次に1 μLのトリエチルアンモニウム重炭酸イオン2 μL(材料表)とフェニルイソシアン酸イオン(PIC)溶液3 μL(表1)を加え、350 rpmで37°Cの温度で90分間培養します。
      注意:PICは変異原性かつ発がん性があるため、化学的なフードの下で取り扱うことが推奨されます。PICは非常に反応性が高く揮発性が高いため、トリエチルアンモニウム重炭酸塩とPICのマスターミックスの調製は避けることが推奨されますが、正確なPIC濃度を確保するために各試薬を個別に添加することが推奨されます。
    24. 各チューブに1%トリフルオロ酢酸(TFA)8μLを加えます。 材料表)PICによる派生化を止めるために。
    25. 各サンプルをバッファーA100μLで希釈し、C18ステージのチップ(24で説明した方法で調製するか、異なる供給者から購入)に積み込みます。
    26. サンプルを2,100 x g でスイングローター遠心分離機で4°Cで10分間回し、ヒストンペプチドがC18樹脂に結合できるようにします。
      注意:サンプルはステージチップに4°Cで数ヶ月間保管可能です。
    27. C18ステージチップに30μLの洗脱バッファー(表1)を加え、新しい1.5mLチューブにチップを挿入します。1,000 x g で4°Cのベンチトップ遠心分離機で10分間スピンしてヒストンペプチドを溶出します。
    28. 真空遠心分離機を使ってサンプルを1〜3μLの体積まで濃縮し、その後1%のTFAを加えて最終体積6μLにします。
    29. MS分析のために96ウェルマイクロプレートに5μLのペプチド溶液を注入し、密封マットで密封します(材料表)。

3. HPLC-MS/MSおよびデータ解析(図3)

注:ここに記載されたパラメータは、EASYスプレーカラムを介してQ Exactive Plusオービトラップ質量分析計に接続されたESAY-nLC 1200液体クロマトグラフィーシステム(材料表)に適していますが、類似または同等の機器もアドホックパラメータで使用可能です。

  1. HPLC-MS/MS(推定時間:サンプルあたり90分)
    1. ステップ2.2.29の5μLヒストンペプチドのうち3μL(SDS-PAGEによるヒストン定量に基づく約0.25〜0.8μgに相当)を、バッファーAで500 nl/minの一定流量でC18ナノカラム(材料表)に注入します。
    2. 10%〜45%バッファBを250 nL/minの流量で55分ごとに線形勾配でペプチドを分離します。
    3. データ依存モード(DDA)でMS/MSデータを取得し、専用ソフトウェアパッケージ(Table of Materials)を使ってMS1とMS2を自動で切り替えます。
      注:取得および一般的な設定については 表2を参照してください。
  2. RAW MSデータ解析
    注:本プロトコルでは、ヒストンPTMの定量はEpiProfileを用いて行われます。EpiProfileはオープンスクリプト(https://github.com/zfyuan/EpiProfile2.0_Family)で、ユーザーフレンドリーで、H3およびH4リジンメチル化およびアセチル化の標準解析に適しています。しかし、EpiProfileはより標準的な改変や異なるサンプル調製プロトコルの分析を、より経験豊富なユーザーがカスタマイズして実施可能です。なお、EpiProfileは25番の運用にMATLABライセンスが必要です。
    1. 取得したRAWデータをEpiProfile 2.0ソフトウェア(PRO-PIC版)25 (材料表)で解析し、ラベルフリー解析時のオプション histone_normal、SUPER-SILACスパイクインを用いた時の histone_SILACオプションを選択してヒストンペプチドを定量します。ndebug = 0 を設定します。
    2. 各ヒストンペプチド(例:H3_3-8)に対して、EpiProfileで計算した抽出イオンクロマトグラム(XIC)をそのペプチドの全XICの合計で割ることで、各修飾ペプチドフォーム(例:H3_3-8 unmod、me1、me2、me3)の相対存在比(%RA)を計算します。
      注意:オプションとして、EpiProfileで計算されたXICは、18,26に記載された専用スペクトルレイアウトを用いたMSスペクトルの検査およびヒストンペプチドの手動定量によって検証可能です。
    3. 各ペプチドフォームについて、各ネイティブライトペプチドの%RAを、各サンプルにスパイクしたSUPER-SILACミックス由来の対応する重ペプチドの%RAで割って、軽い対重(L/H)比を計算します。
    4. L/H比を対数スケールに変換します。サンプル間でペプチドフォームの存在比の有意な違いを強調するために、統計解析を行い、すべてのサンプルのL/H比をヒートマップや散布図として視覚的に示すことができます( 図4参照)。

表2:このプロトコルで使用されるシステムでLC-MS/MSに用いられている取得設定および一般設定の一覧。この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

前述のプロトコルに従い、新鮮凍結およびOCT凍結乳がんサンプル、FFPE髄膜腫サンプルからヒストン抽出を実施しました。 図1Aに示すように、凍結試料の場合OCTを除去し、軟度洗剤(0.1%トリトンステップ1.1)を含む核分離バッファーで均質化して核の分離を可能にしました。次に、0.1%のSDSを加えたヒストンを抽出しました。代わりに、FFPE試料ではパラフィン除去、再水和、架橋脱連結を行い、非常に変性の激しい条件下でタンパク質を抽出しました(抽出バッファーには2%のSDS;ステップ1.3)。ヒストンの量と品質を評価するため、乳がんの新鮮凍結およびOCT凍結サンプル2件の核抽出物の1/10、髄膜腫FFPEサンプル2件分の全タンパク質抽出物の1/10を17%ポリアクリルアミドSDS-PAGEゲルにロードし分離し、ローディング基準として1、0.5、0.25μgの組換えヒストンH3.1を用いました(図1B)。

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここで説明する方法は、新鮮凍結、OCT凍結、FFPE生検として保存された臨床サンプルからヒストンを効率的に分離し、MS分析による修飾地形のプロファイリングを行うシンプルかつ堅牢なワークフローを提供します。SDS-PAGE分離およびトリプシンを用いたPRO-PICゲル内消化によるサンプル準備プロトコルにより、洗剤、塩類、その他のMS汚染物質の効果的な除去が保証され、ヒストンのリジンアセチル化およびメチル化の正確かつ堅牢な定量が達成されます。重要なのは、フェニルイソシアネート(PIC)によるN末端誘導化により、H4_20-23ペプチドやH3_3-8ペプチド17などの短いヒストンペプチドのMS検出が改善され、リシンホルミル化、クロトニ化、スクシニル化、マロニ化、ヒドロキシイソブチリル化、グルタリ化、ラクチル化などのまれなアシル化の解析にも利用可能です34.ここでは、ヒストンH3およびH46

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者たちは利益相反を一切認めていない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

欧州腫瘍研究所および神経学研究所のカルロ・ベスタ医師の皆様に、FF、OCT凍結、FFPE組織生検を提供していただき感謝いたします。原稿準備中の科学的・方法論的議論と資金提供に感謝します:PRIN2022(CUPG53D23001530006年)、AIRC(助成番号IG-2023-28767)、およびIEO-モンツィーノ基金(FIEORDT-2023-BONALDI)です。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
<ストロング>ケミカルズ
組織学のためのHistolemon RSカルロ・エルバ4549122.5L
アセトニトリル(ACN)カルロ・エルバ4123411年生
重炭酸アンモニウム(AmBic)シグマ・オルドリッチA6141500 g
過硫酸アンモニウム(APS)WDR1.012.010.500500 g
アプロチニンプロテアーゼ阻害剤シグマ・オルドリッチ A11535mg
ベンゾナーゼヌクレアーゼメルクE101425 KU
ビサクリルアミド 30% 37.5 MAppliChemAPA362610001 L
バッファーAはddH2Oに0.1%の蟻酸を含んでいますサーモフィッシャー・サイエンティフィック10229884500 mL  
バッファーBは0.1%蟻酸/80%アセトニトリルをddH2Oに含めていますサーモフィッシャー・サイエンティフィック15431423500 mL
C18樹脂メルク66883-U直径47mmです
クーマッシー・インスタントブルーアブカムAB1192111 L
ディチオトレイトール(DTT) WDR441496P25 g
エタノールカルロ・エルバ4146082.5L
Leupeptin プロテアーゼ阻害剤シグマ・オルドリッチ L85115mg
N,N,N′,N′-テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)シグマ・オルドリッチ1.107.320100100 mL
NuPAGE LDSサンプルバッファインビトロジェンNP00074倍
PBS - リン酸塩緩衝塩水 マイクロジェムTL1006500 mL
フェニル・イソシアネート(PIC)シグマ・オルドリッチ185353100 g
フェニルメチルスルフォニルフッ化物(PMSF)プロテアーゼ阻害剤シグマ・オルドリッチ P76261 g
プロピオン無水物(PRO)シグマ・オルドリッチ24031150 g
組換えヒストーンH3.1ヒトニューイングランド・バイオラボM25031 & micro;g/µL
シーケンシンググレードトリプシンプロメガV5113100 ug
ナトリウムブチル酸ナトリウム(NaBut)ヒストン脱エセタリアゼ阻害剤メルクB58875 g
ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)シグマ・オルドリッチL3771100 g
トリエチルアンモニウム重炭酸塩シグマ・オルドリッチT7408100 mL
トリフルオロアセチン酸(TFA)サーモフィッシャー・サイエンティフィック289041×10mL
トリスHClシグマ・オルドリッチT3253100 g
トリトンX-100洗剤シグマ・オルドリッチ X100RS5 g
キット/機器/ソフトウェア
96ウェルマイクロプレートコーニングPCR-96-FS-C発熱性がなく、RNASE/DNASEフリー
秤カーン19024
ベンチトップ遠心分離機ハレウス・バイオフュージ研究所ピコ、23396
バイオラプター超音波装置ディアゲノード
ブランソン・デジタルソニファイア250エマーソン
セルストレーナー100とマイクロ;m隼352360
コンセントレータープラスエッペンドルフ5305000509
ドゥンスホモジナイザー(例:g ドゥンス、ウィートン...)ドーンス、ウィートン1 mL ティッシュグラインダー
EASY-nLC 1200 液体クロマトグラフィーサーモフィッシャー・サイエンティフィック
EASY-Spray HPLC C18カラムサーモフィッシャー・サイエンティフィックES9022 & micro;m、100 & Aring;, 75 & micro;m x 25 cm
EpiProfile2.0スクリプトhttps://github.com/zfyuan/EpiProfile2.0_Family
フィジーソフトウェアhttps://imagej.net/software/fiji/downloads
MATLABhttps://www.mathworks.com
MaxQuant検索エンジンhttps://maxquant.net/maxquant/
ペステルA(緩和)ドーンス、ウィートン
ペステルB(タイト)ドーンス、ウィートン
Q Exactive Plus Orbitrap LC-MS/MS システムサーモフィッシャー・サイエンティフィック
回転車輪サーモフィッシャー・サイエンティフィック11496548
メスキアト13010
鋏サーモフィッシャー・サイエンティフィック15207266
シーリングマットコーニングAM-96-PCR-RD自動化互換
スイングアウトローター遠心分離機ベックマン・カウルターアレグラX-15R
サーモミキサーコンパクトエッペンドルフ5350
渦動PBIバイブロミックス
Xcaliburソフトウェアサーモフィッシャー・サイエンティフィックOPTON-30965

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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